Name: Gross und Fine Dissection of Inner Ear Sinnesepithelien in Adult Zebrafisch ( Danio rerio) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Lernen Sie die Feinpräparation von Innenohr-Sinnesepithelien bei adultem Zebrafisch (Danio rerio). Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Haarzellregeneration und regenerativen Prozessen bei Wirbeltieren.

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Diese Arbeit wurde durch die Interne Research Program des National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health unterstützt.

Teil 1: Vorbereitung des Gewebes <ol><li> Euthanize der erwachsenen Zebrafisch mit gepufferter MS-222 (Ethyl-3-Aminobenzoesäure Methansulfonat Salz, 0,03%). </li><li> Enthaupten die Fische. Schneiden Sie den Unterkiefer, platzieren Sie den Kopf auf die Zerlegung Pad mit der Bauchseite auf und fixieren das Gewebe mit Insekten Pins. Entfernen Sie die Weichteile ventral auf den Schädel und knacken den ventralen Teil des Schädels Kapsel mit einer feinen Pinzette unter einer Dissektionsmikroskop. </li><li> Fix der Fischkopf in Paraformaldehyd (4%) bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Spülen Sie den festen Fischkopf in PBS (Phosphate Buffered Saline, 1x) für 3-mal, jeweils 5 Minuten Zeit. </li></ol> Teil 2: Gross Dissektion des Innenohrs <ol><li> Den Fisch den Kopf auf die Zerlegung Pad mit der Bauchseite nach oben. Immobilisieren sie mit Insekten Pins. Alle folgenden Schritte werden unter der Dissektionsmikroskop durchgeführt. </li><li> Mit einer feinen Pinzette, entfernen Sie die Schädelknochen über das Innenohr und dann vorsichtig herausziehen Innenohrgeweben: Säckchen, lagenae und Schläuchen. Der Sacculus und Lagena sind eng miteinander verbinden und so ziehen zusammen, während der Schlauch (anterior des Sacculus und Lagena), wird sehr wahrscheinlich vom anderen Ende Organe während der Präparation gelöst werden. </li><li> Legen Sie die Innenohrgeweben in PBS (1x). Wenn keine weiteren feinen Sezierung erforderlich ist, spülen Sie das Gewebe 2-3 mal mit PBS (1x) und es kann auch für andere Experimente, z. B. Gefrierschnitte verwendet werden. </li></ol> Teil 3: Fine Dissektion des Innenohrs Sinnesepithelien <ol><li> Die feinen Sezierung kann in einem Tropfen PBS (1x) auf einen sauberen Glasobjektträger durchgeführt werden. </li><li> Entfernen Sie die Utriculardrüsen Otolithen aus dem Utriculus mit zwei Paaren von feinen Pinzette, und, falls gewünscht, schneiden Sie die nicht-sensorische Epithelgewebe und die Innervation der Epithelien mit einer feinen Pinzette und eine Nadel Klinge. </li><li> Entfernen Sie die lagenar Otolithen vor der Trennung saccular und lagenar Epithelien während versuchen, die ganze Sacculus so intakt wie möglich zu halten. Legen Sie das Gewebe in der PBS-drop mit Bauchseite auf. Verwenden Sie die Nadel Klinge sorgfältig zwischen den Sacculus und Lagena geschnitten. Schneiden Sie die übermäßige non-sensorischen Epithel-Gewebe und die innvervation mit feinen Pinzette und Nadel Klinge, falls gewünscht. </li></ol> Teil 4: Fluoreszenzfärbung der Haarzellen in der Sinnesepithelien <ol><li> Spülen Sie den Sinnesepithelien mit PBT (1XPBS und 1% Triton X-100) für 3-mal, jeweils 5 min. </li><li> Inkubieren Sie die Epithelien mit fluophore-markiertem Phalloidin (zB Alexa Flour 488 Phalloidin, 1:1000 verdünnt) für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen Sie den Sinnesepithelien mit PBT für 3-mal, jeweils 10 Minuten Zeit. </li><li> Montieren Sie die Epithelien auf eine Folie mit Eindeckmedium und überprüfen Sie die gefärbten Gewebeschnitten unter dem Fluoreszenz-Mikroskop mit Filtern der richtigen Wellenlänge. </li><li> Nach der erfolgreichen Präparation und Färbung, können intakte Epithelien mit starken Haarzelle Bündel Färbung unter dem Mikroskop (Abb. 1) zu sehen. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1211/fig1.png" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Haarzellen des sackförmigen Sinnesepithel wurden mit Alexa Flour 488 Phalloidin (grün) gefärbt. Die Gewebeprobe wurde seziert und gefärbt wie in der Zeitung erwähnt. Mehrere Bilder wurden an verschiedenen Stellen der Probe entnommen und gefliesten zusammen mit Adobe Photoshop 7.0. Maßstab = 150 um.

