Focal Ca ^{2 +} Transient-Erkennung in der glatten Muskulatur

Zuerst wird eine Calciumladelösung hergestellt, erwärmt und sprudeln lassen. Die Harnblase wird präpariert, geöffnet, flach herausgesteckt und ein Detrusorstreifen entnommen. Der Detrusorstreifen wird in die Ladelösung gegeben, inkubiert und gespült und flach ausgepinnt.

Der Calciumboden vier im Gewebe wird durch Laserlicht angeregt und das emittierte Licht eingefangen, was dazu führt. Filme, die aus einzelnen Bildern bestehen, werden analysiert, indem aufeinanderfolgende Bilder verglichen werden. Der Hintergrund wird subtrahiert.

Die Zellkantenschwelle bestimmt, wo Ereignisse zu finden sind, und es wird ein Verhältnis zwischen aufeinanderfolgenden Gehirnen genommen. Wenn die verbleibenden Ereignisse vordefinierten Kriterien entsprechen, werden sie hervorgehoben und beschriftet. Hallo, mein Name ist John Young aus den Laboratorien von Keith Brain und Tom Kinane am Department of Pharmacology der Universität Oxford.

Ich bin Rob Amos, ebenfalls von den Brain und Canne Labs und mein Name ist Keith Brain. Heute zeigen Ihnen John und Rob ein Calcium-Imaging-Verfahren in der glatten Muskulatur. Wir verwenden dies in unserem Labor, um die Freisetzung von Neurotransmittern aus autonomen Nerven und seine Wirkung auf die glatte Muskulatur zu untersuchen.

Also lasst uns loslegen. Der Calciumindikator Organ grün, 4 88 BAFTA 1:00 AM wird in 500-Mikroliter-Fläschchen mit 50 Mikrogramm Pulver geliefert. Um den Calciumindikator bei 40 Mikrolitern Onic F1 27 Lösung in das Pulver vorzubereiten und danach 30 Sekunden lang bei 460 Mikrolitern physiologischer Kochsalzlösung PSS vorsichtig zu schütteln und weitere 30 Sekunden vorsichtig zu schütteln.

Die endgültige Lösung, 10 Mikromolaren Organgrün. 4 88 BAFTA 1:00 AM liefert vier Aliquot von je 125 Mikrolitern. Vermeiden Sie Lichteinwirkung und lagern Sie die Lösung bei minus 20 Grad Celsius, bevor Sie das betreffende Gewebe präparieren.

Nehmen Sie den Kalziumindikator aus dem Gefrierschrank und tauen Sie ihn bei Raumtemperatur auf, während der Kalziumindikator Ihnen gehört. Geben Sie einen Milliliter PSS in ein Reagenzglas und ein Wasserbad bei 33 Grad Celsius. Befestigen Sie einen Bubbler mit einem Spund im Reagenzglas, oder Sie können auch Perfil verwenden und dann mit einer Mischung aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid mit einer Geschwindigkeit von etwa einer Blase pro Sekunde blasen.

Präparieren Sie das glatte Muskelorgan des Tieres. In diesem Fall ist es die Harnblase einer Maus. Legen Sie das Organ zum Waschen in etwa 50 Millimeter PSS, entfernen Sie nach dem Waschen des Gewebes vorsichtig das Ciero-Fettgewebe und das Bindegewebe

Präparieren Sie offen nach dem Laurean-Typ der glatten Muskulatur für die Harnblase. Längsoffen vom Blasenhals, das Wurstende bis zum oberen Rand der Kuppel. Das Schädelende Bereiten Sie vier Streifen vor, sechs bis acht Millimeter lang und ein bis zwei Millimeter breit, entlang der dorsalen Fläche des Greifers, die in Richtung der dominanten Muskelbündel schneiden.

Legen Sie das präparierte Gewebe und das Vorkriegs- und Blasen-PSS, um den Kalziumindikator bei 125 Mikrolitern 10 mikromolaren Organen grün, 4 88 B bis 01:00 Uhr in das Gewebe in das Reagenzglas zu laden, und schütteln Sie es ein wenig mit der Hand, um es zu mischen. Setze den Schlauch wieder in das Wasserbad ein. Setze das Blubbern fort und decke das Wasserbad mit einem Blatt Folie ab.

