Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie
1. April 2009
In diesem Video zeigen wir eine Methode, mit der sich entwickelnden Gehirn Wirbeltiere in Live Zebrafischembryonen bei einzelnen Zelle Auflösung durch konfokale Mikroskopie zu analysieren. Dazu gehört auch die Methode, mit der wir spritzen die Single-Cell-Zebrafischembryo und anschließend montieren und Bild das sich entwickelnde Gehirn.
Dieses Verfahren beginnt mit der Injektion eines einzelligen Zebrafisch-Embryos, der in einer Spritzform positioniert ist, sodass die Zelle von der Injektionsvorrichtung weg ausgerichtet ist. Die Embryonen werden dann mit MRNA injiziert, wobei die Nadel durch das Eigelb in die Zelle gelangt. Am nächsten Tag.
Ein Kunststoffmontageverschluss ist mit Aros gefüllt. Ein anästhesierter Embryo wird dann invertiert in ein Loch im Aros gelegt, das mit einer konfokalen Mikroskopie abgebildet wird. Hallo, ich bin Grabham aus dem Labor von Dr. Hazel Sieve am Whitehead Institute for Biomedical Research und der Biologieabteilung am MIT.
Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Injektion von Zebrafisch-Embryonen im Einzelzellstadium und die anschließende Live-Bildaufnahme des Gehirns mittels Konfokalmikroskopie. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Gehirnmorphogenese von Wirbeltieren in Einzelzellauflösung zu untersuchen. Also lasst uns loslegen.
Die in diesem Verfahren verwendete mRNA wird von einem membrangebundenen GFP transkribiert, das C-A-X-E-G-F-P-R-N-A-A membrangebundenes GFP codiert. Zunächst linearisiert man das Plasmid durch Verdauung ohne eines, dann transkribiert man die Membran-GFP-mRNA vom linearisierten Plasmid mit Hilfe der M-Nachricht und des Maschinensets, nachdem die mRNA transkribiert wurde, wobei die resultierende mRNA und das Wasser quantifiziert auf ein Mikrogramm pro Mikroliter quantifiziert wird, Eloqua verwenden und bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis es nötig ist. Am Tag vor der Injektion wird Paarungskäfige aufgebaut, wobei die Männchen am Tag der Injektion von den Weibchen getrennt werden. Verwenden Sie ein Setter Instrument Micropipet Polar, um Kapillarnadeln für die Injektion zu ziehen.
Bereite am Tag der Injektion eine Spritzform mit 1 % AGA auf, die Bahnen in der Embryo-Breite im Ein-Zell-Stadium vorbereiten, taue ein Aliquot der Membran-GFP-mRNA mit einer Konzentration von einem Mikrogramm pro Mikroliter auf Eis auf. Verdünnen Sie die mRNA von einem bis fünf in Wasser auf eine Endkonzentration von 200 Nanogramm pro Mikroliter und lassen Sie sie auf Eis. Beladen Sie die Kapillarnadel mit einem Mikroliter vorbereiteter Membran, GFP-mRNA bei 200 Nanogramm pro Mikroliter.
Hier fügen wir der mRNA 0,05 % Phenolrot hinzu, um sie für Injektionen sichtbar zu machen. Stecke die geladene Nadel in einen Mikromanipulator, der an einen gasbetriebenen Mikroinjektor angeschlossen ist. Stellen Sie das Injektionsvolumen auf einen Nanoliter ein.
Als Nächstes ziehen Sie die Trennwände der Wildfische, die vom Vortag in Paarungskäfigen aufgestellt sind. Sammeln Sie die Embryonen sofort ein, sobald sie gelegt sind. Füllen Sie die AGA-Rosenspritzform mit Embryomedium und orientieren Sie die Embryonen in der Form mit einer einzelnen Zelle auf der Seite abseits des Mikromanipulators.
Injizieren Sie durch das Corion und die Eigelbe, sodass die mRNA direkt in die einzelne Zelle abgelagert wird. Injizieren Sie etwa 50 Embryonen pro Experiment. Wenn sich die Zelle jedoch geteilt hat, sollte nach der Injektion der Embryonen nicht injiziert werden, sondern über Nacht bei 28 Grad Celsius im Embryomedium inkubiert werden.
Nach der Übernachtung sind die injizierten Embryonen bereit für die Montage und Bildgebung. Um dieses Verfahren zu beginnen, entnehmen Sie das Corion mit einer Pinzette unter einem Stereomikroskop eine Stunde vor dem gewünschten Zeitpunkt aus den Embryonen und bereiten Sie einen Objektträger vor, um bis zu vier Embryonen zu montieren. Dann fülle den Slide mit 0,7 % Aros bis zum oberen Rand und warte etwa 20 Minuten oder bis der Aros fest ist.
Sobald der Aros verfestigt ist, machen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze ein kleines Loch in die Aeros, um zylindrische Löcher zu bilden, in die jeder Embryo montiert werden kann. Entferne die Aros-Plugs mit der Pinzette, bevor du sie montierst. Legen Sie die Embryonen auf das mit Aeros gefüllte Objektträger unter ein Sezierungsmikroskop.
Fügen Sie 50 Mikroliter Trica zur Betäubung hinzu. Die Embryonen. Verwenden Sie eine Pinzette, um die umgekehrten Embryonen in den zylindrischen Löchern im Aros zu orientieren, wobei das Gehirn oder der Interessensbereich gegen die darunterliegende Abdeckung liegt.
