Name: Langfristige Imaging Säugetierzellen mit Wide-Field-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: Erfahren Sie die Langzeitbildgebung von Säugetierzellen mit Wide-Field-Mikroskopie bei 37 °C. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Mitoseprogression in lebenden Zellen.

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langfristige imaging säugetierzellen mit wide-field-mikroskopie

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Langfristige Imaging Säugetierzellen mit Wide-Field-Mikroskopie

Was ich jetzt tun werde, ist, es zuerst hier einzubauen und dann Sie auszutauschen. Jetzt werde ich versuchen, vorsichtig zu aspirieren. Okay. Einige Sekunden lang einfach halten. Okay. Gut.Die wichtigen Merkmale unseres Lifestyle-Imaging-Rasters sind also, dass es sich um ein umgekehrtes Mikroskop handelt, was bedeutet, dass das Objektiv, die Proben hier im Objektiv, darunter liegen. Das Objektiv zeigt also nach oben, und das gesamte Mikroskop bzw. praktisch das gesamte Mikroskop, einschließlich der Objektive und der Probe, befindet sich bei 37 Grad. Alles in dieser Kunststoffbox hat also eine Temperatur von 37 Grad.Und direkt über dem Objekttisch befindet sich eine Mischung aus Luft und CO2. Das sind 5 % CO2. Die Probe befindet sich also gewissermaßen in einer Zellkultur, ähnlich wie in einem Zellinkubator.Und so haben wir hier unseren Mischer für die Luft und das CO₂, der befeuchtet und erwärmt wird und dann auf die Probe auf dem Objektträger geleitet wird. Okay. Heute werden wir nur Fluoreszenz in einem Kanal, die GFP-Fluoreszenz, durchführen. Dies ist der Schlauch, durch den das CO₂ – 5 % CO₂ – eintritt und der einfach in die Halterung des Objektträgers eingesteckt wird.Das ist wichtig. Dann können wir diese schließen, herunternehmen und uns in unsere erste Position begeben. Als Nächstes wechsle ich zum ersten Feld, das meine Kontrollprobe ist, und wähle Positionen basierend darauf aus, was ich auf dem Bildschirm sehe.Ich stelle also sicher, dass ich tatsächlich durch das Mikroskop in jedes neue Loch schaue, da die Fokusebene für jedes der Löcher unterschiedlich ist; die Platte ist auf der Unterseite nämlich nicht vollkommen eben. Daher müssen Sie feine Einstellungen vornehmen, wenn Sie von einem Loch zum nächsten wechseln. Im Moment befinde ich mich im ersten Loch; was ich jetzt tun werde, ist Fokussieren. Dazu habe ich gerade das Licht eingeschaltet, das Durchlicht für das Mikroskop.Und ich stelle sicher, dass das gesamte Licht zu den Okularen gelangt. Dann schaue ich hinein, um sicherzustellen, dass ich ein sauberes Sichtfeld erhalte. Anschließend schalte ich dieses Licht aus, schalte das Fluoreszenzlicht ein und überprüfe, ob die Zellen, die ich betrachte, gesund aussehen und nicht apoptotisch sind.Und, und ich schalte das aus. Und als Nächstes sende ich, jetzt werde ich anfangen, Positionen auszuwählen, was bedeutet, dass ich den Lichtweg zur Kamera umleiten muss. Das hier ist die Kamera.Ich stelle das Mikroskop so ein, dass es die gesamte Kamera nutzt, sodass nichts in den Okularen sichtbar ist. In der Software zur Steuerung des Mikroskops wähle ich dann den richtigen Filterblock aus, der für unsere Zwecke psy ist, und stelle eine Belichtungszeit ein.Und ich kenne diese Zellen sehr gut und weiß, dass sie eine Belichtungszeit von 0,2 Sekunden benötigen. Deshalb gebe ich dem Software entsprechend vor, das ist es, was ich der Software vorgebe. Und was ich dann tun werde, ist, auf Fokus zu klicken.Das hier ist, und es ist im Grunde genommen einfach lebendig. Ein Licht wird angehen, und Sie können, oh, ich weiß nicht, ob Sie die Zellen sehen können, aber der Grund, warum dies ein gutes Feld ist, liegt darin, dass alle Zellen, selbst hinsichtlich ihrer Fluoreszenz, keine apoptotischen Zellen aufweisen. Apoptotische Zellen neigen dazu, sehr hell zu sein, und es befindet sich kein Schmutz oder Dreck im Sichtfeld.Und Sie können sehen, dass dies tatsächlich eine Metaphase-Zelle ist und das dort eine Metaphase-Zelle, das ist eine Zelle, die vermutlich gerade die Mitose verlassen hat. Das erkenne ich daran, dass es so aussieht, als wären diese beiden Chromatinsätze sehr gut zueinander ausgerichtet. Als ob sie gerade eine Anaphase verlassen hätten.Das ist also ein gutes Feld. Da ich nun weiß, dass die Belichtungszeit und der Filter Satz korrekt sind – was softwareabhängig ist –, werde ich nun Positionen aufnehmen, und die Software