Name: Zu wissen, was zählt: Unbiased Stereology in der nicht-menschlichen Primaten Gehirn (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-14T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Lernen Sie die unverzerrte Stereologie zur Schätzung von Neuronenzahlen in definierten Gehirnregionen nicht-menschlicher Primaten. Diese Methode liefert präzise quantitative Daten für die Neurowissenschaft.

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Die Autoren bedanken sich bei Ikiel Ptito für seine weitere fachliche Unterstützung danken. NSERC Zuschuss zu MP.

Teil 1: Pre-Processing von Gewebe sollte nach Burke et al durchgeführt werden. (2009) 5. <ol><li> Kurz gesagt, sollten Gewebe gut mit Paraformaldehyd, Glutaraldehyd oder Formalin perfundiert werden. Dies kann durch Standard-transcardial Perfusion in der Regel verwendet, um andere Organe Ernte erreicht werden. In der vorliegenden Studie das Thema war tief mit Ketaminhydrochlorid (10 mg / kg, im), mit einer Überdosis Natrium-Pentobarbital (25 mg / kg, iv) eingeschläfert sediert und perfundierten transkardial mit 0,1 M PBS, bis sie vollständig ausgeblutet. Dies wird durch eine 4% Paraformaldehyd-Lösung in PBS für 5 min (~ 1 Liter) folgten. Tissue sollte gut mit paraformaldeyhde, Glutaraldehyd oder Formalin perfundiert werden. Das Gehirn soll stereotaxically blockiert, entfernt aus dem Schädel, gewogen, Volumen bestimmt, cryoprotected und gefrorenen 5. </li></ol> Teil 2: Systematische Sampling von Gewebe nach Burke et al. (2009) 6. <ol><li> In diesem Beispiel haben wir uns auf den Stirnlappen des Gehirns vervet. Der Verweis Raum wurde definiert, um kortikale Gewebe aus dem zentralen Sulcus der frontalen Pol der linken Hemisphäre gehören. Für unsere Zwecke der Folge wurden in 1 / 10 Sektionen in der gesamten Hirnrinde, im Schnitt bei 50 um gesetzt. Eine komplette Serie wurde mit Kresylviolett (Serie # 1) gefärbt. Serie 2 wurde aufgeteilt, so dass die Hälfte der Schnitte wurden mit Goldchlorid für Myelin Offenbarung und die andere Hälfte gefärbt Acetylcholinesterase (zur Abgrenzung von bestimmten subkortikalen Bereichen) gefärbt. Alle anderen Serien wurden in Antigen erhalten im Rahmen unserer langfristigen Forschungs-Pläne überhöht. </li></ol> Teil 3: Stereology (weitere Einzelheiten siehe Mouton 2002) 4 <ol><li> Die Gesamtschätzung der Zellzahlen (N) wird auf der Grundlage der folgenden Gleichung berechnet: N = ssf -1 x asf -1 x tsf -1 x Σ Q - Wo ssf Abschnitt Auswahlsatz ist, asf Bereich Sampling-Fraktion, TSF, wenn die Dicke Auswahlsatz (wo der gemessenen Dicke des Gewebes wird durch die Dissektor Höhe geteilt), und Σ Q - ist die Gesamtzahl der Objekte von Interesse gezählt innerhalb der Dissektor. Die nächsten Abschnitte dieses Protokoll zeigen, wie die SSF, asf, TSF und Σ Q zu bestimmen. </li><li> Section Sampling Fraction (non-computer based) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Die gesamte Referenzraum müssen auch von vorne nach hinten und dorsal werden, um ventral definiert. In diesem Beispiel waren wir daran interessiert, den Frontallappen und definiert sie als die Region von der Spitze des frontalen Pol (anterior) an den zentralen Sulcus (posterior) und der lateralen Sulcus (ventral) und die Insula ausgeschlossen. </li><li> Für den Frontallappen von diesem speziellen