Name: Focal Ca 2 + Transient-Erkennung in der glatten Muskulatur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 41 s
Description: Lernen Sie die hochauflösende Ca²⁺-Bildgebung in glatter Muskulatur isolierter Organe. Diese Methode ermöglicht die Analyse neurotransmittervermittelter Signale und liefert ein validiertes Protokoll für die physiologische Forschung.

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Der Wellcome Trust finanziell unterstützt (VIP Award JSY und 074128 Research Fellowship an KLB). Medical Research Council Stipendium an RJA Leica_SP2_Stacker, ein Algorithmus verwendet, um TIFFs für den &quot;Wiederaufbau&quot; in eine Reihe zu importieren, ist auf Leica_tiff_sequence, ein Plugin für das Lesen Leica SP2 TIFFs in ImageJ, von Tony Collins entwickelt und verwendet mit seiner Erlaubnis basiert. ( <a href="http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html">http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html</a> ) StackReg und TurboReg werden Algorithmen verwendet, um für die Bewegung des Gewebes zu korrigieren, auf Th venaz und Kollegen (1998) 9 basiert. Excel_writer.jar wurde von Kurt De Vos (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html) geschrieben. JNCT0.08JoVE.ijm, die Partikel Algorithmus, basiert auf einem Algorithmus von KL Gehirn schriftlich und detailliert bisher 5 basiert.

Teil 1: Vorbereitung der Ca 2 +-Indikator (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM) <ol><li> Oregon Green 488 BAPTA-1.00 kommt in 500 ul Fläschchen als eine kleine Menge (50 g) Pulver. Zugabe von 40 ul Pluronic F-127-Lösung, um das Pulver unter leichtem Schütteln für 30 s, dann fügen Sie 460 ul PSS, und leicht schütteln für 30 s. Die endgültige Lösung bietet 10 uM Oregon Green 488 BAPTA-1 AM, 4 x 125 ul Aliquots. Vor Lichteinwirkung und bei -20 C. </li></ol> Teil 2: Ca 2 + loading <ol><li> Entfernen Sie die Ca 2 +-Indikator (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM) aus dem (-20 C) Gefrierschrank und lassen Sie sie bei Raumtemperatur auftauen lassen. </li><li> Nehmen Sie 1 ml der PSS in einem Reagenzglas und in Wasserbad. Bubble mit 95% O 2 / 5% CO 2 bei einer Rate von etwa 1 Blase erscheinen pro Sekunde. Die Bubbler muss in das Reagenzglas mit einem Stopfen oder mit Parafilm zB gesichert werden. </li><li> Präparieren Sie die Gewebe aus der Tier-und in einer Sylgard gesäumten Petrischale vorsichtig Bindegewebe. Unabhängig von der glatten Muskulatur Orgel Art, sollte PSS alle 10 Minuten ersetzt werden und Gewebe sollte gut gewaschen werden (zB durch den Austausch des PSS dreimal) folgende Zerlegung. Für die Samenleiter: Betrachten Sie schneiden die Orgel Länge-Möglichkeiten, um ein Blatt Gewebe zu erzeugen. Für die Harnblase: open in Längsrichtung von der Blasenhals (posterior) an die Spitze der Kuppel (anterior). Bereiten Sie vier Streifen, von 6 bis 8 mm lang und 1 bis 2 mm breit, entlang der dorsalen Oberfläche des Detrusor, Schneiden in die Richtung des dominanten Muskelbündel. </li><li> Legen Sie sezierten Gewebes in der &quot;vorgewärmt und sprudelte &#39;PSS. </li><li> Add 125 ul 10 uM Oregon Green 488 BAPTA-1 AM, um das Reagenzglas und gib ein wenig zu schütteln, von Hand zu mischen. </li><li> Fortsetzen Blasenbildung und verlassen, mit Folie abgedeckt. Die Zeit ist dauert genügend Gewebe für die Aufnahme der Ca 2 +-Indikator variiert mit der Größe des Gewebes und die Dicke der glatten Muskulatur. Zum Beispiel: 70 min (Maus Detrusor, Ratte anococcygeus) bis 120 Minuten (Ratte Detrusor, Maus Samenleiter). </li></ol> Teil 3: Vorbereiten des &#39;Ca 2 + geladen &quot;Gewebe für die Mikroskopie Sorgfältige Pinning des Gewebes ist notwendig, um spontane Bewegung des Gewebes (eine Eigenschaft der Abbildung von glatten Muskelzellen aus relativ intaktes Gewebe) zu minimieren und die Lage eines geeigneten Standortes für die Bildgebung (wie ein flaches Stück Gewebe kann zu erleichtern notwendig befragten in zwei Dimensionen statt drei). <ol><li> Spülen Sie das Gewebe in sprudelte PSS für mindestens 5 Minuten. </li><li> Berg in Sylgard gesäumten Vorbereitung Teller, Dehnung der Gewebe (leicht) zu einer flachen Schicht bilden. Verwenden Sie keine langen &quot;Pins&quot;, dass das Ziel kratzen kann, verwenden Sie stattdessen kurze Längen von 25-50 Mikrometer Durchmesser Silberdraht