Die Zeit, die benötigt wird, bis ausreichend Gewebe den Kalziumindikator aufnimmt, variiert mit der Größe des Gewebes und der Dicke der glatten Muskelschicht. Für den Maus-Detrusor und die Rattenochsen sind es zum Beispiel 70 Minuten. Während wir für den Ratten-Detrusor und die Maus-VAs 120 Minuten lang inkubieren.

Ist das Gewebe mit dem Kalziumindikator beladen, kann es für die Mikroskopie vorbereitet werden. Spülen Sie das Tuch zunächst 10 Minuten lang mit blasigem PSS aus. Montieren Sie dann das Taschentuch in eine mit S-Schutz ausgekleidete Zubereitungsschale.

Dehnen Sie es leicht, um ein flaches Blatt zu bilden. Stecken Sie das Taschentuch mit kurzen Längen fest. Zum Beispiel zwei Millimeter Silberdraht mit einem Durchmesser von 25 bis 50 Mikrometern und stecken Sie die Stifte schräg ein.

Vermeiden Sie die Verwendung von Stiften, die länger als ein paar Millimeter sind, da diese das Objektiv zerkratzen können. Eine sorgfältige Fixierung des Gewebes ist wichtig, um die Spontanität des Gewebes zu minimieren und die Lokalisierung einer geeigneten Stelle für die Bildgebung zu erleichtern. Nachdem das Gewebe festgesteckt wurde, positionieren Sie die Vorbereitungsschale auf dem Mikroskoptisch.

Achten Sie darauf, dass das PSS nicht aus dem mit Silguard ausgekleideten Bereich der Schale austritt. Denn dies kann dazu führen, dass eine große Fläche mit PSS bedeckt wird. Wenn die Superfusion zu Demonstrationszwecken beginnt, werden die folgenden Schritte im Licht durchgeführt.

Bitte beachten Sie, dass diese Experimente in der Regel bei Dunkelheit durchgeführt werden. Schalten Sie die Pumpe ein, um das Präparat zu übersichern. Bei PSS wird häufig eine Rate von 100 Millilitern pro Stunde verwendet.

Schalten Sie die Heizeinheit ein, platzieren Sie die Zu- und Abflussrohre und den Temperaturfühler auf der Zubereitungsschale und befestigen Sie sie jeweils mit dem Magneten an der Basis am Metallstreifen. Die Höhe der Spitze des Abflussrohrs bestimmt die Tiefe des PSS. Achten Sie darauf, dass der Abfluss tatsächlich PSS entfernt, da dies manchmal nicht der Fall ist.

Stellen Sie die Temperatur an der Heizung zunächst auf die gewünschte Temperatur zwischen 33 und 35 Grad Celsius ein. Lassen Sie das Gewebe mindestens 10 Minuten lang mit einem Objektiv mit geringer Leistung äquilibrieren. 10 oder 20 Mal.

Verwenden Sie Epi-Fluoreszenz oder Anregung mit blauem Licht, um die glatte Muskulatur zu betrachten und eine geeignete Region für die Überwachung zu identifizieren. Da die Beleuchtung der Anregung ausgesetzt ist, wird der Indikator photobleichiert. Vermeiden Sie die Anwendung für mehr als ein paar Sekunden am Stück.

Vermeiden Sie das Sehen mit hellen Strukturen, da diese eine hohe Anzahl von Fehlalarmen im Bilderkennungsalgorithmus verursachen können. Versuchen Sie, eine Stelle mit minimaler Bewegung und einer großen Anzahl von glatten Muskelzellen auf dem Feld auszuwählen. Nachdem Sie den Standort für das Image ausgewählt haben, wechseln Sie zu einem Objektiv mit höherer Leistung, z. B. 40 x.

Drehen Sie den Tisch oder die optische Achse so, dass die glatte Muskelzelle(n) horizontal liegt. Das ist parallel zur Rapid-Scan-Achse. Die glatten Muskelzellen sind nun bereit für die Bildgebung durch konfokale Mikroskopie.