In diesem Protokoll beschrieben wir die grobe und feine Zerlegung des Innenohrs Sinnesepithelien der erwachsenen Zebrafisch, die uns Gewebeprobe zur Untersuchung der zellulären und subzellulären Eigenschaften der Sinnesepithelien vorbereiten können. Um die Durchführung einer erfolgreichen Präparation der allererste Schritt, Fixierung, ist sehr wichtig. Stellen Sie sicher, dass Sie immer frisch zubereitet Paraformaldehydlösung weil alte Lösung in unter-Fixierung der Gewebe, die schwer zu währ...

<table><tbody><tr><td>MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 10X)</td><td>Reagenz</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Hard Set Einbettmedium mit DAPI</td><td>Reagenz</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Präparationsmikroskop</td><td>Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Insektennadeln</td><td>Werkzeug</td><td>Feinwissenschaftliche Werkzeuge</td><td>26000-40</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>Werkzeug</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Werkzeug</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>Nadelklinge</td><td>Werkzeug</td><td>Sharpoint</td><td>78-6810</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Mikroskop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>Präparationsunterlage</td><td>Werkzeug</td><td>eNasco</td><td>SB07840M</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafisch</td><td>Tier</td><td>Verschiedene</td><td>n/v</td><td></td></tr></tbody></table>

gross und fine dissection of inner ear sinnesepithelien in adult zebrafisch ( danio rerio)

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensorische Epithelien im Innenohr sind die entscheidenden Strukturen für die Hör-und Gleichgewichtsstörungen Funktionen. Daher ist es wichtig, die zellulären und molekularen Eigenschaften der Epithelien, die vor allem von zwei Arten von Zellen zusammengesetzt sind zu verstehen: Haarzellen (HC) und Stützzellen (SCS). Hier wählen wir an das Innenohr Sinnesepithelien bei erwachsenen Zebrafisch nicht nur studieren, weil der epithelialen Strukturen stark in allen Wirbeltieren studiert konserviert sind, sondern auch, weil die erwachsenen Zebrafisch ist in der Lage, Kohlenwasserstoffe, eine Fähigkeit, die Säugetiere verlieren kurz nach der Geburt zu regenerieren. Wir verwenden das Innenohr von adulten Zebrafisch als Modellsystem, um die Mechanismen des Innenohrs HC Regeneration bei erwachsenen Wirbeltieren, die hilfreich für die klinische Therapie des Hörens / Balance Defizite in der menschlichen als Folge der HC Verlust könnte zu studieren. Hier zeigen wir, wie auf grobe und feine Sezieren des Innenohres Sinnesepithelien bei erwachsenen Zebrafisch zu tun. Der Brutto-Dissektion entfernt die umgebenden Gewebe des Innenohrs und ist hilfreich für die Vorbereitung Gewebeschnitten, die uns die detaillierte Struktur der Sinnesepithelien untersuchen können. Die feinen Sezierung bereinigt die nicht sensorisch-epithelialen Geweben der einzelnen Epithel und ermöglicht es uns, die Heterogenität der ganzen Epithel leicht prüfen, in ganz-mount epithelialen Proben.

Das Innenohr Sinnesepithel der erwachsenen Zebrafisch ist ein gutes Modell für das Verständnis der Mechanismen der Haare Zellregeneration bei erwachsenen Wirbeltieren. Dieses Protokoll zeigt die feinen Sezierung der Epithelien, durch die wir Gewebeproben zur Untersuchung der regenerativen Veranstaltungen auf zellulärer und subzellulärer Ebene können.

Gross und Fine Dissection of Inner Ear Sinnesepithelien in Adult Zebrafisch ( Danio rerio)

Die neurosensorischen Epithelien im Innenohr sind die entscheidenden Strukturen für die Hör- und Gleichgewichtsfunktionen. Daher ist es wichtig, das ... zu verstehen.

Im Innenohr von Zebrafischen gibt es drei Paare sackartiger Endorgane, das Utriculus, das S und das Lana. Der Utriculus liegt am weitesten anterior, während das S und das Lega eng beieinanderliegen und posterior zum Utriculus positioniert sind. Nach der groben Dissektion bleiben das S und das Lega verbunden, und die steinartige Struktur des Otolithen ist in jedem Endorgan bei der anschließenden feinen Dissektion leicht sichtbar. Das S und das Lega werden voneinander getrennt, indem ein Schnitt von der ventralen Seite ausgeführt wird.Die Otolithen werden entfernt und das nichtsensorische Epithelgewebe abgetragen, um das sensorische Epithelgewebe aus allen drei Endorganen zu gewinnen. Hallo, ich bin Jean Leon aus dem Labor von Sean Burgess in der Abteilung Entwicklungs-Genomik des National Human Genome Research Institute. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur feinen und präzisen Dissektion der sensorischen Epithelien des Innenohrs von adulten Zebrafischen.Wir verwenden diesen Prozess in unserem Labor, um die Genexpression in den sensorischen Epitheln des Innenohrs zu untersuchen. Beginnen wir also. Um die Dissektion zu starten, euthanasieren Sie den adulten Zebrafisch mit gepuffer

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Identifizierung und seziert Organe von den erwachsenen Zebrafisch.