als &quot;Stifte&quot; und legen Sie in einem Winkel. </li><li> Position der Vorbereitung Schüssel auf dem Mikroskoptisch, wobei darauf geachtet, um sicherzustellen, dass die PSS nicht von der Sylgard gesäumten Bereich der Schale escape (da dies zu einer großen Fläche in PSS, wenn die Superfusion beginnt abgedeckt Blei). </li><li> Schalten Sie die Pumpe, um die Vorbereitung mit PSS superfuse. Eine Rate von 100 ml pro Stunde wird oft verwendet. </li><li> Schalten Sie das Heizgerät. </li><li> Legen Sie die Zu-und Abfluss Rohre und Temperaturfühler an der Vorbereitung Schale (Befestigung eines jeden auf das Metallband durch den Magneten auf ihrer Basis). Die Höhe der Spitze des Ablassrohr bestimmt die Tiefe des PSS. Achten Sie darauf, dass der Ausfluss ist eigentlich das Entfernen PSS (wie es manchmal zunächst nicht). </li><li> Stellen Sie die Temperatur auf dem Heizgerät auf die gewünschte Temperatur, z. B. 33-35 C erreichen </li><li> Lassen Sie das Gewebe für mindestens 10 Minuten ausgleichen. </li></ol> Teil 4: Auswahl von Ort zu Bild Die Exposition gegenüber Anregungsbeleuchtung wird der Indikator photobleach, so vermeiden Sie die Verwendung für mehr als ein paar Sekunden zu einer Zeit. <ol><li> Mit einem Low-Power-Objektiv (10x oder 20x) zu verwenden Epifluoreszenz, spannend mit einem blauen Licht, um die glatte Muskulatur ansehen und identifizieren eine geeignete Region zu überwachen. Versuchen Sie, eine Website basierend auf Pick: Bewegung (die sollte minimal sein) und die Anzahl der glatten Muskelzellen in das Feld ein. Helle &quot;Strukturen&quot; kann eine hohe Anzahl von &quot;false positives&quot; in das Bild Erkennungsalgorithmus verursacht, so vermeiden mit einer großen Anzahl von (zB) durchsetzt Epithelzellen oder Fibroblasten. </li><li> Wechseln Sie zu einer höheren Macht Ziel (40x). </li><li> Drehen der Bühne oder der optischen Achse, so dass die glatten Muskelzellen (s) liegt horizontal (dh parallel zur schnellen Scan-Achse). </li></ol> Teil 5: Die konfokale Mikroskopie Die Details, wie die konfokale Mikroskop &#39;set up &quot;sind spezifisch für jeden Mikroskop-Typ, aberdie wichtigsten Überlegungen sind: Geschwindigkeit (mindestens 5 Hz ist für die meisten Ca 2 +-Transienten erforderlich); Auflösung und Größe des Feldes (die beide gehandelt werden-off mit Geschwindigkeit). Einige der folgenden Protokoll ist spezifisch für eine Leica SP2 aufrecht konfokalen Mikroskop. Ein typisches Protokoll: 100 Frame-Serie, bei 5 Hz (256 x 256 Pixel, ca. 100 x 100 um.) Erworben oder 13,5 Hz (256 x 64 Pixel, ca. 100 x 25 um.). Der Tastkopf eingestellt bidirektional verschieben (zum Erwerb Geschwindigkeit maximieren) und erwerben bei 1000 Hz pro Zeile. <ol><li> Schließen Sie das Loch mit einem &quot;luftigen disk &#39;. </li><li> Stellen Sie den Laser (488 nm) Leistung zwischen 25 und 35% auf den AOTF, dieser Wert ist ein Trade-off zwischen Helligkeit und Ausbleichen. (Letzteres ist ein besonderes Problem bei langen Aufnahmen.) </li><li> Erwerben sechs Serien pro Standort, und 4-6 Seiten pro &quot;Behandlung&quot;. Es ist üblich, in Zukunft den gleichen sechs Standorten pre-Medikament (das heißt &quot;Kontrolle&quot;) und Post-drug-Monitor, obwohl signifikante Bleichen kann der Experimentator von dieser abweichen. </li><li> Es ist wichtig, mit Ca 2 +-Imaging, die &quot;Zeit Kontrollen&quot; durchgeführt werden. </li></ol> Teil 6: Vorbereitung für die Analyse <ol><li> Downloaden und installieren Sie Image J aus: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Laden Sie die Plattform-spezifische Version, und aktualisieren Sie dann auf die neueste Version durch Herunterladen der neuesten imageJ.jar Datei von http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar und ersetzt die alte Datei. Apple Mac Benutzer: wenn es langsam läuft, sicherzustellen, dass Sie die neueste Version der Java Virtual Machine (JVM) von Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/). </li><li> Herunterladen Excel_writer.jar von: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html und installieren Sie in den Plugins [Verzeichnis]&gt; jar-Verzeichnis. </li><li> Kopieren Sie die folgenden Dateien in das Plugins-Verzeichnis: Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm. Installieren Sie jedes dieser Skripte mit den Plugins [Menü]&gt; Makros&gt; Installieren ... Funktion von ImageJ. </li><li> Wir verwenden eine Leica SP2 konfokalen Mikroskop, die Software (Leica LCS), für die jeder Serie erzeugt als eine einzige sichtbare &#39;movie&#39; innerhalb der Software, sondern spart als einzelne Frames. Zur Rekonstruktion Frames in Serie: (i) Stellen Sie sicher, dass alle die &#39;Frames&#39; zu rekonstruieren sind in einem einzigen Ordner (zB &quot;DataFolder&gt; Tiffs &#39;). (Ii) Wählen Sie Plugins [Menü]&gt; Makros&gt; Leica_SP2_Stacker. Wählen Sie das Root-Verzeichnis (zB &#39;DataFolder&#39;). Wählen Sie den gewünschten Ordner aus der Dropdown-Liste (zB &quot;Tiffs / &#39;). Wählen Sie eine Ausgabe-Verzeichnis oder ein neues generieren (z. B. &quot;DataFolder&gt; Stacks &#39;). Das Skript wird dann rekonstruieren Serie von Einzelbildern. </li></ol> Teil 7: Korrektur für Bewegung Obwohl Bewegung der abgebildeten Seite mit guten Pinning minimiert werden kann und gleichmäßig gedehnt Gewebe, zeigen einige der glatten Muskulatur Organe spontanen Kontraktionen, die nicht durch eine sorgfältige Pinning allein abgeschafft werden können. Hier beschreiben wir die Verwendung eines frei verfügbaren Algorithmus, oder richtet Spielen Frames innerhalb einer Serie. <ol><li> Download &#39;StackReg &quot;(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) und&quot; TurboReg &quot;(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/). </li><li> Installieren Sie jedes in das Plugins-Verzeichnis mit den Plugins&gt; Makros&gt; Install ... </li><li> Legen Sie einen Stapel zu verarbeiten (File&gt; Open ...) und dann auf einen Rahmen, der deutlich zeigt, das Feld von Interesse zu bewegen. Weitere Bilder werden auf diese Referenzrahmen ausgerichtet werden. </li><li> Plugins&gt; Stacks&gt; StackReg. Versuchen Sie, jeden der verschiedenen &quot;Transformationen&quot; (dh Translation, Rigid Body, Scaled Rotation, Affine) zu bestimmen, was am wirksamsten ist. (Weitere Details: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) </li></ol> Teil 8: Particle Detection Algorithmus Für jede &quot;Standort&quot; abgebildet werden Faktoren variieren, die Auswirkungen auf den Nachweis von Ca 2 +-Transienten. Durch die Messung bestimmter Eigenschaften von jedem Standort (&quot;Partikelparameter&quot; - siehe unten), ist der Prozess der Erkennung erleichtert. So für jeden Standort, &quot;abgezogen Schwelle für&quot; berechnet man, &quot;Schwelle für Ratio&quot; und &quot;Zelle Kantenschwelle&quot;. <ol><li> Plugins [Menü]&gt; Makros&gt; Installieren ... und wählen Sie &quot;JNCT0.08Release.ijm&quot;. </li><li> Plugins [Menü]&gt; Makros&gt; load-Stack (Abkürzung: l). Wählen Sie eine Serie und berechnen Partikelparameter: <ol style="list-style:none;"><li> a. Schwelle für subtrahiert (= Hintergrund) </li></ol></li><li> Wählen Sie einen rechteckigen ROI über das, was Sie glauben, &#39;background&#39; werden. </li><li> Measure (Abkürzung: m). Notieren Sie bedeuten. <ol style="list-style:none;"><li> b. Berechnung Schwelle für Verhältnis </li></ol></li><li> Wählen Sie einen rechteckigenROI um eine optisch ebene Fläche der Zelle (n). </li><li> Measure (Abkürzung: m). Notieren Sie Mittelwert und Standardabweichung. </li><li> Wiederholen Sie noch zwei Mal OR können Sie drei Felder auf einmal zu ziehen, indem Sie &quot;Shift&quot;. </li><li> Berechnen und notieren Schwelle für ratio = (1 + SD / Mittelwert) x 32, im Durchschnitt Werte aus den drei Wiederholungen / sites. <ol style="list-style:none"><li> c. Zell Kantenschwelle </li></ol></li><li> Image&gt; Stacks&gt; Z-Projekt ... Wählen Sie Projektionstyp: &quot;Mittlere Intensität&quot; </li><li> Bild&gt; Anpassen&gt; Schwellenwert. </li><li> Wählen Sie Schwarz und Weiß. </li><li> Definieren &#39;unter&#39; (obere Schieber) zu begrenzen und notieren Sie sich den entsprechenden Wert (auf der rechten Seite des Schiebers). Nur Ereignisse, die in den schwarzen Regionen gezählt werden. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Reset&quot;. </li><li> Analyse-Stacks (Shortcut: 2) </li><li> Wählen Sie nur eine Serie zu diesem Zeitpunkt, dh die &quot;erste Datei &#39;und&#39; last file &#39;sollten die gleichen sein. </li><li> Geben Sie die Werte der &quot;Schwelle für abgezogen&quot;, &quot;Schwelle für Ratio&quot; und &quot;Zelle Kantenschwelle&quot;. Lassen Sie andere Einstellungen auf die Standardwerte zurückgesetzt. </li><li> Der Algorithmus erzeugt einen Dual-Fenster Fenster, in dem die bearbeiteten Serie auf der linken Seite angezeigt wird und das Original auf der rechten Seite. Sorgfältig durch diese gehen, um die Anzahl von Fehlalarmen und die Gelegenheiten, bei denen Ereignisse mit bloßem Auge sichtbar, nicht erkannt wurden zu beurteilen. Um eine genauere Erkennung von Ca 2 +-Transienten kann es erforderlich sein, um leicht anpassen einige der &quot;Partikelparameter&quot;. Während der Prozess ein wenig &quot;hit and miss&quot; erscheinen mag auf den ersten Versuch, eine bekommt schnell ein Gefühl, was Parameter-Schlüssel. </li><li> Für jede Serie liefert der Algorithmus eine Excel-Datei, die Details Eigenschaften der erkannten Ereignis (wie Amplitude, Fläche und Lage). &#39;False Positives&#39; - entfernt werden, kann von Hand, aus dieser Excel-Datei - mit der Durchsicht der Bilddateien, dass der Algorithmus Ausgänge (z. B. Schritt 8.17) identifiziert. </li></ol>

<ol><li>Gregory, J. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+fluorescent+probes+and+research+products%22">Handbook of fluorescent probes and research products</a>. , Molecular Probes. Eugene, Oregon. 771-826 (2002).</li>
<li>Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+force+and+Ca2%2B+in+anococcygeal+and+vas+deferens+smooth+muscle+cells+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse.</a> Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).</li>
<li>Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+propagation+of+spontaneous+excitation+in+smooth+muscle+of+the+guinea-pig+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder.</a> J Physiol. 150, 273-286 (2001).</li>
<li>Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elementary+purinergic+Ca2%2B+transients+evoked+by+nerve+stimulation+in+rat+urinary+bladder+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 564, 201-212 (2005).</li>
<li>Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+ATP+release+from+nerve+terminals+elicits+focal+smooth+muscle+Ca2%2B+transients+in+mouse+vas+deferens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens.</a> J. Physiol. 541, 849-862 (2002).</li>
<li>Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+underlying+carbachol-induced+contraction+of+rat+urinary+bladder+II.+Protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).</li>
<li>Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+purinergic+neurotransmission+in+the+mouse+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder.</a> J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).</li>
<li>Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+calcium+sparks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks.</a> Science. 270, 633-637 (1995).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).</li>
</ol>

Es wurden Anstrengungen unternommen, um die Anzahl der verwendeten Tiere und ihr Leiden zu minimieren, alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den britischen Animals (Scientific Procedures) Act 1986 und der Europäischen Gemeinschaften die Richtlinie 86/09/EEC durchgeführt.

Wahl der fluoreszierenden Ca 2 +-Indikator Oregon Green 488 BAPTA-1.00 wurde als Ca 2 +-Indikator gewählt, weil es (i) ist hell im Vergleich zu anderen Indikatoren (zB Fluo-4 und Calcium Green) 1, (ii) ist empfindlich auf physiologische Veränderungen in Ca 2 +-Konzentration mit einem K d in einer ähnlichen Größenordnung 1 auf die intrazelluläre Ca 2 +-Konzentration [Ca 2 +] i (z. B. der Samenleiter 2), (iii) lädt viele glatte Muskelzellen, so dass glatte Muskelzellen Kopplung überwacht werden. Allerdings ist Oregon Green 488 BAPTA-1.00 eine nicht-ratioable Ca 2 +-Indikator und als solche kann nicht einfach benutzt, um die absolute bestimmen [Ca 2 +] i. Darüber hinaus kann es auch Puffer Ca 2 +, wenn in hohen Konzentrationen und gesättigt mit hoher Amplitude Veränderungen in [Ca 2 +] i. Die Hemmung der spontanen Kontraktilität Die spontane Kontraktilität der glatten Muskulatur Organe können pharmakologisch reduziert werden, wie durch die Blockierung der Bewegung des Ca 2 + durch L-Typ Ca 2 +-Kanäle (z. B. durch: Nifedipin 3; Diltiazem 4). Beachten Sie, dass diese Medikamente wird erheblich reduziert die Amplitude der whole-cell Ca 2 + Blitze / Transienten. Die