Name: Vermehrung von humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Erfahren Sie die Kollagenase-Technik zur Vermehrung humaner embryonaler Stammzellen der Linien H1 und H9. Diese Methode ermöglicht die sichere Aufrechterhaltung pluripotenter Zellen für die Stammzellforschung.

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<ol><li>Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+midbrain+dopaminergic+neurons+from+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Neuron. 28, 31-40 (2000).</li>
<li>Perrier, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12543-12548 (2004).</li>
<li>Pruszak, J., Isacson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons.</a> , John Wiley and Sons. (2007).</li>
<li>Pruszak, J., Sonntag, K. C., Aung, M. H., Sanchez-Pernaute, R., Isacson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+and+methods+for+cell+sorting+of+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations.</a> Stem Cells. 25, 2257-2268 (2007).</li>
<li>Sonntag, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+yield+of+neuroepithelial+precursors+and+midbrain-like+dopaminergic+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+using+the+bone+morphogenic+protein+antagonist+noggin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin.</a> Stem Cells. 25, 411-418 (2007).</li>
<li>Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+dopaminergic+neurons+and+pigmented+epithelia+from+primate+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1580-1585 (2002).</li>
<li>Ko, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursors+as+a+continuous%2C+stable%2C+and+on-demand+source+for+human+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived neural precursors as a continuous, stable, and on-demand source for human dopamine neurons.</a> J Neurochem. 103, 1417-1429 (2007).</li>
<li>Hong, S., Kang, U. J., Isacson, O., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+precursors+derived+from+human+embryonic+stem+cells+maintain+long-term+proliferation+without+losing+the+potential+to+differentiate+into+all+three+neural+lineages%2C+including+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neural precursors derived from human embryonic stem cells maintain long-term proliferation without losing the potential to differentiate into all three neural lineages, including dopaminergic neurons.</a> J Neurochem. , (2007).</li>
<li>Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+subtype+specification+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Neural subtype specification from embryonic stem cells.</a> Brain Pathol. 16, 132-142 (2006).</li>
<li>Pankratz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+via+an+obligated+primitive+anterior+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage.</a> Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).</li>
<li>Lazzari, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+neural+rosettes+from+cloned+bovine+blastocysts%3A+a+model+of+early+neurulation+events+and+neural+crest+specification+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of neural rosettes from cloned bovine blastocysts: a model of early neurulation events and neural crest specification in vitro.</a> Stem Cells. 24, 2514-2521 (2006).</li>
<li>Pomp, O., Brokhman, I., Ben-Dor, I., Reubinoff, B., Goldstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+peripheral+sensory+and+sympathetic+neurons+and+neural+crest+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 923-930 (2005).</li>
</ol>

vermehrung von humanen embryonalen stammzellen (es-zellen)

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Vermehrung von humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen)

