Name: Vaccinia Virus Infection and Temporal Analysis des Virus Gene Expression: Teil 2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Erfahren Sie die Synthese von cDNA aus RNA aus HeLa-Zellen nach Vaccinia-Virus-Infektion. Dieses Protokoll zeigt die Amplifizierung viraler RNA mittels reverser Transkription und in-vitro-Transkription für Microarray-Analysen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Whitehead Institute Fellows Funds

Teil 1: cDNA-Synthese aus RNA <ol><li> Vor der Verwendung der Ambion Amino Allyl MessageAmp II Kit, fügen Sie die empfohlene Menge von 100% Ethanol zu dem Waschpuffer. </li><li> In PCR-Gefäß, fügen Sie zwischen 100 ng bis 5μg Gesamt-RNA und 1μl der T7-Oligo (dT)-Primer. Bringen Sie die Lautstärke von bis zu 12μl mit Nuklease-freiem Wasser. </li><li> Inkubieren Proben bei 70 ° C für 10 min in einem Thermocycler. </li><li> Entfernen RNA-Proben von 70 ° C und kurz zentrifugieren. Auf Eis legen. </li><li> Bereiten Sie die 1. Strand Synthesis Master-Mix und halten bei Raumtemperatur (mit 10% Überschuss zum Pipettieren Fehler). (Tabelle 1) </li><li> Gently Pipette Master Mix-oder Springmesser, zu mischen, und dann kurz zentrifugieren. </li><li> Transfer 8μl des Master Mix zu jeder RNA-Probe. Mix von Auf-und Abpipettieren 3-4 mal. </li><li> Inkubation bei 42 ° C für 2 Stunden in Thermocycler. </li><li> Centrifuge Proben kurz auf Eis stellen. Unmittelbar mit dem nächsten Schritt der dsDNA Synthese fort. </li><li> Bereiten Sie die 2 nd Strand Synthesis Master-Mix auf Eis (mit 10% Überschuss zum Pipettieren Fehler). (Tabelle 2) </li><li> Gently Pipette Master Mix-oder Springmesser, zu mischen, und dann kurz zentrifugieren. </li><li> Transfer-80μl jeder Probe und sanft durch Auf-und Abpipettieren 3-4 mal zu mischen. </li><li> Inkubation bei 16 ° C für 2 Stunden in Thermocycler. </li><li> Nach dem 2 Stunden Inkubation mit der cDNA clean-up Schritt fort oder einfrieren sofort bei -20 ° C. </li></ol> Teil 2: Double-cDNA clean-up <ol><li> Entfernen Sie die cDNA pur aus dem Kühlschrank und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur für 30 Minuten vor dem Einsatz ausgleichen. Schütteln Sie die Flasche voll resuspendieren der magnetischen cDNA verbindliche Perlen vor der Verwendung. </li><li> Aliquot Nuklease-freiem Wasser in ein 1,5 ml Röhrchen und inkubieren bei 50-60 ° C für mindestens 10 Minuten während der letzten 2 Std. Inkubation. </li><li> Fügen Sie 180μl der cDNA pur zu jeder Probe und gründlich durch Auf-und Abpipettieren mischen. Übertragen Sie die Proben auf eine 96-Well-Rundboden-Platte. </li><li> Weiter zu den Proben durch leichtes Schütteln der Platte auf einem Schüttler für mindestens 2 Minuten mischen. </li><li> Bewegen Sie die Platte zu einem magnetischen stehen, um die magnetischen Kügelchen zu erfassen. Lassen Platte auf den Ständer für ca. 6 Minuten, oder bis die Mischung wird transparent und die Bindung Perlen haben pelletiert. </li><li> Vorsichtig absaugen der Überstand mit einem Vakuum-Sauger, ohne die magnetischen Kügelchen. Alternativ vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und den Überstand verwerfen. </li><li> Die Platte aus dem magnetischen stehen. </li><li> Add 150 &amp;mgr; l cDNA Waschpuffer in jede Kavität der Platte für 1 Minute auf dem Schüttler bei mäßiger Geschwindigkeit. Perlen