Kontraktion der Samenleiter resultiert aus einer Kombination von allem purinergen und noradrenerge Neurotransmission. Focal Ca 2 +-Transienten in diesem Gewebe sind jedoch unempfindlich gegenüber noradrenergen-Rezeptor-Blockade (z. B. α 1-Adrenozeptor, durch Prazosin 5) so Bewegung ohne Beeinträchtigung der Schwerpunkt Ca 2 +-Transienten reduziert werden kann. Alternativ können Kontraktion verhindert &quot;Downstream&quot; durch die Hemmung der Myosin Light Chain Kinase zB durch Wortmannin 6 sein. Schlussfolgerungen Überwachung Ca 2 +-Fluoreszenz bei Submicron Auflösung ist eine leistungsfähige Technik, um die post-junctional Auswirkungen der Freisetzung von Neurotransmittern 5,7-Studie und die Freisetzung von Ca 2 + aus dem internen Speicher (z. B. &quot;Funken&quot; 8). Die Analyse der Ca 2 +-Transienten mit der beschriebenen Vorgehensweise ist dabei kostengünstig im Vergleich zu handelsüblichen Bildanalyse-Pakete und ermöglicht maßgeschneiderte Analyse durch individuelle schriftliche Java-Plugins für ImageJ.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM</td><td>Invitrogen</td><td>O6807</td><td>10 x 50 &amp;#x03BC;g</td></tr><tr><td>Pluronic F-127-Lösung</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td>20%ige Lösung in DMSO</td></tr><tr><td>Leica SP2 aufrechtes konfokales Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lufttisch (&amp;#8216;vibrationsisolierte Arbeitsstation&amp;rsquo;)</td><td>Newport Corp.</td><td>M-VW-3046-OPT-012140</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastomer</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

focal ca 2 + transient-erkennung in der glatten muskulatur

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca 2 +-Imaging der glatten Muskulatur gibt einen Einblick in die zellulären Mechanismen, die zu keiner Änderung des Membranpotentials, wie die Freisetzung von Ca 2 + aus dem internen Speicher führen kann, und ermöglicht es mehreren Zellen gleichzeitig überwacht werden, um zu beurteilen, z. B. Kopplung in Syncytial Gewebe. Subzellulären Ca 2 +-Transienten sind in der glatten Muskulatur gemeinsamen, aber nur schwer genau zu messen, weil der Probleme, die durch ihre stochastische Ereignis entstanden, über ein oft großes Sehfeld, in ein Organ, das es anfällig für Vertrag. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine Reihe von Imaging-Protokolle und-Analyse-Routinen zu erwerben und dann zu analysieren entwickelt, in einer automatisierten Weise, die Häufigkeit, Ort und Amplitude von solchen Ereignissen. Während dieser Ansatz auch in anderen Kontexten angewendet werden können, beinhaltet unsere eigene Arbeit den Nachweis von lokalen purinergen Ca 2 +-Transienten zur Ortung Sender Release mit Submikron-Auflösung. ATP ist als cotransmitter von vegetativen Nerven, bindet dort an P2X1-Rezeptoren auf den glatten Muskelzellen des Detrusors und Samenleiter freigegeben. Ca 2 + in die glatten Muskelzellen, was zu purinergen neuroeffector Ca 2 +-Transienten (NCTS). Der Schwerpunkt Ca 2 +-Transienten ermöglichen die optische Überwachung der Freisetzung von Neurotransmittern in einer Weise, die viele Vorteile gegenüber der Elektrophysiologie hat. Abgesehen von der stark verbesserten räumlichen Auflösung, hat optische Erfassung der zusätzlichen Vorteil, dass die Aufnahme des Senders Entlassung aus vielen unterscheidbaren Seiten gleichzeitig. Darüber hinaus ist die optische Fokusebene leichter zu pflegen oder zu korrigieren während der langen Aufnahme-Serie ist als die Neupositionierung von einem intrazellulären scharfen Mikroelektroden. Zusammenfassend ist ein Verfahren zur Abbildung von Ca 2 +-Fluoreszenz beschrieben, die Details der Vorbereitung des Gewebes und die Erfassung und Analyse von Daten. Wir skizzieren den Einsatz mehrerer Skripte für die Analyse solcher Ca 2 +-Transienten.

Details Methoden zur hochauflösenden Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Darstellung von glatten Muskelzellen in isolierten Organen, einschließlich: Vorbereitung des Gewebes, Bildaufnahme und Datenanalyse.

Focal Ca 2 + Transient-Erkennung in der glatten Muskulatur

Die Ca2+-Bildgebung von glatten Muskelzellen liefert Einblicke in zelluläre Mechanismen, die möglicherweise nicht zu Änderungen des Membranpotenzials führen, wie beispielsweise die Freisetzung von Ca2+ ...

