Langfristige Imaging Säugetierzellen mit Wide-Field-Mikroskopie

Was ich eigentlich tun werde, ist, es zuerst hier einzuhängen und dann dich auszutauschen. Also werde ich jetzt aspirieren, versuchen, so sanft wie möglich zu sein. Okay. Ein paar Sekunden einfach nur halten. In Ordnung.

Die wichtigen Merkmale unseres Lifestyle-Bildgebungsrasters sind also, dass es sich um ein invertiertes Zielfernrohr handelt, was bedeutet, dass das Objektiv, die Proben hier im Objektiv, darunter liegt. Das Objektiv zeigt also nach oben, und der gesamte Bereich, oder praktisch das Ganze, praktisch der gesamte Bereich, einschließlich der Objektive und der Stichprobe, stehen bei 37 Grad. Alles in dieser Kunststoffbox ist also auf 37 Grad eingestellt.

Und ganz oben auf der Bühne haben wir eine Mischung aus Luft und CO2. Das sind 5% CO2. Die Idee ist also, dass sich die Probe tatsächlich in einer Zelle befindet, es ist wie ein Zellinkubator.

Und so haben wir, das ist unser Mischer für die Luft und das CO2 und es wird befeuchtet und erhitzt und dann auf die Probe auf dem Tisch geleitet. Okay. Und heute werden wir nur Fluoreszenz-Einkanal-GFP-Fluoreszenz machen. Dies ist der Schlauch, in den das CO2 und 5% CO2 gelangen und der gerade noch in die Bühnenhalterung passt.

Das ist wichtig. Und dann können wir diese schließen, diese abbauen und dann gehen wir zu unserer ersten Position. Und was ich tun werde, ist, zum ersten Feld zu gehen, das meine Kontrollstichprobe ist, und ich wähle Positionen basierend auf dem aus, was ich auf dem Bildschirm sehe.

Also stelle ich sicher, dass ich tatsächlich in jedem neuen Brunnen in das Mikroskop schaue, denn die Fokusebene für jede der Vertiefungen ist anders, die Schale ist nicht perfekt flach auf dem Boden. Sie müssen also Feineinstellungen vornehmen, wenn Sie vom Brunnen zum Brunnen wechseln. Im Moment bin ich also bei der ersten, nun, was ich tun werde, ist, zu fokussieren, also habe ich einfach getroffen, ich habe gerade gesagt, ich habe einfach das Licht eingeschaltet, das Durchlicht für das Mikroskop.

Und ich muss sicherstellen, dass das gesamte Licht zu den Okularen gelangt. Und so schaue ich einfach rein und sorge dafür, dass ich ein schönes, sauberes Feld bekomme. Und dann schalte ich das Licht aus, schalte das Fluoreszenzlicht ein und stelle sicher, dass die Zellen, die ich betrachte, gesund aussehen und nicht apoptotisch sind.

Und, und ich schalte das aus. Und was ich als nächstes mache, ist Senden, also fange ich jetzt an, Positionen auszuwählen, was bedeutet, dass ich den Lichtweg an die Kamera senden muss. Das ist die Kamera hier.

Also sage ich dem Mikroskop, dass es die ganze Kamera schicken soll, sie sehen nichts in den Okularen. Was ich mache, ist, in der Software, die das Mikroskop steuert, das richtige Filterset auszuwählen, das für unsere Zwecke psy ist. Stellen Sie dann eine Belichtungszeit ein.

Und ich kenne diese Zellen sehr gut und ich weiß, dass sie eine Belichtungszeit von 0,2 Sekunden benötigen. Also sage ich, das ist es, was ich der Software sage. Und was ich mache, ist auf Fokus zu drücken.

Das ist, und es ist im Grunde nur lebendig. Das, ein Licht wird angehen und du kannst, oh, ich weiß nicht, ob du Zellen sehen kannst, aber der Grund, warum dies ein gutes Feld ist, ist, weil es gibt, alle Zellen sind, sogar in Bezug auf ihre Fluoreszenz, Es gibt keine apoptotischen Zellen. Apoptotische Zellen neigen dazu, sehr hell zu sein und es gibt keinen Schmutz oder Schmutz auf dem Feld.

Und Sie können sehen, dass sie tatsächlich eine Metaphase-Zelle sind und das ist eine Metaphase-Zelle, das ist eine Zelle, die wahrscheinlich gerade die Mitose verlassen hat. Und ich kann nur sagen, dass, weil es so aussieht, als wären diese beiden Chromatin-Sätze sehr schön zueinander ausgerichtet. Als ob sie gerade ein Gesicht verlassen hätten.