werden zu diesem Schritt zu zerstreuen, wegen der niedrigen Oberflächenspannung des Waschpuffer. </li><li> Bewegen Sie die Platte zu einem magnetischen stehen, um die magnetischen Kügelchen zu erfassen. </li><li> Vorsichtig absaugen der Überstand mit einem Vakuum-Sauger, ohne die magnetischen Kügelchen. Alternativ vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und den Überstand verwerfen. </li><li> Die Platte aus dem magnetischen stehen. </li><li> Wiederholen Sie die Wäsche ein 2. Mal mit 150 &amp;mgr; l cDNA-Waschpuffer. </li><li> Nach dem 2. waschen, trocknen die Kügelchen durch Schütteln der Platte für 2 Minuten auf dem Schüttler bei maximaler Geschwindigkeit. Nicht übertrocknen! </li><li> Eluieren der cDNA von den Perlen, indem 18μl der vorgewärmten Nuklease-freies Wasser zu jeder Probe. </li><li> Kräftig schütteln, die Platte für 3 Minuten auf dem Schüttler, dann überprüfen Sie, ob die magnetischen Beads vollständig verteilt sind. Wenn nicht, weiter zittern. </li><li> Nachdem die magnetischen Beads vollständig zerstreut haben, bewegen Sie die Platte zu einem magnetischen stehen, um die magnetischen Kügelchen zu erfassen. </li><li> Sorgfältig Übertragung der eluierten cDNA (~ 16μl) in ein neues PCR-Platte (oder PCR-Röhrchen). </li><li> Gehen Sie direkt zum nächsten Schritt, oder frieren die cDNA bei -20 ° C. </li></ol> Teil 3: In-vitro-Transkription (IVT) <ol><li> Bereiten Sie das IVT Master-Mix bei Raumtemperatur. (Tabelle 3) </li><li> Gently Pipette die Master Mix-oder Springmesser, zu mischen und kurz zentrifugieren. </li><li> Add 24μl jeder Probe und sanft durch Auf-und Abpipettieren 3-4 mal zu mischen. </li><li> Bei 37 ° C für 14 Stunden in einem Thermocycler, dann bei 4 ° C bis bereit für den nächsten Schritt zu halten. </li></ol> Teil 4: aRNA clean-up nach IVT <ol><li> Vortex die RNA-Bindung Perlen kurz, um eine gleichmäßige Mischung vor Gebrauch zu erhalten. </li><li> Bereiten Sie die aRNA Binding Mix bei Raumtemperatur (Tabelle 4) Das vor der Zeit getan werden kann -. Die vorbereitete verbindliche Mischung kann bei Raumtemperatur gelagert werden bis zu einer Woche. </li><li> Gut mischen durch Vortexen. </li><li> Aliquot der aRNA Elutionspuffer in ein 1,5 ml Röhrchen und inkubieren bei 50-60 ° C für mindestens 10 Minuten. </li><li> Fügen Sie 70μl der aRNA verbindliche Mixzu jeder Probe und mischen Sie gut durch Auf-und Abpipettieren 3-4 mal. </li><li> Übertragen Sie die Proben aus der PCR-Platte, eine 96-Well-Rundboden-Platte. </li><li> Add 50 ul 100% Isopropanol zu jeder Probe und mischen Sie gut durch Auf-und Abpipettieren 3-4 mal. </li><li> Schütteln Sie die Platte auf einem Schüttler für mindestens 2 Minuten gründlich mischen der Proben. </li><li> Bewegen Sie die Platte zu einem magnetischen stehen, um die magnetischen Kügelchen zu erfassen. Lassen Sie die Platte auf dem Stand, bis die Mischung wird transparent und die Bindung Perlen haben pelletiert. </li><li> Vorsichtig absaugen der Überstand mit einem Vakuum-Sauger, ohne die magnetischen Kügelchen. Alternativ vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und den Überstand verwerfen. </li><li> Die Platte aus dem magnetischen stehen. </li><li> Add 100 &amp;mgr; aRNA Waschlösung in jede Kavität der Platte für 1 Minute auf dem Schüttler bei mäßiger Geschwindigkeit. Perlen können nicht