Zunächst wird eine Kalzium-Ladelösung hergestellt, erwärmt und durchgebläst. Die Harnblase wird präpariert, geöffnet, flach ausgebreitet und fixiert, und ein Streifen Detrusormuskel wird entnommen. Der Detrusorstreifen wird der Ladelösung zugegeben, inkubiert und gespült, dann flach ausgebreitet und fixiert.Der Kalziumspiegel vier im Gewebe wird durch Laserlicht angeregt und das resultierende emittierte Licht wird erfasst. Filme, die aus einzelnen Bildern bestehen, werden analysiert, indem aufeinanderfolgende Bilder verglichen werden. Der Hintergrund wird subtrahiert.Die Schwellenbestimmung für die Zellgrenze legt fest, an welchen Stellen Ereignisse gefunden werden können, und es wird ein Verhältnis zwischen aufeinanderfolgenden Gehirnen gebildet. Wenn die verbleibenden Ereignisse vordefinierten Kriterien entsprechen, werden sie hervorgehoben und beschriftet. Hallo, mein Name ist John Young aus den Laboren von Keith Brain und Tom Kinane am Department für Pharmakologie der Universität Oxford.Ich bin Rob Amos, ebenfalls aus den Laboren von Brain und Canne, und mein Name ist Keith Brain. Heute werden Ihnen John und Rob eine Kalzium-Bildgebungstechnik in glattem Muskelgewebe vorführen. Wir verwenden diese Technik in unserem Labor, um die Freisetzung von Neurotransmittern aus autonomen Nerven und deren Wirkung auf glatte Muskulatur zu untersuchen.Beginnen wir. Der Kalziumindikator Organ Green, 4 88 BAFTA 1:00 AM liegt in 500-Mikroliter-Fläschchen vor, die 50 Mikrogramm Pulver enthalten. Um den Kalziumindikator vorzubereiten, geben Sie 40 Mikroliter Onic-F1-27-Lösung zum Pulver hinzu und schütteln vorsichtig für 30 Sekunden. Danach geben Sie 460 Mikroliter physiologischer Salzlösung (PSS) hinzu und schütteln erneut vorsichtig für 30 Sekunden.Die endgültige Lösung, 10 Mikromolar Organ Green. 4 88 BAFTA 1:00 AM liefert vier Aliquots zu je 125 Mikroliter. Vermeiden Sie Lichteinwirkung und lagern Sie die Lösung vor der Dissektion des interessierenden Gewebes bei minus 20 Grad Celsius.Entfernen Sie den Kalziumindikator aus dem Gefrierschrank und lassen Sie ihn bei Raumtemperatur auftauen, während der Kalziumindikator dünn ist. Geben Sie ein Milliliter PSS in ein Reagenzglas und stellen Sie es in ein Wasserbad bei 33 Grad Celsius. Befestigen Sie einen Belüfter mit einem Stopfen im Reagenzglas, oder Sie können auch Perfil verwenden und dann mit einer Mischung aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid mit einer Rate von etwa einer Blase pro Sekunde durchblubbern.Isolieren Sie das glatte Muskelorgan vom Tier. In diesem Fall handelt es sich um die Harnblase einer Maus. Legen Sie das Organ in etwa 50 Millimeter PSS, um es zu waschen; nachdem das Gewebe sorgfältig gewaschen wurde, entfernen Sie das perivesikale Fettgewebe und das Bindegewebe.Präparieren Sie die Harnblase nach dem Typ des glatten Muskelgewebes von Laurean. Öffnen Sie die Harnblase längs vom Blasenhals, vom kaudalen bis zum oberen Ende des Blasendoms. Präparieren Sie am kranialen Ende vier Streifen, sechs bis acht Millimeter lang und ein bis zwei Millimeter breit, entlang der dorsalen Oberfläche des Resser in Richtung der dominierenden Muskelbündel.Geben Sie das dissezierte Gewebe und das vorgewärmte und durchperlte PSS in ein Reagenzglas, um den Calciumindikator zuzusetzen: 125 Mikroliter 10-Mikromolar-Organ-Green-488B um 01:00 Uhr zum Gewebe geben und das Reagenzglas leicht von Hand schütteln, um es zu mischen. Stellen Sie das Reagenzglas zurück in das Wasserbad. Setzen Sie das Durchperlen fort und decken Sie das Wasserbad mit einem Blatt Aluminiumfolie ab.Die Zeit, die benötigt wird, bis ausreichend Gewebe den Kalziumindikator aufgenommen hat, variiert je nach Größe des Gewebes und Dicke der glatten Muskulatur. Beispielsweise beträgt die Inkubationszeit für den Detrusor der Maus und die Ratten-Oxs 70 Minuten. Dagegen inkubieren wir den Detrusor der Ratte und die Maus-VAs deens 120 Minuten lang.Nachdem das Gewebe mit dem Kalziumindikator beladen wurde, kann es für die Mikroskopie vorbereitet werden. Spülen Sie das Gewebe zunächst 10 Minuten lang mit belüfteter PSS. Bringen Sie danach das Gewebe in einer mit einem S-Schild ausgekleideten Probenschale unter.Leicht dehnen, um ein flaches Blatt zu bilden. Befestigen Sie das Gewebe mit kurzen Stücken, zum Beispiel zwei Millimeter langen Silberdrähten mit einem Durchmesser von 25 bis 50 Mikrometer, und stecken Sie die Drähte in einem Winkel ein.Verwenden Sie keine Nadeln, die länger als einige Millimeter sind, da sie das Objektiv zerkratzen könnten. Eine sorgfältige Befestigung des Gewebes mit Nadeln ist wichtig, um spontane Bewegungen des