In diesem Protokoll verwenden wir ein Leica SP mit zwei aufrechten konfokalen Mikroskopen. Schließen Sie die Lochblende zu einer luftigen Scheibe. Stellen Sie die Laserleistung zwischen 25 und 35 % auf dem anpassbaren optischen Filter ein.

Dieser Wert ist ein Kompromiss zwischen Helligkeit und Lichtbleichung. Um die Datenanalyse vorzubereiten, laden Sie Image J herunter und installieren Sie es.Laden Sie die plattformspezifische Version herunter und aktualisieren Sie dann auf die neueste Version, indem Sie die neueste ImageJ-JAR-Datei herunterladen, um die alte Datei zu ersetzen. Laden Sie als Nächstes die Excel-Writer-JAR-Datei herunter und installieren Sie sie in das JAR-Verzeichnis plugins.

Kopieren Sie diese Dateien in das Plugins-Verzeichnis. Installieren Sie jedes dieser Skripte mit den Plug-in-Makros. Die Software für das Leica SP mit zwei Konfokalmikroskopen, die wir verwenden, heißt Leica.

LCS speichert die einzelnen Frames jeder Serie als separate Datei. Um die Reihe zu rekonstruieren. Stellen Sie sicher, dass sich alle zu rekonstruierenden Frames in einem einzigen Ordner befinden.

Beispiel: Datenordner tiffs. Wählen Sie dann das Leica SP Zwei-Stapler-Makro aus dem Menü der Plug-in-Makros aus. Wählen Sie das Stammverzeichnis in diesem Fall den Datenordner aus.

Wählen Sie den gewünschten Ordner aus der Dropdown-Liste aus. In diesem Fall wählen tiffs ein Ausgabeverzeichnis aus oder generieren ein neues. Zum Beispiel Stapel von Datenordnern.

Das Skript rekonstruiert dann Serien aus einzelnen Frames, um sie aus der Bewegung zu korrigieren. Wir verwenden einen frei verfügbaren Algorithmus, der Frames innerhalb einer Reihe von Download-Stacks, Rigs und Turbo-Regs ausrichtet oder abgleicht. Kopieren Sie die Dateien für jede Datei in den Ordner stacks.

Laden Sie einen Stapel, der verarbeitet werden soll, und verschieben Sie ihn dann zu einem Rahmen, der das Interessenfeld deutlich anzeigt. Andere Frames werden an diesem Referenzframe ausgerichtet. Gehen Sie danach zu den Plugin-Stacks.

Probieren Sie jede der verschiedenen Transformationen aus, um zu ermitteln, was für jede Website am effektivsten ist. Die abgebildeten Faktoren, die die Detektion von Kalziumtransienten beeinflussen, variieren durch die Messung bestimmter Eigenschaften und Partikelparameter jeder Stelle.

Die Sensitivität und Spezifität des Nachweises werden erhöht. Daher berechnen wir für jeden Standort den Schwellenwert für den subtrahierten Schwellenwert für das Verhältnis und den Schwellenwert für die Zellenkante. Um zu beginnen, gehen Sie zu Plugins, Makros, installieren und wählen Sie jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. Gehen Sie dann zu Plugins Makros Load Stack.

Wählen Sie eine Reihe aus, und berechnen Sie die folgenden Partikelparameter. Um den Schwellenwert für die Subtraktion zu berechnen, wählen Sie einen rechteckigen Interessenbereich über dem Bereich aus, den Sie für das Hintergrundmaß halten. Mittelwert notieren Um den Schwellenwert für das Verhältnis zu berechnen, wählen Sie einen rechteckigen Bereich von Interesse um einen optisch flachen Bereich der glatten Muskelzelle oder -zellen aus.

Messen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung nach unten. Wiederholen Sie den Vorgang noch zwei weitere Male, oder Sie können drei Kästchen gleichzeitig zeichnen, indem Sie die Umschalttaste drücken. Berechnen Sie eine Notiz nach unten die Schwelle für das Verhältnis.