Das ist also ein gutes Feld. So, und jetzt, da ich weiß, dass die Belichtungszeit und der Filtersatz korrekt sind, und das wird softwarespezifisch sein, gehe ich los und nehme Positionen ein, und jetzt hat die Software die X-, Y-, Z-Position dieses Feldes gespeichert. Und wenn ich dann ein anderes Feld auswähle, dann ist es, und ich werde, also wenn ich auswähle, wenn ich neue Felder auswähle, aber auf die gleiche Weise, nun, ich benutze das, ich bewege das ich, ich drehe den Auslöser, ich öffne den Auslöser und ich schaue, was ich auf dem Bildschirm sehe, und ich wähle Felder aus, die darauf basieren, anstatt im Feld zu schauen.

Ich sehe also nichts von meinen Stärkungsmitteln darin. Aber auch hier werden diese Zellen auch schön zentriert durch mein PS gehen Ich fahre fort, hier ist ein gutes Beispiel. Hier ist ein gutes Beispiel dafür, was ich vermeiden würde, sehen Sie, wie hell das ist?

Das ist sehr hell. Das sind wahrscheinlich die Überreste einer apoptotischen Zelle. Und der Grund, warum ich das vermeiden würde, ist, dass die Software beim Autofokus so hell ist, dass sie genau darauf fokussiert und sich nicht in der gleichen Ebene wie all diese anderen Zellen befindet.

Und so bekomme ich keine Informationen aus diesem Bereich. Das sieht gut aus. Es gibt eine, das ist eine Pro-Metaphase genau hier, das ist eine Metaphase.

Also, und ich werde drei Positionen pro Bohrung einnehmen. Das waren also drei Positionen und jetzt gehe ich zu meinem nächsten Nun, also können Sie, also was ich wahrscheinlich tun werde, ist, alle 10 Minuten Bilder zu machen. Es ist also ein Kompromiss.

Lifestyle-Bildgebung ist immer ein Kompromiss, oder? Man muss sich ein Bild machen, man muss die Zellen gesund halten, besonders wenn man sich für Mitose interessiert. Sie müssen also ihre Exposition gegenüber der Fluoreszenzlinie minimieren.

Und, aber Sie wollen Informationen bekommen. Man muss also Bilder machen, man muss, also muss man Kompromisse eingehen, man muss eine Wahl darüber treffen, was man erfassen möchte, welche Art von Informationen man erfassen möchte. Für unsere Zwecke dauert die Mitose in der Regel etwa eine Stunde.

Wenn wir also 10-Minuten-Intervalle nehmen, ist das ziemlich gut. Wir sehen die Prophase, wir sehen die Metaphase, wir sehen die Anaphase, und wir können, wir können sehen, wann es Behandlungen oder Medikamente oder siRNAs gibt, die diese spezifischen Zellzyklusstadien beeinflussen. Für unsere Zwecke reicht das also, aber wir wollen immer mehr.

Wir wollen immer mehr Positionen oder eine feinere Zeit und ein feineres Intervall oder so etwas. Es ist also ein Kompromiss. So, und dann drücke ich auf Start.

Und so führt unsere Software beim ersten Durchgang einen Autofokus-Durchgang durch. Sobald ich also auf Start drücke, sollte der Autofokus gestartet werden und Sie sehen, wie sich der Verschluss zwischen dem Autofokus öffnet, öffnet und schließt. Also drücke ich auf Start.

Das ist also das Öffnen und Schließen des Verschlusses. Der Z-Motor rastet ein und versucht tatsächlich, das Flugzeug mit dem größten Kontrast zu finden, das am stärksten fokussiert ist. Sie können tatsächlich auf dem Bildschirm sehen, wie Sie die beste Fokusebene finden und suchen, was besorgniserregend sein könnte.

Was es also tut, ist es, es treibt den Z-Motor an, um den besten, den Fokus auf der Fokusebene zu finden, naja, den meisten im Bild. Und dann nimmt es dort ein Bild auf und dann lernt es diese Z-Position. Und dann verwenden wir diese Z-Position für die nächsten 12 Durchgänge.

Und dann machen wir den Autofokus-Durchgang erneut. Welche Art von Experimenten machen sie? Okay, unser Labor ist hauptsächlich daran interessiert zu verstehen, was die Progression der Mita reguliert, oder zumindest bin ich am meisten daran interessiert, das zu verstehen.

Mit der Bildgebung von lebenden Zellen und insbesondere mit unserem Langzeit-Bildgebungsgerät mit mehreren Positionen können Sie zwei oder drei Tage lang Zellen filmen, die in die Mitose eintreten, und Sie können mehrere Runden der Mitose abbilden, damit Sie es verstehen können. Und dann kann man Medikamente oder RNAs oder jede Art von Störungen auf die Zellen aufbringen, die man untersuchen möchte. So können Sie verstehen, wie und wie diese Medikamente oder Gene bei der Regulierung des mitotischen Fortschreitens wichtig sind.

Da es sich nicht um fixierte Zellarbeit und lebende Zellarbeit handelt, können Sie verstehen, wann Sie eine Störung benötigen, um die Mitose zu beeinflussen, oder welches Stadium der Mitose betroffen ist. In dieser Hinsicht ist es also wirklich mächtig. Was, was sind die wichtigsten technischen Elemente dieser Experimente?