Thema insgesamt 760 Schnitte wurden systematisch mit 76 gefärbt Kresylviolett gesammelt. Da das Ziel 10 Abschnitte wurde während der Referenz-Raum 1 / 6 Kresylviolett gefärbten Schnitte wurden Proben entnommen, was zu einer Section Probe Anteil von etwa 1 / 60. Wir zufällig begann mit einer der ersten 6 Kresylviolett gefärbten Schnitten und systematisch abgetastet 1 / 6 danach. Insgesamt 13 Abschnitte wurden für das ausgewählte Motiv (Abbildung 2) abgetastet. </li></ol></li><li> Bereich Probenfraktion (computer-based) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Eine Pilotstudie zeigt die optimale Rasterweite, der Area Sampling Fraction, die Referenz-Raum mit ca. 100-300 disectors Probe. Innerhalb der Frontallappen, ergab eine Maschenweite von 2500 um 2 einen Schnitt von 254 disectors für dieses Thema (Abbildung 2). Die Größe der disector sollte zwischen etwa 0-5 gezählt Objekte, in diesem Fall Neuronen ergeben. </li></ol></li><li> Dicke Probenfraktion (computer-based) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> An jedem disector Lage, ist die Höhe des Gewebes gemessen, und ein Bruchteil dieser Höhe wird abgetastet, das ist wie die Dicke Sampling Fraktion bekannt. Zur Bestimmung der gemessenen Dicke über der z-Ebene zu konzentrieren, bis die erste Zelle rückt in den Fokus, dann wieder leicht nach oben an die Spitze des Abschnitts, dh bis das letzte Objekt erscheint nur unscharf. Zur Bestimmung der Unterseite des Gewebes durch die z-Ebene zu konzentrieren, bis die Zellen kaum sind unscharf. </li><li> Fokussierung durch die z-Ebene sollten die Zellen in jeder Tiefe gefärbt werden, falls nicht, kann dies ein unvollständiges Eindringen der Flecken oder ungleichmäßige Austrocknung des Gewebes zeigen, in welchem ​​Fall die Abschnitte sollten re-gefärbt werden. Diese Vorsichtsmaßnahme ist besonders wichtig für immungefärbt Gewebe, das Eindringen von immunoprobes erfordert durch relativ dicke Gewebeschnitte. Aus diesem Grund sollte immungefärbt Gewebe leicht mit einem basophile Färbung (zB Kresylviolett, hema gegengefärbt werdentoxylin), um genau zu bestimmen, Ober-und Unterseite des Profils und das Eindringen des Antikörpers zu bestätigen. In dieser Studie wurden die Schnitte auf einem Mikrotom Einstellung von 50 um in Scheiben geschnitten. Nachdem alle Gewebe Verarbeitung abgeschlossen war, lag der gemessene Gewebedicke 17.9μm (Abbildung 2), mit einer mittleren Schrumpfung von etwa 65%. Beachten Sie, dass diese Ergebnisse typische Schrumpfung stellen für die Gewebe für die Routine histologischen Präparat 7 verarbeitet. </li><li> Der Standardwert disector Höhe für den typischen Studie ist 10 um. Der Unterschied zwischen den disector Höhe und die gemessene Schichtdicke ist die Dachhöhe, das Volumen des Gewebes, wo keine biologischen Funktionen sind gezählt. Die Verwendung einer Dachhöhe vermeidet Gewebeschäden an der Schneide Oberflächen (zB verloren Caps). </li></ol></li><li> Die Gesamtzahl der Objekte gezählt, Σ Q - <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Zur Vermeidung von Verzerrungen aus Erkennungsfehler, ist es unerlässlich, dass eine einheitliche Definition für die jeweilige biologische Funktion von Interesse verfolgt wird. In diesem Fall waren wir daran interessiert, das Zählen Neuronen. Daher wurde ein Neuron als mit