hat die X-, Y-, Z-Position dieses Feldes gespeichert. Wenn ich dann ein weiteres Feld auswähle, also wenn ich neue Felder auswähle, aber in derselben Probe, werde ich den Verschluss öffnen, den Verschluss einschalten und auf dem Bildschirm prüfen, was ich sehe, und entsprechend Felder auswählen, anstatt direkt durch das Mikroskop zu schauen.Ich sehe also keine meiner Tinkturen dort. Doch erneut, selbst schön zentrierte Zellen werden durch meinen PS-I-Weiterlauf gehen; hier ist ein gutes Beispiel. Hier ist ein gutes Beispiel dafür, was ich vermeiden würde – sehen Sie, wie hell das ist?Das ist sehr hell. Das sind wahrscheinlich Reste einer apoptotischen Zelle. Und der Grund, warum ich das vermeiden würde, ist der, dass die Software beim automatischen Fokussieren genau darauf fokussieren würde, da es so hell ist, und sich dann nicht in derselben Ebene wie all diese anderen Zellen befinden würde.Und daher erhalte ich keine Informationen aus diesem Bereich. Das sieht gut aus. Hier ist eine, das ist eine Pro-Metaphase, das ist eine Metaphase.Also, ich werde drei Positionen pro Vertiefung aufnehmen. Das waren also drei Positionen, und jetzt gehe ich zu meiner nächsten Vertiefung über. Sie können also, was ich wahrscheinlich tun werde, alle 10 Minuten Bilder aufnehmen. Es ist ein Kompromiss.Die Live-Imaging-Technik ist immer ein Kompromiss, nicht wahr? Man muss die Zellen abbilden und gleichzeitig ihre Gesundheit erhalten, besonders wenn die Mitose im Fokus steht. Daher ist die Belichtung mit der Fluoreszenzlinie so gering wie möglich zu halten.Und, aber Sie möchten Informationen erhalten. Sie müssen also Bilder aufnehmen, Sie müssen einen Kompromiss eingehen, Sie müssen eine Entscheidung darüber treffen, was Sie erfassen möchten, welche Art von Informationen Sie erfassen möchten. Für unsere Zwecke dauert die Mitose in der Regel etwa eine Stunde.Wenn wir also 10-Minuten-Intervalle wählen, ist das ziemlich gut. Wir sehen die Prophase, wir sehen die Metaphase, wir sehen die Anaphase, und wir können erkennen, wann Behandlungen, Wirkstoffe oder siRNAs diese spezifischen Phasen des Zellzyklus beeinflussen. Für unsere Zwecke ist das ausreichend, aber wir wollen immer mehr.Wir möchten immer mehr Positionen oder eine feinere Zeit- und Intervalleinstellung oder so etwas in der Art. Es ist also ein Kompromiss. Dann drücke ich auf Start.Unsere Software führt dabei beim ersten Durchlauf eine automatische Fokussierung durch. Sobald ich auf Start klicke, sollte die automatische Fokussierung beginnen, und Sie werden sehen, wie sich der Verschluss zwischen den Fokussierungsvorgängen öffnet und schließt. Ich werde nun also auf Start klicken.Das ist also die Blende, die sich öffnet und schließt. Der Z-Motor wird aktiviert und versucht tatsächlich, die Ebene mit dem höchsten Kontrast zu finden, also diejenige, die am besten scharfgestellt ist. Man kann auf dem Bildschirm sehen, wie die Suche nach der optimalen Fokusebene erfolgt, was besorgniserregend wirken könnte.Es bewegt also den Z-Motor, um die Ebene mit der besten, der stärksten Bildschärfe zu finden, also die Ebene mit dem optimalen Bildkontrast. Anschließend nimmt es dort ein Bild auf und lernt diese Z-Position. Diese Z-Position verwenden wir dann für die nächsten 12 Durchläufe.Dann führen wir erneut den automatischen Fokussierungsdurchgang durch. Welche Art von Experimenten führen sie durch? In Ordnung, unser Labor interessiert sich hauptsächlich dafür zu verstehen, was die Mitoseprogression reguliert, oder zumindest interessiere ich mich am meisten dafür, dies zu verstehen.Mithilfe der Live-Cell-Bildgebung und insbesondere unseres Multiposition-Long-Term-Bildgebungssystems können Sie Zellen über einen Zeitraum von zwei oder drei Tagen filmen, während sie in die Mitose eintreten und diese durchlaufen, und mehrere Runden der Mitose abbilden, sodass Sie die Abläufe verstehen können. Anschließend können Sie Medikamente, RNAs oder jegliche Art von Störungen auf die Zellen anwenden, die Sie untersuchen möchten. Auf diese Weise können Sie verstehen, wie diese Medikamente oder Gene bei der Regulation des mitotischen Fortschritts eine Rolle spielen.Da es sich nicht um Arbeiten an fixierten Zellen, sondern um Arbeiten an lebenden Zellen handelt, können Sie verstehen, wann eine Störung erforderlich ist, um die Mitose zu beeinflussen, beziehungsweise in welcher Phase der Mitose eine Beeinflussung stattfindet. In dieser Hinsicht