Name: Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Erfahren Sie die Live-Bildgebung des sich entwickelnden Zebrafisch-Gehirns mit konfokaler Mikroskopie in Einzelzellauflösung. Diese Methode ermöglicht detaillierte Studien zur Wirbeltier-Hirnmorphogenese.

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Vielen Dank an Dr. Jennifer Gutzman, die als erste entwickelt diese Technik in der Sive Labor. Danke auch an JB Green am Dana-Farber Cancer Institute Boston, MA, die uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt das Plasmid kodiert CAAX-GFP mRNA. Die konfokale Bildgebung wurde an der WM Keck Foundation Biological Imaging Facility am Whitehead durchgeführt. HS wird durch NIHMH70926 unterstützt. EG wird durch einen NSF pre-Stipendium unterstützt.

1. Vorbereitung der mRNA für die Injektion <ol><li> Die mRNA in diesem Verfahren verwendet wird, aus einem Plasmid kodiert CAAX-eGFP (memGFP) mRNA transkribiert. Erste Linearisierung des Plasmids nach Gutzman et al, 2008. </li><li> Dann transkribieren memGFP mRNA mit der mMessage mMachine Kit. </li><li> Verdünnen Sie die resultierende mRNA zu 1μg/μl aliquotieren und bei -80 ° C. </li><li> Bereiten Sie ein Spritzgießwerkzeug von 1% Agarose mit Gassen der Breite des Embryos auf der einen Zell-Stadium. </li><li> Am Tag vor der Injektion, Einrichten Paarung Käfige trennen das Männchen vom Weibchen. </li><li> Am Tag der Injektion, ziehen Kapillare Nadeln mit einer Mikropipette Abzieher, um die Injektion vorzubereiten. </li></ol> 2. Injektion der mRNA <ol><li> Am Tag der Injektion, Tauwetter ein Aliquot 1μg/μl memGFP mRNA auf Eis. </li><li> Verdünnen Sie die mRNA 1:5 in Wasser zu einer Endkonzentration von 200ng/μl, und halten Sie auf dem Eis. </li><li> Laden Sie die Kapillarnadel mit 1μl präparierte memGFP mRNA bei 200ng/μl. </li><li> Ort geladen Nadel in einem Mikromanipulator an einem gasbetriebenen Mikroinjektor. </li><li> Passen Sie das Injektionsvolumen zu 1NL. </li><li> Ziehen Sie die Trennwände auf Wildtyp-Fisch in Käfige Paarung vom Vortag eingestellt. </li><li> Sammeln Sie die Embryonen, sobald sie festgelegt sind. Orient ihnen in der Agarose Spritzgießwerkzeug durch Embryo Medium (Westerfield, 1995) mit dem einzigen Zelle auf der abgewandten Seite der Mikromanipulator abgedeckt. </li><li> Inject durch das Chorion und Dotter, so dass die mRNA direkt in die einzelne Zelle abgelagert. Inject ca. 50 Embryonen pro Versuch. Spritzen Sie sich nicht, wenn die Zelle geteilt. </li><li> Inkubieren Embryonen bei 28 ° C über Nacht in Embryo-Medium </li></ol> 3. Montage-und Imaging Embryos <ol><li> Zur Montage und Bild die Embryonen, entfernen Sie das Chorion mit einer Pinzette aus der Embryonen unter dem Stereomikroskop 1 Stunde vor der Zeit in der Umgebung. </li><li> Bereiten Sie eine Rutsche für die Montage von bis zu 4 Embryonen. <ul><li> Verwenden Sie Silikon-Vakuum-Fett auf einem Deckglas auf der Unterseite ein speziell entwickeltes 2mm dicke Kunststoff-Folie mit einem Loch ca. 1 cm im Durchmesser zu versiegeln. </li><li> Füllen Sie das Loch in der Folie mit 0,7% Agarose, und lassen Sie stehen etwa 20 Minuten oder bis gehärteten </li><li> Nachdem die Agarose erstarrt ist, entfernen Sie einen kleinen Stecker mit 200 ul Pipettenspitzen zylindrische Löcher bilden, in dem jeder Embryo montieren zu. </li></ul></li><li> Legen Sie die Embryonen auf die Agarose gefüllten Objektträger unter einem Binokular. Add 50 ul Tricaine (Westerfield, 1995), die Embryonen zu betäuben. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um die Embryonen in die zylindrische Löcher in die Agarose mit dem Gehirn oder der Region von Interesse gegen die zugrunde liegende Deckglas Position. </li><li> Decken Sie die Embryonen in die Agarose mit einem anderen Deckglas mit Silikon Vakuumfett gesichert. </li><li> Bild des Embryos mit einem umgekehrten, Neonlicht, Laser-Scanning-oder Spinning-Disk-konfokalen Mikroskop. Bild bei 63x oder höher, um Bilder mit hoher Auflösung einzelner Zellen innerhalb der Neuroepithel sammeln. </li><li> Die Bilder werden als TIFF-Dateien aus dem LSM-Software exportiert und analysiert mit Hilfe von Photoshop. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse / Outcome In Abbildung 1 ist eine repräsentative konfokale Abbildung eines 24 hpf Zebrafisch Neuroepithel zwischen dem Mittelhirn und Rautenhirn Ventrikel. Jede Zelle ist mit Membran-gebundenen GFP-markierten. <img src="/files/ftp_upload/1217/1217fig1.jpg" alt="" width="450" height="449"> Abbildung 1. Live-konfokale Abbildung eines memGFP injiziert 24 hpf Zebrafischembryo. (A) Neuroepithel eines 24 hpf Embryo mit jeder Zelle durch GFP skizziert. Region abgebildet trennt das Mittelhirn und Hinterhirn Ventrikel (M, H bzw.), bildet das Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze.