Gewebes zu minimieren und die Lokalisation einer geeigneten Stelle für die Bildaufnahme zu erleichtern. Nachdem das Gewebe befestigt wurde, stellen Sie die Präparationschale auf den Mikroskoptisch.Stellen Sie sicher, dass das PSS nicht aus dem mit Silikongummi abgedichteten Bereich der Schale entweicht, da dies dazu führen kann, dass ein großer Bereich mit PSS bedeckt wird. Wenn die Überströmung zu Demonstrationszwecken beginnt, werden die folgenden Schritte im Licht durchgeführt.Bitte beachten Sie, dass diese Experimente normalerweise im Dunkeln durchgeführt werden. Schalten Sie die Pumpe ein, um die Präparation zu überströmen. Mit PSS wird häufig eine Rate von 100 Milliliter pro Stunde verwendet.Schalten Sie die Heizeinheit ein, platzieren Sie die Zu- und Ablaufschläuche sowie die Temperatursonde auf der Präparationswanne, indem Sie diese mit dem Magneten an der Basis an dem Metallstreifen befestigen. Die Höhe der Spitze des Ablaufschlauchs bestimmt die Tiefe der PSS. Achten Sie sorgfältig darauf, dass die Ablaufleitung die PSS tatsächlich abführt, da dies manchmal nicht der Fall ist.Stellen Sie zunächst die Temperatur der Heizeinheit so ein, dass die gewünschte Temperatur zwischen 33 und 35 Grad Celsius erreicht wird. Lassen Sie das Gewebe mindestens 10 Minuten mit einem Objektiv mit geringer Vergr&ouml;&szlig;erung equilibrieren. 10 oder 20 Mal.Verwenden Sie Epifluoreszenz oder Anregung mit blauem Licht, um die glatte Muskulatur zu betrachten und eine geeignete Region zur Überwachung zu identifizieren. Da die Belichtung mit Anregungslicht den Indikator ausbleichen wird, vermeiden Sie die Anwendung für mehr als nur wenige Sekunden auf einmal.Vermeiden Sie Aufnahmen mit hellen Strukturen, da diese eine hohe Anzahl falsch-positiver Ergebnisse im Bilderkennungsalgorithmus verursachen können. Wählen Sie einen Bereich mit minimaler Bewegung und einer großen Anzahl glatter Muskelzellen im Sichtfeld. Sobald Sie die Aufnahmestelle ausgewählt haben, wechseln Sie zu einem Objektiv mit höherer Vergrößerung, beispielsweise 40 x.Drehen Sie den Objekttisch oder die optische Achse so, dass die glatte Muskelzelle oder die glatten Muskelzellen horizontal liegen, also parallel zur schnellen Scan-Achse. Die glatten Muskelzellen sind nun bereit für die Bildgebung mittels konfokaler Mikroskopie.In diesem Protokoll verwenden wir ein aufrechtes konfokales Mikroskop vom Typ Leica SP zwei. Schließen Sie die Blende auf eine Airy-Scheibe. Stellen Sie die Laserleistung zwischen 25 und 35 % am kundenspezifischen optischen abstimmbaren Filter ein.Dieser Wert stellt einen Kompromiss zwischen Helligkeit und photobleaching dar. Um die Datenauswertung vorzubereiten, laden Sie ImageJ herunter und installieren Sie es. Laden Sie die plattformspezifische Version herunter und aktualisieren Sie anschließend auf die neueste Version, indem Sie die aktuelle ImageJ-JAR-Datei herunterladen, um die alte Datei zu ersetzen. Danach laden Sie die Excel-Writer-JAR-Datei herunter und installieren sie in das Plugins-JAR-Verzeichnis.Kopieren Sie diese Dateien in das Plugins-Verzeichnis. Installieren Sie jedes dieser Skripte mithilfe der Plugins-Makros. Installationsfunktion von Image J. Die Software für das von uns verwendete Leica SP2-Konfokalmikroskop, die Leica heißt.LCS speichert einzelne Einzelbilder jeder Serie als separate Datei. Um die Serie zu rekonstruieren, stellen Sie sicher, dass alle zu rekonstruierenden Einzelbilder in einem einzigen Ordner enthalten sind.Beispielweise der Datenordner mit TIFFs. Anschließend wählen Sie das Leica SP two Stacker-Makro aus dem Menü Plugins – Makros aus. Wählen Sie das Stammverzeichnis, in diesem Fall den Datenordner.Wählen Sie den gewünschten Ordner aus der Dropdown-Liste aus. Wählen Sie in diesem Fall tiffs ein Ausgabeverzeichnis aus oder erzeugen Sie ein neues. Zum Beispiel Datenordner stacks.Das Skript rekonstruiert anschließend die Serie aus einzelnen Bildern, um Bewegungen zu korrigieren. Wir verwenden einen frei verfügbaren Algorithmus, der Bilder innerhalb eines Serien-Download-Stacks ausrichtet oder zusammenpasst: rig und turbo reg. Kopieren Sie die Dateien für jeden Algorithmus in den Stacks-Ordner.Laden Sie einen Stapel zur Verarbeitung und wechseln Sie dann zu einem Frame, der das interessierende Feld deutlich zeigt. Alle anderen Frames werden an diesem Referenzframe ausgerichtet. Danach wechseln Sie zu Plugins-Stapeln.Stapel-Reg. Testen Sie jede der verschiedenen Transformationen, um festzustellen, welche für jede Stelle am effektivsten ist. Abgebildete Faktoren, die die Detektion von Kalziumtransienten beeinflussen, variieren je nach Messung