einer sichtbaren zentral gelegenen Nucleolus und ein klar definiertes Zytoplasma, während Gliazellen in der Regel fehlten sichtbare Nukleolen und Zytoplasma definiert. Zu diesem Thema 457 Neuronen wurden gezählt. </li></ol></li></ol> Teil 4: Stereologer - A Computerized Stereology System (Stereology Resource Center, Chester, MD) <ol><li> Die Stereologer-System fordert den Benutzer beim Ausfüllen der notwendigen Informationen in einer Schritt-für-Schritt-Mode. In der &quot;Study Information&quot; die Parameter der Studie sind etabliert. Da ein Verweis Platz für die Studie definiert werden müssen, sollten Sie die Lautstärke-Parameter ausgewählt (für den Bezugsraum der Cavalieri Schätzer sollte so gewählt werden). Object Lautstärke kann auch hier gewählt werden, um die Anzahl-gewichteten Volumen für die Bevölkerung der Objekte von Interesse zu schätzen. Für unser Beispiel wurde nur das Volumen des Referenz-Raum gewählt. Für jedes Objekt, wählen Sie die Anzahl und die Definition der Funktion von Interesse, in diesem Fall Neurons. </li><li> Fall Initialisierung: In diesem Abschnitt werden die Probenahme Informationen nachgewiesen wird. Geben Sie die Platte Abtastintervall (wenn getrennte Platten des Gewebes wurden vollständig und in Scheiben geschnitten auf jeder Seite in Reihenfolge platziert und geben Sie dann 1 hier). Geben Sie die Gesamtzahl der Schnitte durch den Verweis Raum (in diesem Fall 760) übernommen. Geben Sie dann den Abschnitt Abtastintervall (in diesem Fall 59). Das System berechnet dann die Zahl der Sektionen zu beproben (in diesem Fall 13). </li><li> Probe-Parameter: Dieser Abschnitt definiert das Raster und disector Größe. Für das Volumen, verwenden Sie eine geringe Vergrößerung 2.5x-10x auf die Raster unter dem Edit-Menü zu definieren. Object Vergrößerung sollte auf 100x (NA 1,3 oder 1,4) durchgeführt werden. Frame-Bereich ist die Größe des disector, in diesem Fall haben wir 50% Bildschirm. Die Rahmenhöhe beträgt die Dicke der disector; gesetzt bei 10 um hier. Die Spantabstand ist die Größe des Rasters. In unserer Pilotstudie haben wir festgestellt, dass 2500μm Erträge zwischen 150-200 Bilder in einem systematisch-einheitlicher Weise durch eine relativ große Referenz-Raum verteilt. Für kleinere Flächen sollte ein kleineres Rastermaß verwendet werden. Eine Pilotstudie identifiziert die optische Sonde Parameter für jeden einzelnen zu studieren. </li><li> Nach dem Studium Parameter festgelegt wurden, kann die Probenahme durch das Gewebe vor. Das Programm wird Sie auffordern, den ersten Abschnitt Probe. Schritt 1: Das Programm wird der Benutzer aufgefordert, bei schwacher Vergrößerung, um die Referenz-Platz auf dem Abschnitt zu verfolgen. Das System wird dann einen Raster über den Abschnitt über die Sonde Parameter und der Benutzer basieren, werden dann sicher, dass Punkte fallen in den Referenz-Raum. Wenn ein Punkt nicht innerhalb der Referenz-Raum einfach auf den Punkt klicken und werden nicht in das Volumen berechnet werden. Schritt 2: Das System wird ein neues Raster über die Referenz-Raum zu platzieren, basierend auf dem Spantabstand Parameter. Überprüfen Sie, ob die Schnittpunkte fallen in den Referenz-Raum. Schritt 3: Das System wird dann den Benutzer auffordern, auf die höhere Vergrößerung Ziel wechseln und die Bühne zum ersten