<ol><li>Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+zebrafish+midbrain-hindbrain+boundary+constriction+requires+laminin-dependent+basal+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction.</a> Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+a+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish%22">The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish</a>. , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).</li>
</ol>

In diesem Video zeigen wir eine Methode zur mRNA-Injektion in einzelne Zelle Zebrabärblinge. Hier verwenden wir mRNA eine Membran gezielte GFP zu jeder Zelle Label. Wir haben dann gezeigt, wie die Montage und Bild das sich entwickelnde Gehirn in einzelnen Zelle Auflösung. Diese Technik hat uns erlaubt, eine neue Art von Zelle Form zu ändern, basale Einschnürung, für die Bildung der Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze (Gutzman et al, 2008) erforderlich studieren. Ähnliche Analyse von anderen Phänomenen hat das Potenzial, deutli...

<table><tbody><tr><td>SeaKem GTG Agarose</td><td> Reagenz</td><td>Lonza Inc.</td><td>50027</td><td></td></tr><tr><td>3-Aminobenzoesäureethylester (Tricaine)</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Kapillarrohre</td><td>Werkzeug</td><td>Frederick Haer und Co.</td><td>30-30-1</td><td>Borosil 1,0 mm Außendurchmesser × 0,5 mm Innendurchmesser/Faser 100 mm</td></tr><tr><td>Vakuumsilikonfett</td><td>Reagenz</td><td>VWR international</td><td>W0S717</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Werkzeug</td><td>Fine Science Tools</td><td>11232-20</td><td>Dumont #5 Bio Inox</td></tr><tr><td>1–200 &amp;mu;l Pipettenspitzen</td><td>Werkzeug</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>111-0806</td><td>Diese haben die richtige Größe für 24 hpf-Embryonen.</td></tr><tr><td>mMessage mMachine Transkriptionskit</td><td>Reagenz</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>SP6-RNA-Polymerase</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Scanning-Konfokalmikroskop</td><td>Mikroskop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Werkzeug</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektor</td><td>Werkzeug</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenzieher</td><td>Werkzeug</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

