Objektiv Transplantation in Zebrafisch und ihre Anwendung in der Analyse von Eye-Mutanten

Um die Linsentransplantation bei Zebrafischen zu beginnen, werden transgene Spendertiere, die GFP exprimieren, sowie Wildtyp-Empfängerwirte zunächst jeweils 30 Minuten in separaten Petrischalen mit kalziumfreier Zebrafisch-Ringer-Lösung inkubiert. Anschließend werden die Fischlarven in zwei parallelen Reihen in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt eingebettet. Reihe A ist für die Spender, Reihe B für die Empfänger bestimmt. Dabei wird das gesamte Spenderauge entfernt, während vom Empfänger lediglich die Linse entfernt wird.

Das den Spenderlinsen umgebende Gewebe wird entfernt, bevor die Linsen in das Wirtsauge eingesetzt werden. Nach der Transplantation werden die Fische in beschrifteten 24-Loch-Platten aufbewahrt. Die transplantierte Linse sollte im Wirt GFP-Fluoreszenz zeigen.

Natürlich wurde am kontralateralen Auge des Wirts nicht operiert, und es exprimiert kein GFP. Hallo, ich bin Yj. Und ich bin Kaya McCullough, und wir stammen aus dem Labor von Dr. Yma Maki aus der Abteilung für Augenheilkunde an der Harvard Medical School. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Linsentransplantation bei Wildtyp-Zebrafischen Daniel Rio.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um Linsen von Wildtyp-Tieren auf Mutanten und umgekehrt zu transplantieren. Dadurch können wir bestimmen, ob mutierte Gene in der Linse autonom oder nicht-autonom funktionieren. Beginnen wir also.

Zebrabärblinge werden unter Standardbedingungen in einer Fischhaltungsanlage bei 28,5 °C im 14-Stunden-Licht-10-Stunden-Dunkel-Rhythmus gehalten. Am Abend vor dem geplanten Experiment werden Männchen und Weibchen in einem Becken mit einem Trenner platziert, um sie voneinander zu trennen. Das Genotyp dieser Tiere sollte Nachkommen mit GFP-Expression und der jeweils interessierenden Mutation hervorbringen. Parallel dazu wird innerhalb einer Stunde dieselbe Prozedur verwendet, um Kreuzungen zwischen nicht transgenen Wildtyp-Tieren durchzuführen.

Nachdem das Licht morgens angeht, entfernen Sie die Trennwände, damit die Fische sich paaren können. Nach 15 bis 30 Minuten gießen Sie das Aquarienwasser in ein Sieb, um die Embryonen zu sammeln, und spülen Sie diese mit einem Strahl Ei-Wasser aus einer Sprühflasche in eine 100 × 15 mm große Petrischale aus. Reinigen Sie anschließend die Eier, indem Sie mit einer Pipette unfertilisierte Embryonen und jeglichen Schmutz entfernen.

Ersetzen Sie das alte Ei-Wasser durch neues Ei-Wasser. Die Embryonen können vor der Linsentransplantation in einem 28,5 °C warmen Inkubator aufbewahrt werden. Wenn Sie bereit sind, mit der Transplantation fortzufahren, bereiten Sie die Embryonen vor, indem Sie das Korion manuell entfernen.

Mit einer Metallsonde und einer Pinzette müssen die entchorionierten Embryonen nun 30 Minuten lang in 0,2 % EDTA in kalziumfreiem ZFR inkubiert werden. Während der Inkubation können die für die Dissektion benötigten Nadeln vorbereitet werden. Für das Transplantationsverfahren wird eine geschärfte Nadel benötigt, um das das Augenlinsengewebe umgebende Gewebe und Woolies-Embryonen von Agros zu durchtrennen.

Es ist außerdem erforderlich, eine stumpfe Nadel zu verwenden, um die Spenderlinse zu bewegen und in den Wirt einzuführen, wobei entweder zuerst die Spitze einer Pasteurpipette mit einem Diamantmesser abgetrennt wird. Anschließend wird eine Glas-Kapillare in die Spitze der Pasteurpipette eingeführt, sodass etwa die Hälfte ihrer Länge darin liegt. Vorsichtig wird ein dünner Wolframdraht mit Hilfe einer Flamme in das offene Ende der Kapillare eingeführt.

Schmelzen Sie das Glas über dem Draht, indem Sie das Glaskapillar mit einer Pinzette festhalten und gleichzeitig das andere Ende der Nadel drehen. Das aufgeweichte Glas sollte sich spiralförmig um den Metalldraht winden und diesen festhalten. Dadurch entsteht eine stumpfe Nadel, um eine geschärfte Nadel herzustellen.