Dissektor. Schritt 4: An diesem Punkt das System fordert den Benutzer auf die Definition Ober-und Unterseite des Abschnitts dann setzt das System die Probenahme Platz in der z-Achse. Schritt 5: Der Benutzer wird dann auf jedes Objekt, das innerhalb der disector fällt durch die z-Ebene klicken. Objekte, die die roten Linien oder der Unterseite des disector berühren kann nicht gezählt werden. Nachdem jedes Objekt gezählt wird, klicken Sie auf Weiter. Die Bühne wird zum nächsten disector und Schritte 4 und 5 wiederholen bewegen wird. Sobald alle disectors für den Abschnitt wurden gezählt, das System wird der Benutzer aufgefordert, die nächste fortlaufende Abschnitt einfügen, um sondiert werden. Schritte 1-5 werden wiederholt, bis alle die sequentielle Abschnitte werdenabgetastet worden. Das System wird dann die Berechnungen für asf, ssf, TSF und Σ Q. Basierend auf diesen Parametern, erzeugt das System einen geschätzten N, Referenz-Lautstärke und CE ist sowohl für die geschätzte Anzahl und Volumen. Es wird auch Empfehlungen effizienter zu werden oder die CE (Abbildung 2) zu reduzieren. </li></ol> Teil 5: Repräsentative Ergebnisse: Unvoreingenommene Stereologie bietet effiziente und zuverlässige Schätzungen von Zellpopulationen in einem Referenz-Raum. Es gibt eine Reihe von Computer-based stereologische Systeme zur Verfügung, die alle auf eine systematische Probenahme und eine definierte Referenz-Raum verlassen. Wir haben die BioQuant Life Sciences-System verwendet werden, um die gesamte neuronalen Population der Großhirnrinde von 2-jährigen Meerkatzen Schätzung mehr als 828 Millionen (Abbildung 3) mit einem durchschnittlichen CE von 0,042 werden. Wir haben anschließend die Stereologer System verwendet, um schätzen, dass der Frontallappen für etwa die Hälfte der Zahl der kortikalen Neuronen 8. <img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1 Computer-based Stereology Systems. Das Basis-Set-up des Stereologie Systeme ist der gleiche, ein Mikroskop mit einem motorisierten Stufe (xyz), eine Bühne Controller, Videokamera, Computer und Software. Das System, das letztlich gewählt wird, sollte auf Effizienz, Bedürfnisse und Kosten-Analyse zugrunde liegen. <div style="border:1px #000000 solid"><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Informationen zum Studium </td></tr><tr><td> Study Namen </td><td> Frontal Cortex </td></tr><tr><td> Principal Investigator </td><td> MB </td></tr><tr><td> Spezies </td><td> AG </td></tr><tr><td> Reference Raum Frontal </td><td> Kortex </td></tr><tr><td colspan="2"> Hinweise </td></tr><tr><td colspan="2"> CASE INFORMATION </td></tr><tr><td> Data Collector </td><td> MB </td></tr><tr><td> Datum </td><td> Mittwoch, 30 April, 2008 </td></tr><tr><td> Gruppe </td><td> Kontrolle </td></tr><tr><td> Thema </td><td> O26 </td></tr><tr><td colspan="2"> Hinweise </td></tr><tr><td colspan="2"> Abtasteigenschaften </td></tr><tr><td> Slab Sampling Interval </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Gesamtzahl der Sektionen </td><td> 760 </td></tr><tr><td> Section Sampling Interval </td><td> 59 </td></tr><tr><td> Ab Section </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="2"> FRAKTIONEN </td></tr><tr><td> ASF </td><td> 0,0002 </td></tr><tr><td> SlabSF </td><td> 1,0000 </td></tr><tr><td> SSF </td><td> 0,0169 </td></tr><tr><td> TSF </td><td> 0,5587 </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="6"> ERGEBNISSE Zusammenfassung </td></tr><tr><td> Parameter </td><td> Sonde </td><td> Name </td><td> Ergebnis </td><td> CE </td><td> SD </td></tr><tr><td> Dicke </td><td> --- </td><td> --- </td><td> 17,8996 μ </td><td> --- </td><td> --- </td></tr><tr><td> Anzahl </td><td> Disector </td><td> Neuron </td><td> 243833769.1473 </td><td> 0,0474 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Volumen </td><td> Cavalieri Punktraster </td><td> Volumen </td><td> 1719769397954.1284 μ ^ 3 </td><td> 0,0078 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> EMPFEHLUNGEN </td></tr><tr><td> Sonde </td><td> Objekt-Nummer (Neuron) </td></tr><tr><td> CE </td><td> 0,0474 </td></tr><tr><td> Empfehlungen </td><td> CE ist akzeptabel. </td></tr></tbody></table&gt; <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Anzahl der Disectors gesehen zu hoch ist, erhöhen Disector Abstand. </td></tr><tr><td> Sonde </td><td> Region Volume (Lautstärke) </td></tr><tr><td> CE </td><td> 0,0078 </td></tr><tr><td> Empfehlungen </td><td> CE ist akzeptabel. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="3"> ABSCHNITT ERGEBNISSE </td></tr><tr><td> Abschnitt </td><td> Neuron NumObjects Neuron NumCorners </td><td> Volumen RegPoints </td></tr><tr><td> 1. 40 </td><td> 48 </td><td> 34 </td></tr><tr><td> 2. 26 </td><td> 52 </td><td> 44 </td></tr><tr><td> 3. 29 </td><td> 56 </td><td> 48 </td></tr><tr><td> 4. 39 </td><td> 100 </td><td> 83 </td></tr><tr><td> 5. 49 </td><td> 112 </td><td> 83 </td></tr><tr><td> 6. 53 </td><td> 156 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 7. 65 </td><td> 128 </td><td> 106 </td></tr><tr><td> 8. 45 </td><td> 108 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 9. 52 </td><td> 100 </td><td> 77 </td></tr><tr><td> 10. 26 </td><td> 64 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> 11. 21 </td><td> 44 </td><td> 44 </td></tr><tr><td> 12. 11 </td><td> 36 </td><td> 32 </td></tr><tr><td> 13. 1 </td><td> 12 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table></div> Abbildung 2 Ergebnisse der Fontal Lobe den Stereologer System erhalten. Für den Stirnlappen, der längste Teil des stereologische Prozess in die systematische Entnahme und Schneiden war. Topographie, Volumen und neuronalen Schätzung wurden in etwa einen Tag für jedes Fach abgeschlossen. Die linke Hemisphäre war abgetastet und die Zahl wird in den Text, um ungefähre Schätzung für beide Hemisphären verdoppelt. <img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3 Cortex neuronalen Population Estimate mit BioQuant erhalten. Die BioQuant System erfordert eine genaue Topographie vor Zellzählung. Hier durchschnittlich 13 Schnitte wurden beprobt. Kortikale Topographie und die anschließende Volumen Schätzung nahm zwischen 15-20 Stunden für jedes Fach. Topographie wurde unter einem 2.5x Ziel durchgeführt und Zählung erfolgte unter Verwendung eines 100x Ölimmersionsobjektiv (NA 1,3). Jeder 100. Abschnitt wurde in der linken Hemisphäre mit durchschnittlich 180 disectors abgetastet gewählt. Nach der Topographie wurde abgeschlossen neuronalen Zählung dauerte etwa einen Tag. Die linke Hemisphäre war abgetastet und die Zahl wird in den Text, um ungefähre Schätzung für beide Hemisphären verdoppelt.