ist es also besonders leistungsfähig. Welche sind die wichtigsten technischen Elemente dieses Experiments?Welche möglichen Probleme gibt es? Nun, das größte Problem neben dem Aufbau der Apparatur ist, dass der Aufbau der Apparatur nicht trivial ist. Viele Personen verfügen über die Apparatur, müssen jedoch lediglich sicherstellen, dass sie gut für ihre Anwendung funktioniert.Der finanzielle Aspekt ist, wissen Sie, nicht unerheblich. Es geht also darum, die Apparatur aufzubauen, und danach, nachdem man die Daten gesammelt hat, stellt sich ein echtes Problem bei der Datenanalyse. Man nimmt diesen Film, also, wenn Sie 40 Filme sammeln, von denen jeder 30 Zellen enthält, haben Sie also 40 Aufnahmefelder, die Sie gerade aufgezeichnet haben, und jedes dieser Felder enthält 30 Zellen. Dann müssen Sie sich jeden dieser Filme einzeln vornehmen und jede einzelne Zelle in diesem Film untersuchen.Die Datenauswertung dauert also wirklich sehr lange. Und das bedeutet, dass es eine Woche dauert, Daten zu analysieren, für deren Sammlung Sie zwei Tage benötigt haben. Das stellt ein sehr großes Hindernis bei der Gewinnung umfangreicher Datenmengen dar.Es handelt sich also nicht, obwohl es sich um eine Datensammlung mit hoher Durchsatzleistung handelt, um eine Analyse mit hoher Durchsatzleistung. Was wäre nötig, um dieses Experiment wirklich durchsatzstark zu gestalten? Unser Labor entwickelt derzeit ein Programm, das die Datenanalyse automatisch durchführt.Und es ist ein ziemlich ordentliches Programm. Es ist nicht perfekt. Das menschliche Auge ist immer noch besser, aber es nähert sich diesem Niveau an.Welche interessanten Anwendungen hat dieses Experiment? Können Sie möglicherweise weitere Bereiche nennen? Abgesehen von der Zellteilung?Meinen Sie für die, oh, für die Live-Cell-Bildgebung? Ja. Nun, Sie können Zellmotilitätsassays durchführen. Je nachdem, welches Mikroskop verwendet wird, können Sie beispielsweise beobachten, wie sich Zellen bewegen, oder sogar die Tumorentwicklung verfolgen, wenn Sie das möchten.Dort hingegen, solange Sie die richtige Bildgebungseinrichtung haben, sind Sie praktisch in keiner Hinsicht eingeschränkt. Unser Mikroskop ist zufällig nur ein Weitfeldmikroskop, und wir verwenden ein 20×-Objektiv. Es handelt sich also um eine ziemlich niedrige Auflösung, aber das ist ausreichend für das, was wir beobachten müssen.Es gibt also durchaus Bereiche, in denen man definitiv nicht eingeschränkt wäre. Jeder Ansatz, der eine dynamische Art von Experiment beinhaltet – und das betrifft die Biologie – würde wirklich von der Lebensstil-Bildgebung profitieren. So wie die Kalzium-Bildgebung, die zwar nicht an unserem Gerät durchgeführt werden könnte, da es sich dabei um lebende Zellen handelt.Sie benötigen dafür auf jeden Fall die Bildgebung lebender Zellen. Wie ich bereits sagte, würden Patientenassays, Beweglichkeitsassays und ähnliche Untersuchungen wirklich von der Bildgebung lebender Zellen profitieren. Möchten Sie ein paar Worte zu Ihren bisherigen Erfahrungen sagen?Wie lange arbeiten Sie an diesen Techniken? Woran haben Sie zuvor gearbeitet? Wow. In meiner Doktorarbeit habe ich nicht gearbeitet.Ich habe viel konfokale Mikroskopie betrieben, aber keine Live-Cell-Bildgebung durchgeführt. Während meiner Postdoktorandenzeit half ich daher Dr. King dabei, diese Apparatur aufzubauen, mit der wir diese Fragmente präparierten und in Betrieb nahmen. So sammelte ich in meiner Postdoktorandenzeit umfangreiche Erfahrung sowohl mit Widefield-Mikroskopie mit Zeitrafferaufnahmen an unserem Mikroskop, das ist die Widefield-Mikroskopie, als auch mit Zeitrafferaufnahmen mittels konfokaler Mikroskopie.Und ich würde sagen, dass es wirklich leistungsstark ist. Man erhält viele Informationen, aber es ist nicht einfach, es perfekt zum Laufen zu bringen. Daher erfordert es wirklich viel Aufmerksamkeit und eine sorgfältige Beachtung der Details bei jedem kleinen Schritt des Verfahrens.Und, und dann hat man immer noch Probleme. Es ist also eine anspruchsvolle Anwendung, aber wenn es das ist, was Sie benötigen, um Ihr wissenschaftliches Problem zu untersuchen, dann ist sie in dieser Hinsicht unschätzbar wertvoll, wenngleich anspruchsvoll. Suchen Sie sich daher jemanden, der weiß, was er tut, und arbeiten Sie mit dieser Person zusammen.Das ist mein Rat. Sehr gut.

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Forschung

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