bestimmter Eigenschaften und Partikelparameter jeder Stelle.Die Empfindlichkeit und Spezifität der Detektion werden erhöht. Für jede Stelle berechnen wir daher den Schwellenwert für das subtrahierte Verhältnis und den Zellkantenschwellenwert. Gehen Sie zunächst zu Plugins, Makros, Installieren und wählen Sie jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. Danach gehen Sie zu Plugins, Makros, Stapel laden.Wählen Sie eine Serie aus und berechnen Sie die folgenden Partikelparameter. Um die Schwelle für subtrahiert zu berechnen, wählen Sie einen rechteckigen interessierenden Bereich über dem aus, was Sie als Hintergrundmessung ansehen. Notieren Sie den Mittelwert. Um die Schwelle für das Verhältnis zu berechnen, wählen Sie einen rechteckigen interessierenden Bereich um einen optisch flachen Bereich der glatten Muskelzelle oder der glatten Muskelzellen herum aus.Messen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung und notieren Sie diese. Wiederholen Sie den Vorgang noch zweimal, oder zeichnen Sie drei Boxen gleichzeitig, indem Sie die Umschalttaste drücken. Berechnen Sie das Schwellenwertverhältnis und notieren Sie es.Berechnen Sie die Standardabweichung geteilt durch den Mittelwert, addieren Sie eins und multiplizieren Sie das Ergebnis anschließend mit 32. Bei Mittelung der Werte aus den drei Wiederholungen ist der Faktor 32 notwendig, um den Verhältnisalgorithmus zu berücksichtigen, bei dem keine Änderung gegenüber dem vorhergehenden Bild auf einen ganzzahligen Wert von 32 abgebildet wird. Dies ermöglicht einen guten dynamischen Bereich, um Zunahmen und Abnahmen des Verhältnisses zu detektieren.Wählen Sie bei einem 8-Bit-Bild Bild Anpassen Schwellenwert. Wählen Sie Schwarz und Weiß. Definieren Sie unterhalb der oberen Schiebegrenze und notieren Sie den entsprechenden Wert.Dies befindet sich rechts vom Schieberegler. Nur Ereignisse in den schwarzen Bereichen werden gezählt. Klicken Sie auf „Zurücksetzen“.Nachdem nun die Schwellenwerte für die subtrahierte Ratio und die Zellkantenschwelle berechnet wurden, können wir die Bildstapel analysieren. Bestimmen Sie den Speicherort der zu analysierenden Stapel. Wählen Sie an diesem Punkt nur eine Serie aus.Das ist die erste Datei, und die letzte Datei sollte identisch sein. Wählen Sie anschließend einen Speicherort für die Ausgabe der Datendateien und -stapel aus. Zum Beispiel: Ausgabeordner für Daten.Geben Sie Schwellenwerte für die Subtraktion der Schwelle für das Verhältnis und der Kantenschwelle ein. Belassen Sie die übrigen Einstellungen bei ihren Standardwerten. Der Algorithmus erzeugt ein Fenster mit zwei Bereichen, in dem die verarbeitete Serie links und die ursprüngliche Serie rechts angezeigt wird.Öffnen Sie diese Datei aus dem Ausgabeordner und prüfen Sie sorgfältig die Anzahl der falsch-positiven Ergebnisse sowie die Fälle, in denen mit bloßem Auge sichtbare Ereignisse nicht erkannt wurden. Für jede Serie erstellt der Algorithmus eine Excel-Datei, die Merkmale der erkannten Ereignisse wie Amplitudenbereich und Position beschreibt. Falsch-positive Ergebnisse, die durch Überprüfung der vom Algorithmus erzeugten Bilddateien identifiziert wurden, können manuell aus dieser Excel-Datei entfernt werden, obwohl hierfür strenge Kriterien gelten sollten.Dies ist ein Film der Kalzium-Transienz in glattem Muskelgewebe. In diesem Beispiel besteht der Film aus 100 einzelnen Einzelbildern, die mit fünf Hertz aufgenommen wurden. Im Rahmen einer Untersuchung, beispielsweise des Einflusses eines bestimmten Medikaments auf die Frequenz der Kalzium-Transienzen, würden wir pro Experiment viele solcher Filme aufnehmen.Hier sehen wir zahlreiche spontane Kalzium-Transientes in den glatten Muskelzellen. Das Ergebnis des Partikelerkennungsalgorithmus ist hier dargestellt. Für jede Serie erstellt der Algorithmus eine Excel-Datei, die Merkmale des erkannten Ereignisses wie Amplitude, Fläche und Position beschreibt.Wir haben also eine Methode zur Abbildung von Kalziumtranchen in glatten Muskeln von Organen wie der Harnblase demonstriert und gezeigt, wie wir diese Kalziumtransienten mithilfe eines im Labor entwickelten Algorithmus analysieren. Wichtig ist, das Gewebe sorgfältig auf die Kalzium-Bildgebung vorzubereiten. Im Fall des heute dargestellten Gewebes bedeutet dies, Bindegewebe und jegliches Fettgewebe zu entfernen, das das Sichtfeld behindern könnte.Es ist außerdem wichtig, das Gewebe als flache Schicht zu fixieren. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten und danke fürs Zuschauen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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