Dissection von Organen aus dem Adult Zebrafisch

Dieser Artikel beschreibt einen Ansatz zur Zebrafisch Retina mit und ohne Pigmentepithel angebracht, von einem bis drei Tagen der Befruchtung Embryonen microdissect.

Mikrodissektion von Zebrafisch Embryonale Augentücher

Eine klare, standardisierte Methode zur Präparation und Isolierung des Zebrafisch-Herzen an mehreren Entwicklungsstufen beschrieben sind. Annotation und Quantifizierung Techniken werden ebenfalls diskutiert.

Herz Dissection in Larven, juvenile und adulte Zebrafisch, Danio rerio</em

Der Zweck dieses Videos ist es, Verfahren zur Gewinnung von gesunden, intakten Haarzellen aus den Innenohr Organe ausgewachsener Zebrafisch und dann mit ihnen für Patch-Clamp-Untersuchungen zur Charakterisierung der biophysikalischen Eigenschaften ihrer spannungsabhängigen Kanälen ausgerichtet demonstrieren.

Patch-Clamp-Aufnahmen im inneren Haarsinneszellen Isoliert von Zebrafisch

Dieses Papier beschreibt, wie ein erwachsenen Zebrafisch immobilisiert werden können, intubiert und für in vivo elektrophysiologischen Experimenten verwendet, um Aufnahmen und Manipulation der neuronalen Aktivität in einem intakten Tier zu ermöglichen.

Elektrophysiologische Aufnahme im Gehirn von erwachsenen Zebrafisch Intact

Da viele Zebrafisch-Modellen der neurologischen und nicht-neurologischen Erkrankungen sind in der erwachsenen Fischen nicht der Embryo / Larven untersucht, entwickelten wir eine quantitative Seitenlinie regenerative Assay, die erwachsenen Zebrafisch Krankheitsmodelle angewendet werden können. Der Test beteiligt Beschluss der 1) Neuromasten und 2) einzelne Haarzelle Ebenen.

Ein Test für Laterallinie Regeneration im erwachsenen Zebrafisch

Großskalige 2D-Elektronenmikroskopie (EM) oder Nanotomie ist die gewebeweite Anwendung von EM mit nanoskaliger Auflösung. Hier beschreiben wir eine universelle Methode zur Nanotomie, die zur Untersuchung des Gehirns von Zebrafischlarven in der Gesundheit und bei nicht-invasiven Hirnverletzungen angewendet wird.

Großflächige Raster-Transmissions-Elektronen-Mikroskopie (Nanotomy) gesunder und verletzter cerebra-

Hier präsentieren wir eine standardisierte Reihe von Protokollen, die überlegene okuläre Sulcus zu beobachten eine kürzlich identifiziert, evolutionär konservierte Struktur in den Augen der Wirbeltiere. Verwendung von Zebrafischlarven zeigen wir Techniken notwendig, Faktoren zu identifizieren, die auf die Gründung und Schließung der überlegenen okuläre Sulcus beitragen.

Visualisierung von der okulären Sulcus Superior in der Embryogenese Danio rerio

Hier präsentieren wir eine Protokoll, die die Messung von Licht evozierten Elektroretinogramm Antworten von Larven Zebrafisch vereinfacht. Eine neuartige kegelförmige Schwamm-Tip Elektrode kann dazu beitragen, das Studium der visuellen Entwicklung im Larvenstadium Zebrafisch mit Elektroretinogramm ERG mit einfacher zuverlässige Ergebnisse und geringere Kosten.

Elektroretinogramm Aufnahme im Larvenstadium Zebrafisch mit A Roman kegelförmigen Schwamm-Tip Elektrode

Ein mechanisches Hirnverletzungsmodell im erwachsenen Zebrafisch wird beschrieben, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die ihre hohe Regenerationsfähigkeit regulieren. Die Methode erklärt, wie eine Stichwundenverletzung im optischen Tectum mehrerer Arten kleiner Fische erzeugt wird, um die regenerativen Reaktionen mittels fluoreszierender Immunfärbung zu bewerten.

Stichwundenverletzungsmodell des adulten optischen Tektums unter Verwendung von Zebrafisch und Medaka zur vergleichenden Analyse der Regenerationsfähigkeit

Der Artikel erklärt, wie man Augen von lebenden Zebrafischlarven chirurgisch entfernt, als ersten Schritt zur Untersuchung, wie der retinale Input das Wachstum und die Entwicklung des optischen Tektums beeinflusst. Darüber hinaus enthält der Artikel Informationen über Larvenanästhesie, Fixierung und Hirndissektion, gefolgt von Immunhistochemie und konfokaler Bildgebung.

Augenentfernung in lebenden Zebrafischlarven zur Untersuchung des innervationsabhängigen Wachstums und der Entwicklung des visuellen Systems

Lernen Sie die Feinpräparation von Innenohr-Sinnesepithelien bei adultem Zebrafisch (Danio rerio). Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Haarzellregeneration und regenerativen Prozessen bei Wirbeltieren.

Gross und Fine Dissection of Inner Ear Sinnesepithelien in Adult Zebrafisch ( Danio rerio)

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