Ja, ich bin Lauren Deon. Ich leite die Human Amgen Stammzell-Ko-Einrichtung am MGH. Ja, ich bin Lauren, ich leite die Human AM Stammzell-Ko-Einrichtung am MGH.Ich arbeite seit Jahren mit humanen Amgen-Stammzellen, und zwar bereits seit meiner Zeit als Postdoktorand in George De Labs vor vier, vier Jahren. Derzeit verfügen wir über zwei Zelllinien, H1 und H9, die beide von Y-Zellen stammen. Die Vermehrung bzw. Kultivierung dieser Zellen erfolgt derzeit – zumindest beim Passagieren der Zellen – durch die Verwendung von Kollagenase.Was ich normalerweise mache, ist, dass ich für die ersten paar Passagen nach dem Aussäen der Zellen ein technisches Verfahren verwende, bei dem ich Kolonien aussuche. In diesem Fall kann ich unter dem Mikroskop überprüfen, welche Kolonien gut differenziert sind und eine schöne Form aufweisen, und ich sammle nur diese Kolonien, zerschneide sie in mehrere Stücke und gebe sie zurück auf eine frische Unterlage. Die Kolonien hingegen, die schlecht differenziert aussehen, lasse ich einfach in Ruhe.Die andere Möglichkeit, die Zellen zu passieren, besteht in der Verwendung von Trypsin. Ich verwende diese Technik hier jedoch nicht. Ich denke, Kollagenase ist etwas sicherer, da humane Stammzellen es nicht mögen, einzeln zu sein oder isoliert zu werden.Wenn Sie also Trypsin verwenden und dieses etwas zu lange einwirken lassen, beispielsweise drei bis vier Minuten – so wie wir es bei anderen Zelltypen, etwa humanen Stammzellen, mit Streifen tun –, werden die Zellen einzeln dissoziiert, und die meisten von ihnen sterben ab, differenzieren sich oder heften sich nicht an das Substrat an. Daher ist es wichtig, die Zellen als Zellhaufen zu belassen. Sie sollen nicht einzeln im Kolben vorliegen.Der Vorteil bei Verwendung von Kollagenase besteht darin, die Zellen als Pflanzen zu erhalten. Bei Verwendung von Chipsy wählt man lediglich Zellen aus, die diesen sehr, sehr harten Prozess der g-Opsonisierung überleben. Solche Zellen sind gewöhnlich stark proliferativ.Sie können Ihre Zellen also an diesen Trypsin-Prozess anpassen. Das Problem ist, dass die Zellen unterschiedlich reagieren und viel schneller wachsen. Ein Risiko besteht darin, dass Sie einige kommerzielle Abnormalitäten bei diesem sehr starken Teilungsprozess erhalten können.Sie sagen also, dass die Isolierung in der Kultur zur Selektion der am stärksten proliferierenden Zellen führen kann. Genau. Aktiverer und wahrscheinlich auch mit höheren Überlebensraten als andere Zellen. So wird die Kultur nach mehreren Passagen, nach Proliferation und Trypsinisierung, im Grunde eine andere Kultur mit diesen unterschiedlichen Eigenschaften.Es ist also schwierig herauszufinden, ob sie exakt identisch sind. Wenn Sie den Test durchführen, den üblichen Test, sagen wir, Sie überprüfen Marker, reguläre Marker für endgültig differenzierte Zellen wie OC4, Nanog, Oct4, SC4, C3, all diese Moleküle könnten weiterhin exprimiert sein. Wenn Sie TER-Bildung durchführen, könnten diese Zellen sich weiterhin differenzieren und wie normale Zellen ausgebildet werden.Wenn Sie sich den Karyotyp ansehen, könnte es einige Auffälligkeiten geben, aber möglicherweise weisen Sie dennoch einen normalen Karyotyp auf. Der selektive Vorteil könnte auf einer einfachen Mutation beruhen, die mittels Karyotypisierung nicht sichtbar ist. Die Tatsache, dass sie deutlich schneller wachsen, ist daher meines Erachtens bereits ein wenig besorgniserregender.Und wenn wir diese Zellen irgendwann für Transplantationen verwenden möchten, würde ich auf keinen Fall diese Art von Zellen nutzen. In Ordnung. Möchten Sie mir daher erläutern, welche wesentlichen technischen Probleme bei der Anwendung dieser Technik für die Passagierung von Zellen bestehen? Also die Verwendung von S, ja.Es dauert einfach etwas länger, und da die Zellen nicht so schnell wachsen, benötigt man viel mehr Zeit, um eine hohe Zellanzahl für ein Experiment zu erhalten. Es ist daher einfach weniger praktisch, würde ich sagen. Möchten Sie mir kurz etwas zu den Zielen Ihres Experiments erzählen?Wie verwendet man CS-Zellen? Okay, mein Hauptprojekt hier besteht darin, endotheliale Zellen aus menschlichen AB-Stammzellen zu gewinnen. Die Idee ist, in der Lage zu sein, Blut herzustellen.Und wir arbeiten viel mit Laboren der Gewebebioengineering zusammen, deren Ziel es ist, Gewebe in vitro herzustellen. Eine der Einschränkungen dabei ist jedoch das Fehlen von Blutgefäßen in diesen Geweben. Wenn wir daher Endothelzellen in dieses Gewebe einbringen könnten, würde das Gewebe besser wachsen.Es sind also nur wenige Zellquellen für Endothelzellen bekannt, wie beispielsweise Kaltblut oder Druckblut, doch wäre es interessant, eine weitere Zellquelle wie humane Jahre zu nutzen. Der Vorteil liegt darin, dass humane Jahre unbegrenzt expandiert werden können, sodass man diese Zellen modifizieren, ein induzierbares System erstellen und anschließend verwenden könnte – letztendlich in Ihrem Endprodukt, Ihren Materialzellen, in diesem Fall.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Fähigkeit von humanen embryonalen Stammzellen sich selbst zu erneuern und zu differenzieren sich in alle Zelltypen des Körpers lässt vermuten, dass sie großes Versprechen für medizinische Anwendungen und als Recherche-Tool für die Bewältigung grundlegender Fragen in Entwicklung und Krankheit zu halten. Hier bieten wir Ihnen einen kurzen Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen aus Embryonen, die durch immunosurgical Isolierung der inneren...

Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Immunosurgery

Die Differenzierung der ESC deckt sich mit Zelltyp-spezifische Veränderungen in der Struktur und Zusammensetzung des Chromatins. Der Nachweis dieser Veränderungen bietet wertvolle Einblicke in die Mechanismen, die stemcellness und der Zelldifferenzierung zu definieren. Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) stellt eine wertvolle Methode, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen Stammzell-Differenzierung zu sezieren.

Chromatin Immunopräzipitation von humanen embryonalen Stammzellen

Dieses Video zeigt, wie das Wachstum von humanen embryonalen Stammzellen (hES) in Feeder-Zell-freien Bedingungen und wie kontinuierlich Durchgang hESCs in Feeder-Zell-freien Bedingungen aufrecht zu erhalten. Bestätigung der hESC Pluripotenz gewachsen in Feeder-Zell-freien Bedingungen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie ist auch bewiesen.

Von MEFs auf Matrigel 3: Die Passage hESCs von Matrigel auf Matrigel

Gerichtete Differenzierung von hES-Zellen in spezifische hat viel Interesse in der regenerativen Medizin erzeugt. Wir bieten Ihnen eine präzise, ​​Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Bestimmung...

Fate Mapping von humanen embryonalen Stammzellen durch Teratom Formation

Trotz der jüngsten Fortschritte in der Gentechnik, bleibt Transfektion von humanen embryonalen Stammzellen (hES) ein launischer Prozess. Nach unserem Kenntnisstand haben systematische und effiziente Methoden, um Menschen induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) transfizieren nicht berichtet worden. Hier beschreiben wir robuste Protokolle effizient transfizieren und nucleofect menschlichen iPS.

Transfektion und Nucleofecting menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Neuroblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen neuronalen Vorläuferzellen und neuronalen Zelltypen in sich entwickelnden ZNS für neuronale Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Einzelzell-Genexpression Test wird für das Verständnis der Stammzell Heterogenitäten benötigt.

Profiling Individuelle humanen embryonalen Stammzellen durch quantitative RT-PCR

Reporterzelllinien bieten ein Mittel, um zu visualisieren, zu verfolgen und zu isolieren Zellen von Interesse aus heterogenen Populationen. Jedoch Gen-Targeting unter Verwendung von herkömmlichen homologen Rekombination in embryonalen Stammzellen äußerst ineffizient. Hier beschreiben wir Targeting ZNS Mittelhirn spezifischen Transkriptionsfaktor PITX3 Ortes mit EGFP mit Zink-Finger-Nuklease verbesserte homologe Rekombination.

Zinkfinger-Nuklease Verbesserte Gene Targeting in humanen embryonalen Stammzellen

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer einzelzelligen Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen und deren anschließende Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen vorgestellt. Das Protokoll ist einfach, robust, skalierbar und eignet sich für Arzneimittelscreenings und anwendungen in der regenerativen Medizin.

Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

Hier zeigen wir, wie unser Labor FARBEN humanen embryonalen Stammzelllinien gefriert.

Einfrieren menschlicher ES-Zellen

Erfahren Sie die Kollagenase-Technik zur Vermehrung humaner embryonaler Stammzellen der Linien H1 und H9. Diese Methode ermöglicht die sichere Aufrechterhaltung pluripotenter Zellen für die Stammzellforschung.

Vermehrung von humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen)

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