<ol><li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator%5BTitle%5D)+AND+%22Aat+Rec%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> Aat Rec. 231, 482-497 (1991).</li>
<li>Saper, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Any+way+you+cut+it%3A+a+new+journal+policy+for+the+use+of+unbiased+counting+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Any way you cut it: a new journal policy for the use of unbiased counting methods.</a> J Comp Neurol. 364, 5-5 (1996).</li>
<li>Sterio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unbiased+estimation+of+number+and+sizes+of+arbitrary+particles+using+the+disector%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector.</a> J Microsc. 134, 127-136 (1984).</li>
<li>Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMouton%2C+PR+%22Principles+and+Practices+of+Unbiased+Stereology%22">Principles and Practices of Unbiased Stereology</a>. , The Johns Hopkins University Press. Baltimore. (2002).</li>
<li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+non-human+primate+brain+in+stereotaxic+space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li>
<li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+banking%3A+Making+the+most+of+your+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Brain banking: Making the most of your research.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li>
<li>Manaye, K. F., Wang, P., O'Neil, J., Huafu, S., Tizabi, Y., Thompson, N., Ottinger, M. A., Ingram, D. K., Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathological+Quantification+Of+Dtg+APP%2FPS1%3A+Neuroimaging%2C+Stereology%2C+And+Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22AGE%22%5BJournal%5D)">Neuropathological Quantification Of Dtg APP/PS1: Neuroimaging, Stereology, And Biochemistry.</a> AGE. 29, 87-96 (2009).</li>
<li>Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+reduction+in+frontal+cortex+of+primates+after+prenatal+alcohol+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure.</a> Neuroreport. 20, 13-17 (2009).</li>
<li>Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Batch+immunostaining+for+large-scale+protein+detection+in+the+whole+monkey+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li>
</ol>

Unvoreingenommene Stereologie in einem Primaten Gehirn ist ähnlich wie bei anderen biologischen Proben. Doch angesichts der Größe des Primatengehirn, ist eine sorgfältige Verarbeitung Plan empfohlen, da eine einzelne Hemisphäre des grünen Meerkatze liefert mehr als 1200 Teile, wenn sie bei 50 um in Scheiben geschnitten. Zunächst empfehlen wir stereotaxically blockiert das Gehirn in 1 cm-Blöcke, die eine Standard-Schnittfläche zwischen den Blöcken und Themen bietet, minimiert Teilstrecken zwischen den Blöcken und bietet ...

<table><tbody><tr><td>Stereologer</td><td>Stereology Resource Center (Chester, MD)</td><td>www.disector.com</td><td></td></tr><tr><td>Stereologie-Tool-Kit-Stereologer-System</td><td>BioQuant Life Sciences (Nashville, TN)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StereoInvestigator</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zu wissen, was zählt: unbiased stereology in der nicht-menschlichen primaten gehirn

Knowing What Counts: Unbiased Stereology in the Non-human Primate Brain

Die nicht-menschlichen Primaten ist ein wichtiger translationale Arten für das Verständnis der normalen Funktion und Krankheit Prozesse des menschlichen Gehirns. Unvoreingenommene Stereologie, die Methode als state-of-the-art für die Quantifizierung von biologischen Objekten in Gewebeschnitten akzeptiert<sup&gt; 2</sup&gt; Erzeugt zuverlässige Strukturdaten für biologische Funktionen im Gehirn von Säugetieren<sup&gt; 3</sup&gt;. Die wichtigsten Komponenten des Ansatzes sind unvoreingenommene (systematisch-Random) Probenahme von anatomisch definierten Strukturen (Referenz Leerzeichen) Quantifizierung der Zellzahl und Größe, Faser-und Kapillar-Längen, Flächen, Volumen und regionalen räumlichen Verteilungen von biologischen Objekten innerhalb der kombinierten Referenzraum<sup&gt; 4</sup&gt;. Zu den Vorteilen dieser stereologische Ansätze im Vergleich zu früheren Methoden ist die Vermeidung aller bekannten Quellen von systematischen (nicht-zufällige) Fehler, die sich aus falschen Annahmen und nicht überprüfbare Modelle. Diese Studie dokumentiert eine biologische Anwendung von computergestützten Stereologie zur gesamten neuronalen Population im frontalen Kortex der grünen Meerkatze Gehirn Schätzung (<em&gt; Chlorocebus aethiops sabeus</em&gt;) Mit Hilfe von zwei kommerziell erhältlichen Stereologie Programme, BioQuant Life Sciences und Stereologer (Abbildung 1). Darüber hinaus, um den Kontrast und Vergleich der Ergebnisse aus beiden BioQuant und<em&gt; Stereologer</em&gt; Systeme, liefert diese Studie ein detailliertes Protokoll für die<em&gt; Stereologer</em&gt; System.