Halten Sie den Wolframdraht ein bis 1,5 Minuten über eine Flamme, um das Metall abzubrennen, sodass eine sehr feine Spitze entsteht. Überprüfen Sie die Qualität der Spitze mittels Mikroskopie.

Ein guter Pipettenspitze sollte sich nicht verbiegen oder krümmen und sich gleichmäßig zu einer feinen Spitze verjüngen, die nicht größer als 50 Mikrometer im Durchmesser ist. Sterilisieren Sie beide Nadeln einige Sekunden lang in der Flamme und lassen Sie sie abkühlen, bevor Sie mit dem Verfahren in einem Plastikzentrifugenröhrchen fortfahren. Bereiten Sie 1,2 % niedrigschmelzendes Agaros und kalziumfreies ZFR vor, das auf 40 °C in einem Wasserbad vorgewärmt wurde, entsprechend dem gewünschten Entwicklungsstadium vor. Nehmen Sie die Donorembryonen mit einer Pasteurpipette auf und geben Sie sie langsam in das Zentrifugenröhrchen mit Agaros ab. Inkubieren Sie die Eier etwa fünf Sekunden lang in dem Agaros.

Entfernen Sie die Embryonen mit der Pipette und ordnen Sie sie in einer Reihe auf einer 100-mm-Polystyrol-Petrischale an, indem Sie langsam und vorsichtig pipettieren; die meisten Embryonen liegen dabei seitlich mit dem Auge nach oben gerichtet. Wiederholen Sie diesen Vorgang nun mit den Wirtseizellen und ordnen Sie diese in einer parallelen Reihe zu den Donoreiern an, bevor das Agarose erstarrt. Verwenden Sie die stumpfe Nadel, um alle falsch ausgerichteten Embryonen so zu drehen, dass das Auge nach oben zeigt, sobald die Agarose erstarrt ist.

Überlagern Sie es mit einer 0,2 %igen Lösung aus Low-Melting-Point-Agarose. Entfernen Sie mit einer geschärften Nadel vorsichtig die Agarose um die Augen herum und schneiden Sie sehr vorsichtig das gesamte Spenderauge aus, das anschließend schwimmt. Danach lösen Sie die Linse aus dem Auge.

Dies erfolgt, indem die Nadel von unten nach oben durch das Augengewebe gezogen wird. Nur für den Wirt. Die Linse wird mit kleinen Bewegungen mittels einer geschärften Nadel herausgeschnitten, wobei so dicht wie möglich an der Linse geschnitten wird, ohne sie zu zerreißen.

Vermeiden Sie es, zu viel Gewebe aus dem restlichen Augapfel des Wirts zu entfernen. Sobald sie frei sind, schwimmen die Linsen im Medium. Mit der stumpfen Nadel schieben Sie die Spenderlinse vorsichtig direkt über die Position der Wirtslinse und drücken Sie sie anschließend mit der stumpfen Nadel in die richtige Position.

Die Wirtslinse kann entsorgt werden. Belassen Sie die Spender- und Wirtsembryonen 30 bis 60 Minuten lang in 1,2 % Aros. Das Embryomedium unterstützt die Wundheilung.

Danach lösen Sie die Embryonen mit einer geschärften Metallnadel von den Agros. Überführen Sie die Embryonen in eine 24-Loch-Platte mit Embryomedium. Jeder Embryo sollte ein separates Loch besetzen.

Stellen Sie sicher, dass die Vertiefungen ordnungsgemäß beschriftet sind, damit nach der Linsentransferierung klar ist, welcher Wirt zu welchem Spender gehört. Lassen Sie die Embryonen bei 28,5 °C bis zum gewünschten Zeitpunkt entwickeln. Zur phänotypischen Beobachtung untersuchen wir gewöhnlich die Linsendifferenzierung innerhalb von ein bis zwei Tagen.

Die vom Spender stammende Linse sollte nach der Transplantation in das Wirtauge die GFP-Expression beibehalten. Wenn ein mutantes Phänotyp in der Wildtyp-Umgebung nicht komplementiert wird, deutet dies darauf hin, dass der Phänotyp autonom ist. Wird er hingegen komplementiert, gilt der Phänotyp als nicht-autonom.

Und dies hat wichtige Auswirkungen auf die Funktion des zugrundeliegenden Gens. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man die Transplantation der Linse im Zebrafischembryo durchführt. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sehr sorgfältig darauf zu achten, wie man die Nadeln formt und wie man die Linse selbst präpariert.

Außerdem sollten die Embryonen schnell angeordnet werden, bevor das Eirollen eintritt, sobald die Transplantation abgeschlossen ist. Um nicht zu vergessen, Embryo und Medium auf acht im Holzheilungsprozess hinzuzufügen. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.