live-imaging der zebrafisch embryonalen gehirn durch konfokale mikroskopie

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In diesem Video zeigen wir die Methode unserem Labor entwickelt, um die Zellform Änderungen und Umstellungen erforderlich zu biegen und falten Sie die Entwicklung von Zebrafisch Gehirn (Gutzman et al, 2008) analysiert hat. Eine solche Analyse bietet ein neues Verständnis der zugrunde liegenden Zellbiologie für die Entwicklung der 3D-Struktur von Gehirn der Wirbeltiere erforderlich und erhöht unsere Fähigkeit, Neuralrohr Morphogenese zu studieren. Die embryonalen Zebrafisch Gehirn ist so geformt, Beginn 18 Stunden nach der Befruchtung (HPF) als die Ventrikel im Neuroepithel aufzublasen. Bis zum 24. hpf, sind die ersten Schritte von Neuralrohrdefekten Morphogenese abgeschlossen. Mit der hier beschriebenen Methode, werden Embryonen auf der einen Zell-Stadium mit mRNA Membran gezielte grün fluoreszierende Protein (memGFP) injiziert. Nach der Injektion und Inkubation des Embryos, die jetzt zwischen 18 und 24 HPF, montiert ist, invertiert, in Agarose und abgebildet durch konfokale Mikroskopie. Bemerkenswert ist, dass der Zebrafisch-Embryos transparent machen ihn zu einem idealen System für Fluoreszenz-Bildgebung. Während unsere Analysen auf das Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze und die Hinterhirn konzentriert haben, könnte diese Methode für die Analyse von jeder beliebigen Region der Zebrafisch zu einer Tiefe von 80-100 mu m verlängert werden.

In diesem Video zeigen wir eine Methode, mit der sich entwickelnden Gehirn Wirbeltiere in Live Zebrafischembryonen bei einzelnen Zelle Auflösung durch konfokale Mikroskopie zu analysieren. Dazu gehört auch die Methode, mit der wir spritzen die Single-Cell-Zebrafischembryo und anschließend montieren und Bild das sich entwickelnde Gehirn.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

In diesem Video demonstrieren wir die von unserem Labor entwickelte Methode zur Analyse der Zellformänderungen und Umstrukturierungen, die für das Beugen und Falten des ... erforderlich sind.

Dieses Verfahren beginnt mit der Injektion eines Einzelzell-Zebrafischembryos, der in einer Injektionsform so positioniert ist, dass sich die Zelle von der Injektionsvorrichtung weg orientiert. Anschließend werden die Embryonen mit mRNA injiziert, wobei die Nadel durch das Eigelb hindurch in die Zelle vordringt. Am nächsten Tag.Eine Kunststoff-Montierungsplatte wird mit Aros gefüllt. Ein anästhesierter Embryo wird dann umgekehrt in eine Vertiefung im Aros platziert und mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet. Hallo, ich bin Grabham aus dem Labor von Dr. Hazel Sive am Whitehead Institute for Biomedical Research und der Biologieabteilung des MIT.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Injektion von Zebrafischembryonen im Einzelzellstadium und die anschließende Live-Bildgebung des Gehirns mittels konfokaler Mikroskopie. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Morphogenese des Wirbeltiergehirns auf Einzelzellauflösung zu untersuchen. Beginnen wir also.Die in diesem Verfahren verwendete mRNA wird aus einem Plasmid transkribiert, das das membrangebundene GFP C-A-X-E-G-F-P-R-N-A-A codiert. Linearisieren Sie das Plasmid zunächst durch Verdauung mit not one und transkribi

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt Abbildung von einzelnen Neuronen oder Neuralleistenzellen in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode wird verwendet, um zelluläre Verhaltensweisen und Aktin-Lokalisierung mittels Fluoreszenz konfokalen Zeitraffer-Mikroskopie zu untersuchen.

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

Schlüssel zum Verständnis der morphogenetischen Prozesse, die der frühe Embryo Form ist die Möglichkeit, Bild-Zellen in hoher Auflösung. Wir beschreiben hier eine Methode zur Kennzeichnung einzelner Zellen oder kleine Gruppen von Zellen in ganzen Zebrafisch-Embryos mit Membran-bezogene Green Fluorescent Protein.