Die anatomische Organisation des Primas Gehirn kann wichtige Einblicke in normalen und pathologischen Bedingungen beim Menschen liefern. Unvoreingenommene Stereologie ist eine Methode zur genauen und effizienten Schätzung der insgesamt Neuron-Nummer (oder anderen Zelltyp) in einem bestimmten Bezugsraum<sup&gt; 1</sup&gt;.

Zu wissen, was zählt: Unbiased Stereology in der nicht-menschlichen Primaten Gehirn

Nicht-menschliche Primaten sind wichtige translationale Spezies für das Verständnis der Normalfunktion und der Krankheitsprozesse des menschlichen Gehirns. Unvoreingenommene ...

Dieses Verfahren beginnt mit der Definition des Referenzraums. Ein stereotaktischer Atlas kann hilfreich sein, um die Grenzen des interessierenden Bereichs festzulegen. Anschließend ordnen Sie die Objektträger und bestimmen die Schnittabtastfrequenz.Fügen Sie den ersten zu untersuchenden Abschnitt in das Mikroskop ein und füllen Sie die Probennahmeparameter aus. Im Theologist-System wird ein Raster über den Referenzraum gelegt, und an jedem Schnittpunkt wird ein optischer Dissektor untersucht. Sobald alle optischen Dissektoren über alle Abschnitte hinweg erfasst wurden, liefert das Stereosystem die Ergebnisse für die Studie.Hallo, ich bin Dr. Mark Burke vom Labor für Visuelle Neurowissenschaften an der Fakultät für Optometrie der Universität Montreal. Hallo, ich bin Dr. Shaheen Zur, ebenfalls vom Labor für Visuelle Neurowissenschaften an der Fakultät für Optometrie der Universität Montreal. Guten Tag, ich bin Dr. Morris Petto, Leiter des Labors für Visuelle Neurowissenschaften an der Fakultät für Optometrie der Universität Montreal.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Durchführung einer unvoreingenommenen Radiologie beim nichtmenschlichen Primaten. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Gesamtzahl der Neuronenpopulationen in verschiedenen Hirnarealen abzuschätzen. Beginnen wir also.Beginnen Sie dieses Protokoll mit einem zuvor perfundierten Gehirn. Nach der Fixierung mit einem Fixierungsmittel wie paraformaldehyd sollte das Gehirn im stereotaktischen Raum blockiert, kryoprotegiert und eingefroren werden. Für eine detaillierte Beschreibung dieser Protokolle konsultieren Sie bitte unseren jüngsten JoVE-Artikel „Dissecting the Non-Human Primate Brain“.Im stereotaktischen Raum sollte das Gehirn systematisch so präpariert werden, dass es den gesamten Referenzraum enthält. Um dieses Protokoll im Detail einzusehen, konsultieren Sie unseren jüngsten JoVE-Artikel „Brain Banking, making the most of your research specimens“. In diesem Experiment verwenden wir das Frontalhirn des Vervet-Gehirns.Die Serie umfasst eine von 10 Schnittserien durch die gesamte Großhirnrinde und wird in 50 Mikrometern geschnitten. Um die geschätzte Zellanzahl N zu berechnen, verwenden wir die folgende Gleichung, wobei SSF der Schnitt-Stichproben-Bruchteil und A SF der Flächen-Stichproben-Bruchteil ist.TSF ist der Dicken-Stichprobenanteil, bei dem die gemessene Dicke des Gewebes durch die Dissektorhöhe geteilt wird, und ein Würfel entspricht der Gesamtanzahl der innerhalb des Dissektors gezählten Objekte von Interesse. Um den Schnitt-Stichprobenanteil zu bestimmen, muss der gesamte Referenzraum von anterior bis posterior sowie von