vollständig in diesem Schritt zu zerstreuen. </li><li> Bewegen Sie die Platte zu einem magnetischen stehen, um die magnetischen Kügelchen zu erfassen. </li><li> Vorsichtig absaugen der Überstand mit einem Vakuum-Sauger, ohne die magnetischen Kügelchen. Alternativ vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und den Überstand verwerfen. </li><li> Die Platte aus dem magnetischen stehen. </li><li> Wiederholen Sie die Wäsche ein 2. Mal mit 100 &amp;mgr; aRNA Waschlösung. </li><li> Nach dem 2. waschen, trocknen die Kügelchen durch Schütteln der Platte für 1 Minute auf dem Schüttler bei maximaler Geschwindigkeit. Nicht übertrocknen Proben! </li><li> Eluieren aRNA von den Perlen, indem 40 ul vorgewärmte aRNA Elutionspuffer zu jeder Probe. </li><li> Kräftig schütteln, die Platte auf dem Schüttler für 3 Minuten, dann überprüfen Sie, ob die magnetischen Beads vollständig verteilt sind. Wenn nicht, weiter zittern. </li><li> Nachdem die magnetischen Beads vollständig zerstreut haben, bewegen Sie die Platte zu einem magnetischen stehen, um die magnetischen Kügelchen zu erfassen. Der Überstand enthält das gereinigte-up Amino-allyl eingebaut aRNA. </li><li> Sorgfältig Übertragung der eluierten aRNA einen neuen PCR-Platte (oder PCR-Röhrchen). </li><li> (Optionaler Schritt) Überprüfen Sie die RNA-Konzentration der Proben durch die Messung 1.5μl auf einem NanoDrop Spektralphotometer. </li><li> Unmittelbar auf den nächsten Schritt fort, oder lagern Sie das aRNA bei -80 ° C. </li></ol> Tabelle 1: cDNA 1 M. Strand Synthesis Master Mix <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Betrag für 1-Reaktion </td></tr><tr><td> 10X First Strand Buffer </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Ribonuclease Inhibitor </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Array Script </td><td> 1 ul </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: cDNA 2. Strand Synthesis Master Mix <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Betrag für 1-Reaktion </td></tr><tr><td> Nuclease freies Wasser </td><td> 63 ul </td></tr><tr><td> 10X Zweiten Strand Buffer </td><td> 10 pl </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> DNA Polymerase </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> RNase H </td><td> 1 ul </td></tr></tbody></table> Tabelle 3: IVT Master Mix <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Betrag für 1-Reaktion </td></tr><tr><td> aaUTP-Lösung (75 mM) </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> ATP, CTP, GTP-Mix (25 mM) </td><td> 12 ul </td></tr><tr><td> T7 UTP-Lösung (75 mM) </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> T7 10X Reaktionspuffer </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> T7-Enzym-Mix </td><td> 4 ul </td></tr></tbody></table> Tabelle 4: aRNA Binding Mix <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Betrag für 1-Reaktion </td></tr><tr><td> RNA Binding Perlen * </td><td> 10 pl </td></tr><tr><td> Bead Resuspension Solution * </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> 100% Isopropanol ** </td><td> 6 ul </td></tr><tr><td> aRNA Binding Buffer Concentrate </td><td> 50 pl </td></tr></tbody></table> * Mix der RNA-Bindung Perlen mit der Raupe Resuspension Lösung zuerst. ** Fügen Sie das Isopropanol und gut mischen, bevor Sie die aRNA Bindungspuffer konzentrieren.