Labeling und Imaging Cells in der Zebrafisch Hinterhirn

Die vorliegende Video zeigt eine Methode, die nutzt die Kombination von Elektroporation und konfokale Mikroskopie, um Live-Aufnahmen zu den einzelnen neuronalen Vorläuferzellen im sich entwickelnden Zebrafisch Vorderhirn führen.

Zeitraffer-Live-Imaging von klonal verbundenen neuronalen Vorläuferzellen in der Entwicklung von Zebrafisch Vorderhirnneuronen

Imaging von zerebrovaskulären Entwicklung in Zebrafisch-Larven beschrieben. Techniken zur 3D-Bildgebung zu erleichtern und zu ändern zerebrovaskuläre Entwicklung mit chemischen Behandlungen sind ebenfalls vorhanden.

Imaging und 3D-Rekonstruktion der zerebrovaskuläre Strukturen in embryonalen Zebrafisch

Die Abbildung des dynamischen Verhaltens von Organellen und anderen subzellulären Strukturen in vivo kann Aufschluss über ihre Funktion unter physiologischen und Krankheitsbedingungen geben. Hier stellen wir Methoden vor, mit denen zwei Organellen, Zentrosomen und Mitochondrien, genetisch markiert und ihre Dynamik in lebenden Zebrafischembryonen mittels Weitfeld- und Konfokalmikroskopie abgebildet werden können.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

Hier präsentieren wir eine vielseitige Einbettungsmethode, die die Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung der hinteren Körperentwicklung von lebenden Zebrafischembryonen ermöglicht, ohne die normale Entwicklung zu stören.

Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung

In vivo Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die zellulären Mechanismen zugrunde liegenden Entwicklung des Nervensystems zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Technik zur Verwendung von Zeitraffer-Konfokalmikroskopie, um eine große Anzahl von mehrfarbigen Brainbow-markierten Zellen in Echtzeit innerhalb des sich entwickelnden Zebrafischnervensystems zu visualisieren.

Visualisierung des sich entwickelnden Gehirns bei lebenden Zebrafischen mit Brainbow und Zeitraffer-Konfokalbildnis

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur In-toto-Markierung und mehrdimensionalen Bildgebung der frühen Augenentwicklung von Zebrafischen. Wir beschreiben die Markierung, Einbettung und vierdimensionale (4D) Bildgebung mit hilfe der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie und Überlegungen zur Optimierung der Erfassung von Datensätzen zur Sezierung von Mechanismen der optischen Cup-Morphogenese.

4-dimensionale Bildgebung der Zebrafisch-Optikbecher-Morphogenese

Hier wird ein Protokoll für die in vivo Ganzhirnbildgebung von Zebrafischlarven mittels dreidimensionaler Fluoreszenzmikroskopie vorgestellt. Das experimentelle Verfahren umfasst die Probenvorbereitung, die Bildaufnahme und die Visualisierung.

Im lebenden Organismus Ganzhirnbildgebung von Zebrafischlarven mittels dreidimensionaler Fluoreszenzmikroskopie

Wir demonstrieren eine Methode, die die Vorteile der schnellen konfokalen Rastermikroskopie nutzt, um Live-Bildgebung von Mikrogliazellen im sich entwickelnden optischen Tectum des Zebrafisches durchzuführen und so die Dynamik dieser Zellen in vivo zu analysieren.

Live-Bildgebung und Charakterisierung der Mikroglia-Dynamik im Zebrafischembryo

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, um die neuronale Aktivität in Gehirnregionen transgener Zebrafische, die GCaMP-Kalziumindikatoren exprimieren, mittels konfokaler Mikroskopie zu untersuchen.

Im lebenden Organismus Konfokale Fluoreszenzbildgebung der durch sensorische Stimulation induzierten neuronalen Aktivität bei teilweise gefesselten Zebrafischlarven

Erfahren Sie die Live-Bildgebung des sich entwickelnden Zebrafisch-Gehirns mit konfokaler Mikroskopie in Einzelzellauflösung. Diese Methode ermöglicht detaillierte Studien zur Wirbeltier-Hirnmorphogenese.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

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