Was sind die möglichen Probleme? Nun, das größte Problem neben dem Einrichten des Rigs ist das Einrichten des Rigs nicht trivial. Viele Leute haben das Rig, aber stellen Sie nur sicher, dass es für Ihre Anwendung gut funktioniert.

Das finanzielle Element ist nicht klein. Es gibt also die Einrichtung des Geräts und dann, und wenn man die Daten gesammelt hat, gibt es ein echtes Problem bei der Datenanalyse. Wenn Sie also 40 Filme mit jeweils 30 Zellen sammeln, also 40 in 40 Feldern haben, die Sie gerade gefilmt haben, und jedes dieser Felder hat 30 Zellen, dann müssen Sie sich mit jedem dieser Filme hinsetzen und sich jede dieser Zellen in diesem Film ansehen.

Es dauert also sehr lange, eine Datenanalyse durchzuführen. Und das ist, es dauert also eine Woche, um Daten zu analysieren, für deren Erfassung Sie zwei Tage gebraucht haben. Es gibt also eines, das ein sehr großes Hindernis ist, wenn es darum geht, viele Daten zu sammeln.

Es handelt sich also nicht um eine Datenerfassung mit hohem Durchsatz, aber nicht um eine Analyse mit hohem Durchsatz. Was würden Sie also machen, um dieses Experiment mit wirklich hohem Durchsatz zu erreichen? Unser Labor ist also dabei, ein Programm zu entwickeln, das die Datenanalyse automatisch durchführt.

Und es ist ein ziemlich anständiges Programm. Es ist nicht perfekt. Das menschliche Auge ist immer besser, aber es ist auf dem Weg dorthin.

Was sind also die interessanten Anwendungen dieses Experiments? Vielleicht können Sie noch andere Bereiche erwähnen? Neben der Zellteilung?

Du meinst für die, oh, für die Lebendzell-Bildgebung? Ja, nun, Sie können Zellmotilitätsassays durchführen. Man kann, abhängig von der Mikroskopie, die involviert ist, man kann sich ansehen, wie Zellen aussehen, man könnte sich die Tumorentwicklung ansehen, wenn man wirklich wollte.

Aber da sind Sie, Sie sind, wenn Sie, solange Sie die richtige Bildgebung eingerichtet haben, Sie so gut wie nicht in Bezug auf irgendetwas eingeschränkt sind. Unser Zielbereich ist zufällig nur ein weites Feld und wir verwenden ein 20 x 20 x Objektiv. Es ist also eine ziemlich niedrige Auflösung, aber das ist ausreichend für das, was wir sehen müssen.

Es gibt sie, aber es gibt sie definitiv nicht, Sie wären nicht eingeschränkt. Alles, was irgendeine dynamische Art von Experiment hat, was die Biologie wäre, würde wirklich von der Lifestyle-Bildgebung profitieren. Also, Kalzium-Bildgebung, obwohl man das mit unserem Gerät nicht machen könnte, das ist eine lebende Zelle.

Dafür braucht man auf jeden Fall Live-Cell-Imaging. Wie ich schon sagte, Patienten-Assays, Motilitäts-Assays und solche Dinge würden wirklich von der Bildgebung lebender Zellen profitieren. Möchten Sie ein paar Worte über Ihre bisherigen Erfahrungen erzählen?

Wie lange arbeiten Sie an diesen Techniken? Woran hast du vorher gearbeitet? Wow.So in meiner Doktorarbeit habe ich nicht gearbeitet.

Ich habe viel konfokale Mikroskopie gemacht, aber keine Lifestyle-Bildgebung. Und während meiner Postdoc-Zeit half ich Dr. King, dieses Gerät zu bekommen, das wir gerade benutzt haben, um dieses Fragment einzurichten, und es zum Laufen zu bringen. Und so habe ich während meines Postdocs viel Erfahrung sowohl mit der Weitfeld- mit Zeitraffer-Bildgebung auf unserem Zielfernrohr, also dem Weitfeld-Mikroskop, als auch mit der Zeitraffer-Bildgebung mit konfokaler Mikroskopie gemacht.

Und ich würde sagen, dass es wirklich mächtig ist. Man bekommt viele Informationen, aber es ist nicht einfach, perfekt zu arbeiten. Es erfordert also wirklich viel Aufmerksamkeit und viel Liebe zum Detail bei jedem kleinen Schritt des Prozesses.

Und, und dann hat man immer noch Probleme. Es ist also eine schwierige Anwendung, aber Sie können es wirklich bekommen, wenn, wenn es das ist, was Sie brauchen, um Ihr Problem zu studieren, Ihr wissenschaftliches Problem, dann ist es in dieser Hinsicht von unschätzbarem Wert, aber es ist schwierig. Finden Sie also jemanden, der weiß, was er tut, und nutzen Sie ihn.

Das ist mein Rat. So gut.