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Kritische Schritte Eine zweite Runde der Amplifikation wird nicht empfohlen, da Verzerrungen in Array-Daten beobachtet wurden. Mischen sorgfältig an jedem enzymatischen Schritt (1 st und 2 nd cDNA-Synthese, IVT) ist entscheidend für die Erzielung einer guten Verstärkung liefert, wie die Inkubation von jedem enzymatischen Schritt bei der entsprechenden Temperatur. Ein PCR-Cycler mit verstellbaren beheizten Deckel wird bevorzugt - auch Abweichungen so klein wie 2-3 Grad wäh...

<table><tbody><tr><td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA-Amplifizierungs-Kit</td><td>Reagenz</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1753</td><td>Für 20 Reaktionen</td></tr><tr><td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA-Amplifizierungs-Kit</td><td>Reagenz</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1821</td><td>Für 100 Reaktionen, im 96-Loch-Format</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 UV-VIS-Spektrophotometer</td><td>Sonstiges</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>Oder gleichwertiges Spektrophotometer</td></tr></tbody></table>

vaccinia virus infection &amp; temporal analysis des virus gene expression: teil 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

Die Familie<em&gt; Poxviridae</em&gt; Besteht aus großen doppelsträngigen DNA-Viren enthalten, die ausschließlich im Zytoplasma der infizierten Zellen replizieren. Die Mitglieder des<em&gt; Orthopox</em&gt; Gattung gehören Variola, dem Erreger der menschlichen Pocken, Affenpocken und Vaccinia (VAC), der prototypische Mitglied der Virus-Familie. Innerhalb der relativ groß (~ 200 kb) Vaccinia-Genom gibt drei Klassen von Genen kodiert: frühe, mittlere und spät. Während alle drei Klassen von viral-kodierten RNA-Polymerasen transkribiert werden, dient jede Klasse eine andere Funktion im Lebenszyklus des Virus. Pockenviren nutzen mehrere Strategien zur Modulation der zellulären Umgebung Host während der Infektion. Um Regulierung der Wirt und Virus Genexpression verstehen, müssen wir genomweite Ansätze genutzt werden, um Transkript Fülle von beiden Viren und Wirtszellen zu analysieren. Hier zeigen wir, zeitlicher Verlauf Infektionen von HeLa-Zellen mit Vaccinia-Virus und Sampling-RNA zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion. Beide Gastgeber und virale RNA isoliert und verstärkt für die Hybridisierung an Microarrays zur Analyse der Genexpression.

Protokoll zur Vaccinia-Infektion von HeLa-Zellen und die Analyse von Host-und virale Genexpression.

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis des Virus Gene Expression: Teil 2

Die Familie der Poxviridae besteht aus großen, doppelsträngiger DNA enthaltenden Viren, die sich ausschließlich im Zytoplasma infizierter Zellen replizieren. Mitglieder von ...