Die Embryonen im AGA stiegen mit einem weiteren Deckungsschlepper auf und sicherten sie mit Silikon-Vakuumfett. Die Embryonen sind jetzt für die Bildgebung bereit. Bilde den Embryo mit einem invertierten fluoreszierenden Laser-Scanning-Konfokalmikroskop ab, wie hier gezeigt, oder mit einem rotierenden Scheiben-konfokalen Mikroskop bei 63x oder mehr, um hochauflösende Bilder einzelner Zellen im Neuroepithel zu sammeln.
Bilder werden als TIF-Dateien aus der LSM-Software exportiert und mit Photoshop analysiert. Dies ist ein repräsentatives konfokales Bild eines 24-Stunden-Zebrafisch-Embryos, des Neuroepithels zwischen Mittelhirn- und Hinterhirnventrikel. M steht für das Mittelhirn, den Ventrikel und H für den Hinterhirnventrikel.
Jede Zelle ist mit einem membrangebundenen GFPE gekennzeichnet. Wir haben gerade eine Technik demonstriert, mit der man das sich entwickelnde Zebrafisch-Gehirn als Einzelzellauflösung analysieren kann. Diese Technik hat es uns ermöglicht, eine neuartige Art der Zellformänderung namens BA-Basalverengung zu untersuchen.
Es könnte auch zur Analyse anderer Arten von Phänomenen verwendet werden, um unser Verständnis der Organogenese der Wirbel sowie der zugrunde liegenden Zellbiologie erheblich zu erweitern. Das war's also. Danke fürs Zuschauen und viel Erfolg bei deinen Experimenten.
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Übersicht
Dieses Video demonstriert eine Methode zur Analyse des sich entwickelnden Wirbeltiergehirns in lebenden Zebrafisch-Embryonen mit Einzelzellauflösung mittels konfokaler Mikroskopie. Der Prozess umfasst das Injizieren des Zebrafisch-Embryos und anschließendes Montieren und Abbilden des sich entwickelnden Gehirns.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Bildgebungstechniken
Hintergrund
- Zebrafische sind ein Modellorganismus für die Untersuchung der Wirbeltierentwicklung.
- Konfokale Mikroskopie ermöglicht eine hochauflösende Bildgebung lebender Gewebe.
- Einzelzellanalyse liefert Einblicke in die zelluläre Entwicklung und Differenzierung.
- Diese Methode kann auf verschiedene Studien in der Entwicklungsbiologie angewendet werden.
Ziel der Studie
- Visualisierung des sich entwickelnden Gehirns in Zebrafisch-Embryonen.
- Demonstration einer Technik für Einzelzellauflösungsbildgebung.
- Verbesserung des Verständnisses der Wirbeltiergehirnentwicklung.
Verwendete Methoden
- Injektion von mRNA in einzelne Zebrafisch-Embryonen.
- Verwendung eines Kunststoffmontageträgers für die Bildgebung.
- Konfokale Mikroskopie für hochauflösende Bildgebung.
- Positionierung der Embryonen in einer Injektionsform für optimale Ausrichtung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Injektion von mRNA in Zebrafisch-Embryonen.
- Hochauflösende Bilder des sich entwickelnden Gehirns erhalten.
- Demonstration der Machbarkeit von Live-Bildgebungstechniken.
- Einblicke in das zelluläre Verhalten während der frühen Entwicklung.
Schlussfolgerungen
- Die Methode ermöglicht eine detaillierte Beobachtung der Gehirnentwicklung bei Zebrafischen.
- Einzelzellauflösungsbildgebung ist mit konfokaler Mikroskopie möglich.
- Diese Technik kann für weitere Studien in der Entwicklungsneurowissenschaft genutzt werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Live imaging of the zebrafish embryonic brain enables high-resolution visualization of cellular dynamics during neural tube morphogenesis, providing a disease-relevant system for studying vertebrate brain development. This approach supports target validation and mechanistic de-risking by allowing direct observation of cell shape changes and rearrangements critical to organogenesis. The method enhances predictive confidence in preclinical models by linking subcellular behaviors to structural outcomes in a transparent, genetically tractable system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct visualization of membrane-bound protein dynamics in developing neuroepithelium.
- Operational Value: Supports biological de-risking by linking cytoskeletal mechanisms to tissue-level morphogenetic events.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline morphogenetic benchmarks.
- Operational Value: Promotes assay standardization through reproducible embryo mounting and inversion protocols.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers disease-relevant system alignment by capturing conserved mechanisms of vertebrate brain folding applicable to human neural tube defects.
- Operational Value: Facilitates translational biomarker alignment through quantifiable readouts of cell shape changes such as basal constriction.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing single-cell resolution data that informs target confidence prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time observation of cell behaviors in intact tissues.
- Screening: Enhances assay readiness through standardized production of fluorescently labeled embryos suitable for time-lapse analysis.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements via fluorescence intensity and spatial tracking of GFP-labeled membranes.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling conserved morphogenetic processes across vertebrate species.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for neurodevelopmental screening due to embryo transparency and external development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in brain morphogenesis pathways.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized injection volumes, mounting orientation, and imaging parameters.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by enabling early detection of phenotypic anomalies in developing tissues.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by linking cellular phenotypes to structural outcomes in a high-fidelity model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection techniques and embryonic staging.
- Dependent on confocal microscopy infrastructure with 63x or higher objective capabilities.
- Necessitates standardization across teams for embryo handling, anesthesia timing, and mounting consistency.
- Involves adaptation considerations when extending to other brain regions or developmental stages beyond 18–24 hpf.
- Limited by imaging depth of 80–100 μm, restricting analysis of deeper brain structures.