Berechnen Sie als Standardabweichung dividiert durch den Mittelwert, addieren Sie eins und multiplizieren Sie dann das Ergebnis mit 32. Bei der Mittelung der Werte aus den drei Replikaten ist der Faktor 32 erforderlich, um den Verhältniswahlalgorithmus zu berücksichtigen, bei dem keine Änderung aus dem vorangegangenen Frame auf einen ganzzahligen Wert von 32 abgebildet wird. Dies ergibt einen guten Dynamikbereich, um Zu- und Abnahmen des Verhältnisses zu erkennen.

Wählen Sie für ein Acht-Bit-Bild den Schwellenwert für die Bildanpassung aus. Wählen Sie Schwarzweiß aus. Definieren Sie unterhalb der oberen Schiebegrenze und notieren Sie sich den entsprechenden Wert.

Dieser befindet sich rechts neben dem Schieberegler. Es werden nur Ereignisse gezählt, die in den schwarzen Bereichen stattfinden. Klicken Sie auf Zurücksetzen.

Nachdem nun der Schwellenwert für den subtrahierten Schwellenwert für das Verhältnis und den Verkaufskantenschwellenwert berechnet wurde, können wir die Bildstapel analysieren. Bestimmen Sie den Standort der zu analysierenden Stacks. Wählen Sie zu diesem Zeitpunkt nur eine Serie aus.

Das ist die erste Datei, und die letzte Datei sollte dieselbe sein. Wählen Sie dann einen Speicherort für die Ausgabe von Datendateien und Stacks aus. Zum Beispiel die Ausgabe von Datenordnern.

Geben Sie die Werte des Schwellenwerts für subtrahiert den Schwellenwert für das Verhältnis und den Verkaufskantenschwellenwert ein. Behalten Sie die Standardwerte für andere Einstellungen bei. Der Algorithmus erzeugt ein Fenster mit zwei Fenstern, in dem die verarbeitete Serie auf der linken Seite und das Original auf der rechten Seite angezeigt wird.

Öffnen Sie diese Datei aus dem Ausgabeordner, und gehen Sie diese sorgfältig durch, um die Anzahl der falsch positiven Ergebnisse und die Fälle zu bewerten, in denen Ereignisse, die mit dem Auge sichtbar sind, nicht erkannt wurden. Für jede Serie erstellt der Algorithmus eine Excel-Datei, in der die Merkmale des erkannten Ereignisses aufgeführt sind, wie z. B. der Amplitudenbereich und die Position von Fehlalarmen, die durch die Überprüfung der Bilddateien identifiziert wurden, die der Algorithmus möglicherweise von Hand aus dieser Excel-Datei entfernt hat. Obwohl Sie strenge Kriterien dafür haben sollten.

Dies ist ein Film der Kalziumvergänglichkeit in der glatten Muskulatur. In diesem Beispiel besteht der Film aus 100 einzelnen Frames, die mit fünf Hertz erfasst wurden. Wir erwarben viele dieser Filme pro Experiment, wenn wir zum Beispiel die Wirkung eines bestimmten Medikaments auf die Häufigkeit von transientem Kalzium untersuchten.

Hier sehen wir zahlreiche spontane Kalziumtransienten in den glatten Muskelzellen. Das Ergebnis des Partikeldetektionsalgorithmus ist hier dargestellt. Für jede Reihe erstellt der Algorithmus eine Excel-Datei, in der die Merkmale des erkannten Ereignisses wie Amplitudenbereich und Position aufgeführt sind.

Wir haben also eine Methode zur Abbildung der Kalziumtrance in glatten Muskelorganen wie der Harnblase demonstriert, und wir haben eine Methode gezeigt, wie wir diese Kalziumtransienten mit einem Algorithmus analysieren, den wir im Labor entwickelt haben. Wichtig ist, dass Sie das Gewebe gut auf die Kalziumbildgebung vorbereiten. Im Fall des Gewebes, das wir heute demonstriert haben, geht es um die Entfernung von Bindegewebe und die Entfernung von Fett, das das Feld verdunkeln könnte.

Es ist auch wichtig, das Taschentuch in ein flaches Laken zu stecken. Nun, viel Glück bei Ihren Experimenten und vielen Dank fürs Zuschauen.