Hallo, ich bin Judy Yen aus dem Labor von Kate Rubins am Whitehead Institute for Biomedical Research. Nach der Infektion von Hela-Zellen mit Vaccinia-Virus und der Isolierung der gesamten RNA, wie in einem früheren JoVE-Videoprotokoll gezeigt, kann die virale RNA isoliert und mittels reverser und in-vitro-Transkription amplifiziert werden. Die amplifizierte RNA wird anschließend in der Mikroarray-Analyse der viralen und der Wirtsgenexpression verwendet. Beginnen wir also.Um diese c cd NA-Synthese aus der RNA zu beginnen, geben Sie vor der Verwendung des Ambient Amino Allele Message AMP two-Kit in einem PCR-Reaktionsgefäß das empfohlene Volumen hundertprozentigen Ethanol zu den Waschpuffern hinzu, fügen Sie 100 Nanogramm bis fünf Mikrogramm gesamte RNA und ein Mikroliter T-sieben-Oligoprimer hinzu. Stellen Sie das Volumen mit nukleasefreiem Wasser auf 12 Mikroliter ein. Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 70 Grad Celsius in einem Thermocycler.Als Nächstes entnehmen Sie die RNA-Proben aus dem 70 Grad Celsius heißen Zentrifugen. Kurz nach der Zentrifugation stellen Sie die Proben auf Eis. Bereiten Sie die Master-Mix-Lösung für die Synthese des ersten Strangs mit einem 10-%igen Volumenüberschuss vor, um Pipettierfehler auszugleichen.Lassen Sie es bei Raumtemperatur, pipettieren Sie vorsichtig die Master-Mix-Lösung oder schwenken Sie leicht, um zu mischen, und zentrifugieren Sie danach kurz. Nach der Zentrifugation übertragen Sie acht Mikroliter der Master-Mix-Lösung auf jede RNA-Probe, mischen durch dreimaliges bis viermaliges Auf- und Abpipettieren und inkubieren zwei Stunden bei 42 Grad Celsius im Thermocycler. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Proben kurz und stellen sie sofort auf Eis. Fahren Sie unmittelbar mit dem nächsten Schritt der dSDA-Synthese fort.Bereiten Sie die Master-Mix für die Synthese des zweiten Strangs auf Eis mit einem Überschuss von 10 % des Volumens zur Kompensation von Pipettierfehlern vor; pipettieren Sie den Master-Mix vorsichtig oder geben Sie ihn durch leichtes Klopfen des Gefäßes frei und zentrifugieren Sie danach kurz. Überführen Sie 80 Mikroliter in jede Probe und mischen Sie vorsichtig durch dreimaliges bis viermaliges Auf- und Abpipettieren. Inkubieren Sie zwei Stunden bei 16 Grad Celsius im Thermocycler.Nach der zweistündigen Inkubation fortfahren mit der cDNA-Reinigung oder sofort bei minus 20 Grad Celsius einfrieren. Um mit der Reinigung doppelsträngiger cDNA zu beginnen, entnehmen Sie zunächst die cDNA-Reinigungslösung aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie vor der Verwendung 30 Minuten lang auf Raumtemperatur einklimatisieren. Schütteln Sie die Flasche, um die magnetischen cDNA-Bindungsperlen vor der Verwendung vollständig zu resuspendieren. Portionieren Sie nukleasefreies Wasser in eine 1,5-Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie es für mindestens 10 Minuten bei 50 bis 60 Grad Celsius.Während der vorherigen zweistündigen Inkubation 180 Mikroliter CD NA pure zu jeder Probe hinzufügen und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gründlich mischen. Die Proben in eine 96-Well-Rundbodenplatte überführen. Nachdem die Proben in die Platte überführt wurden, die Proben weiterhin durch vorsichtiges Schütteln der Platte auf einem Rotationsschüttler für mindestens zwei Minuten mischen.Stellen Sie die Platte auf einen Magnethalter, um die magnetischen Perlen zu fixieren. Lassen Sie die Platte etwa sechs Minuten auf dem Halter stehen oder bis die Mischung klar wird und sich die Bindungsperlen abgesetzt haben. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einem Vakuum-Aspirator, ohne die magnetischen Perlen zu stören.Alternativ den Überstand vorsichtig mit einer Pipette entfernen und verwerfen. Nachdem der Überstand verworfen wurde, die Platte vom Magneten nehmen. Anschließend 150 Mikroliter cDNA-Waschpuffer in jedes Loch geben und die Platte eine Minute lang auf dem Rüttler mit mittlerer Geschwindigkeit schütteln.Die Kügelchen verteilen sich in diesem Schritt aufgrund der geringen Oberflächenspannung des Waschpuffers nicht. Nach dem Schütteln die Platte wieder auf einen Magnethalter stellen. Um die magnetischen Kügelchen zu fixieren, vorsichtig den Überstand mit einem Vakuum-Aspirator abziehen, ohne die magnetischen Kügelchen zu stören.Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und verwerfen Sie diesen. Nehmen Sie die Platte vom Magnethalter. Wiederholen Sie die Waschung ein zweites Mal mit 150 Mikrolitern cDNA-Waschpuffer.Nach der zweiten Wäsche trocknen Sie die Kügelchen, indem Sie die Platte zwei Minuten lang auf dem Rüttler bei maximaler Geschwindigkeit schütteln. Es ist wichtig, die Kügelchen nicht übermäßig austrocknen zu lassen. Danach eluieren Sie die cDNA von den Kügelchen, indem Sie jeweils 18 Mikroliter vorgewärmtes, nukleasefreies Wasser kräftig zu jeder Probe hinzufügen.Schütteln Sie die Platte drei Minuten lang auf dem Rüttler. Überprüfen Sie anschließend, ob die magnetischen Partikel vollständig dispergiert sind. Falls nicht, schütteln Sie weiter.Sobald sich die magnetischen Perlen vollständig verteilt haben, stellen Sie die Platte auf einen Magnethalter. Um die magnetischen Perlen zu fixieren, überführen Sie das eluierte cdNA vorsichtig in eine neue PCR-Platte oder in PCR-Röhrchen. Sie sollten dabei etwa 16 Mikroliter des Eluats pro Probe gewinnen.Fahren Sie direkt mit dem nächsten Schritt fort oder frieren Sie die cdNA bei minus 20 Grad Celsius ein. Bereiten Sie die IVT-Master-Mix-Lösung bei Raumtemperatur vor. Pipettieren Sie die Master-Mix-Lösung vorsichtig oder mischen Sie sie durch leichtes Anstoßen und zentrifugieren Sie kurz.Nach der Zentrifugation 24 Mikroliter zu jeder Probe hinzufügen und vorsichtig durch dreimaliges bis viermaliges Auf- und Abpipettieren gemischt bei 37 Grad Celsius für 14 Stunden in einem Thermocycler inkubieren. Anschließend bei vier Grad Celsius lagern, bis der nächste Schritt durchgeführt wird. Die RNA-Bindungsperlen vor der Verwendung kurz verwirbeln, um eine gleichmäßige Mischung zu erhalten. Den A-RNA-Bindungsmix bei Raumtemperatur herstellen.Dies kann im Voraus durchgeführt werden. Die hergestellte Bindungslösung kann bis zu einer Woche bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Vortexen Sie die Probe gründlich und pipettieren Sie den A-RNA-Elutionspuffer in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, das bei 50 bis 60 Grad Celsius mindestens 10 Minuten lang inkubiert wird.Fügen Sie nun 70 Mikroliter der A-RNA-Bindungslösung zu jeder Probe hinzu und mischen Sie diese gut durch dreimaliges bis viermaliges Auf- und Abpipettieren. Überführen Sie die Proben von der PCR-Platte in eine 96-Well-Rundbodenplatte. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter hundertprozentiges Isopropanol zu jeder Probe hinzu und mischen Sie gut durch dreimaliges bis viermaliges Auf- und Abpipettieren.Schütteln Sie die Platte vorsichtig zwei Minuten lang auf einem Rüttelgerät. Um die Proben gründlich zu mischen, bringen Sie die Platte auf einen Magnethalter, um die magnetischen Kügelchen zu fixieren.Lassen Sie die Platte auf dem Ständer, bis die Mischung transparent wird und sich die Bindungskügelchen abgesetzt haben. Nachdem sich die Kügelchen abgesetzt haben, entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit dem Vakuumabsauger, ohne die magnetischen Kügelchen zu stören. Alternativ entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette und verwerfen diesen.Entfernen Sie die Platte vom Magnethalter. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter einer RNA-Waschlösung in jedes Loch und schütteln Sie die Platte eine Minute lang auf dem Rüttler bei mäßiger Geschwindigkeit. Die Kügelchen müssen sich dabei nicht vollständig verteilen. Bringen Sie die Platte in diesem Schritt auf einen Magnethalter.Um die magnetischen Perlen zu fixieren. Vorsichtig den Überstand mit einem Vakuumaspirator abziehen, ohne die magnetischen Perlen zu stören. Alternativ den Überstand vorsichtig mit einer Pipette entfernen und verwerfen.Nachdem das Überstand entfernt wurde, nehmen Sie die Platte vom Magnethalter. Wiederholen Sie die Waschung ein zweites Mal mit 100 Mikrolitern RNA-Waschlösung. Trocknen Sie die Perlen nach der zweiten Waschung, indem Sie die Platte eine Minute lang auf dem Rotationsschüttler bei maximaler Geschwindigkeit schütteln.Denken Sie daran, die Proben nicht zu stark zu trocknen. Eluieren Sie die A-RNA von den Böhnchen, indem Sie 40 Mikroliter des vorgewärmten A-RNA-Elutionspuffers zu jeder Probe hinzufügen. Schütteln Sie die Platte anschließend kräftig drei Minuten lang auf dem Rotationsschüttler. Überprüfen Sie dann, ob die magnetischen Böhnchen vollständig dispergiert sind.Falls nicht, weiter schütteln. Sobald sich die magnetischen Perlen vollständig verteilt haben, die Platte auf einen Magnethalter bringen, um die magnetischen Perlen zu fixieren. Das Überstand enthält das gereinigte Aminoallel, das eine RNA aufgenommen hat.Überführen Sie die eluierte NA vorsichtig in eine neue PCR-Platte oder in neue PCR-Röhrchen. An diesem Punkt können Sie die RNA-Konzentration der Proben durch Messung von 1,5 µL auf einem NanoDrop-Spektrophotometer überprüfen. Fahren Sie anschließend unverzüglich mit dem nächsten Schritt fort oder lagern Sie die NA bei −80 °C.Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man amplifizierte, immuno-allel-eingebaute RNA-Proben für die Mikroarray-Hybridisierung fluoreszenzmarkiert. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass eine zweite Amplifikationsrunde nicht empfohlen wird. Da Verzerrungen und Array-Daten beobachtet wurden, ist außerdem zu beachten, dass sorgfältiges Mischen in jedem enzymatischen Schritt – sowohl beim ersten als auch beim zweiten Strang – ratsam ist.Die cDNA-Synthese oder der IVT-Schritt ist entscheidend, um gute Amplifikationsausbeuten zu erzielen, ebenso wie die Inkubation jedes enzymatischen Schritts bei der geeigneten Temperatur. Ein PCR-Cycler mit verstellbarem beheiztem Deckel ist vorzuziehen, da bereits geringe Abweichungen von zwei bis drei Grad während der In-vitro-Transkription in einem Luft-Hybridisierungs-Ofen oder in einer Wasserbad-Hybridisierung die Ausbeute des amplifizierten Produkts erheblich beeinträchtigen können.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten. Achten Sie darauf, auch die anderen Videos dieser Reihe anzusehen, in denen wir die Durchführung einer Zeitreiheninfektion mit dem Vaccinia-Virus, die RNA-Extraktion der Proben sowie die Herstellung und Aufreinigung fluoreszenzmarkierter RNA zeigen.

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Protokoll zur Vaccinia-Infektion von HeLa-Zellen und die Analyse von Host-und virale Genexpression.

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis des Virus Gene Expression: Teil 1

Protokoll zur Vaccinia-Infektion von HeLa-Zellen und die Analyse von Host-und virale Genexpression. Teil 3 beschreibt den Prozess der Fluoreszenzmarkierung der amplifizierten RNA aus beiden Gastgeber und virale Proben durch Amino Allyl-Kupplung von Farbstoffen.

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis des Virus Gene Expression: Teil 3

Novel Wirtsfaktoren in Virusinfektion beteiligt durch zell-basierte genomweite Verlust der Funktion RNAi-Screening identifiziert werden.

RNAi Screening für Host beteiligten Faktoren in Vaccinia Virus-Infektion mit Drosophila Cells

Onkolytischen Viren sind für Krebstherapeutika vielversprechend. Die Fähigkeit, die infectability von Live-Gewebeproben von Patienten vor der Behandlung erhalten zu ermitteln ist ein einzigartiger Vorteil dieses therapeutischen Ansatzes. Dieses Protokoll beschreibt, wie das Gewebe für die...

Ex-vivo-Infektion von lebendem Gewebe mit onkolytischen Viren

Wir beschreiben ein Protokoll zu den wichtigsten Aufgaben der Host Signalmoleküle in lytische Replikation eines Modells Herpesvirus, gamma Herpesvirus 68 (γHV68) zu identifizieren. Mit Hilfe genetisch veränderter Mauslinien und embryonale Fibroblasten zur γHV68 lytische Replikation, erlaubt das Protokoll sowohl phänotypische Charakterisierung und molekulare Vernehmung von Virus-Wirt-Interaktionen in lytischen Replikation.

Sezieren Host-Virus-Interaktion in Lytic Replikation von einem Modell Herpesvirus

Verfahren zur Verfolgung synaptisch verbundenen Neuronen beschrieben. Wir verwenden TVA Spezifität eines vorgeschalteten Zelle zu untersuchen, ob eine Zellpopulation von Interesse synaptischen Input von genetisch definierten Zelltypen erhält.

Viral Tracing von genetisch definierten Neural Circuitry

Hier wird ein schnelles und modulares Protokoll zur Erzeugung rekombinanter Impfstoffviren beschrieben, die fluoreszierend markierte Proteine gleichzeitig mit der Methode der transienten dominanten Selektion exezieren.

Methodik zur effizienten Erzeugung fluoreszierender Vaccinia-Virusproteine

Wir beschreiben die Verwendung eines fluoreszierenden Reporter Vaccinia-Virus, das Echtzeit-Messung der viralen Infektiosität und Genexpression ermöglicht durch die Stufe-spezifische Expression von spektral unterschiedlichen Fluorophoren Reporter. Wir detailliert ein plattenbasierte Verfahren zum genauen Identifizieren der Phase, in der die Virusreplikation in Reaktion auf kleine Molekül Inhibierung betroffen.

Vaccinia-Viren Reporter zur Quantifizierung von Viral-Funktion auf allen Stufen der Genexpression

Hier präsentieren wir Ihnen die Protokolle, um 1) Virus-codierte Immunmodulatoren zu identifizieren, die Förderung von Arboviren Replikation und (2) Eukaryotische Host Faktoren, die Arboviren Replikation zu beschränken. Diese Fluoreszenz und Lumineszenz-basierten Methoden können Forscher schnell quantitative Ablesung von Arboviren Replikation in einfachen Tests mit geringen Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten.

Arboviren Infektionen als Screening-Tools für die Identifizierung von viralen Immunmodulatoren und Host antiviralen Faktoren

ICP0 erfährt nuklearen-cytoplasmatische Translokation bei HSV-1 Infektion. Der molekulare Mechanismus dieses Ereignisses ist nicht bekannt. Hier beschreiben wir die Verwendung von confocal Mikroskop als Instrument zur ICP0 Bewegung in HSV-1-Infektion, die legt den Grundstein für die Analyse von quantitativ ICP0 Translokation in zukünftigen mechanistische Studien zu quantifizieren.

Zeitliche Analyse der nuklearen-cytoplasmatische Translokation eines Herpes-Simplex-Virus 1-Proteins Immunofluorescent konfokalen Mikroskopie

Erfahren Sie die Synthese von cDNA aus RNA aus HeLa-Zellen nach Vaccinia-Virus-Infektion. Dieses Protokoll zeigt die Amplifizierung viraler RNA mittels reverser Transkription und in-vitro-Transkription für Microarray-Analysen.

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis des Virus Gene Expression: Teil 2

Weitere Videos entdecken