dorsal bis ventral genau definiert sein. Hier interessieren wir uns für das Frontallappen, das wir als den Bereich von der Spitze des Frontalpols bis zum Sulcus centralis und dem Sulcus lateralis definieren.Unter Ausschluss des Insellappens für den Frontallappen dieses Probanden wurden insgesamt 760 Schnitte systematisch gesammelt, wobei 76 mit Crest-Violett gefärbt wurden. Da das Ziel 10 Schnitte über den gesamten Referenzraum war, wurde jeweils einer von sechs mit Crest-Violett gefärbten Schnitten entnommen. Dies führt zu einem Schnitt-Stichprobenanteil (SSF) von etwa einem von 60.Wir beginnen zufällig mit einem der ersten violetten Färbungsschnitte der Kammregion und untersuchen systematisch jeweils jeden sechsten Schnitt. Anschließend werden insgesamt 13 Schnitte für das ausgewählte Exemplar entnommen. Um Verzerrungen durch Erkennungsfehler zu vermeiden, ist es unerlässlich, dass einer standardisierten Definition für die betreffende biologische Struktur gefolgt wird.Hier lag unser Interesse darin, Neuronen zu zählen, wobei wir ein Neuron als Zelle definierten, die einen sichtbaren, zentral gelegenen Zellkern und ein deutlich abgegrenztes Zytoplasma aufweist. Für diese Studie verwenden wir Stereo, ein computergestütztes Theologiesystem. Das System fordert den Benutzer schrittweise dazu auf, die erforderlichen Informationen einzugeben.Im Abschnitt zur Studieninformation werden die Parameter der Studie festgelegt. Der Volumenparameter sollte ausgewählt werden, um einen Referenzraum für die Studie zu definieren. Das Objektvolumen kann ebenfalls hier ausgewählt werden, um das volumenbezogene, zahlenwichtige Volumen für die Population der interessierenden Objekte zu schätzen.In diesem Fall wurde nur das Volumen des Referenzraums ausgewählt. Wählen Sie für jedes Objekt die Anzahl aus und definieren Sie das Merkmal von Interesse, hier Neuronen. Um die Stichprobeninformationen festzulegen, geben Sie das Schicht-Stichprobenintervall ein.Wenn separate Gewebeschnitte vollständig aufgeschnitten und jeder Abschnitt in aufeinanderfolgender Reihenfolge platziert wird, geben Sie hier eine Zahl ein. Geben Sie anschließend die Gesamtanzahl der durch den Referenzbereich gezogenen Abschnitte ein und danach das Stichprobenintervall für die Abschnitte. Das System berechnet dann die Anzahl der zu entnehmenden Abschnitte.Um das Raster zu definieren und eine Größe zu sezieren, verwenden Sie eine niedrige Vergrößerung von 2,5 bis 10x. Um den Rasterabstand im Bearbeitungsmenü für das Volumen festzulegen, sollte die Objektvergrößerung bei 100x erfolgen. Der Rahmenbereich entspricht der Größe des Dissektors.In diesem Fall verwendeten wir 50 % Screen. Die Rahmenhöhe entspricht der Dicke des Dissektors. Hier ist sie auf 10 Mikrometer eingestellt und bestimmt den Gewebestichprobenanteil.Der Abstand der Rahmen ist die Größe des Rasters. Für kleinere Bereiche sollte eine kleinere Rastergröße für dieses Thema verwendet werden, und innerhalb des Frontallappens ergibt eine Rastergröße von 2.500 Mikrometern durchschnittlich 254 Dissekatoren. Die Größe des Dissektors sollte zwischen null und fünf gezählte Objekte ergeben.In diesem Fall werden sowohl die Dissektorgröße als auch die Gittergröße verwendet, um den Flächen-Stichprobenbruch zu berechnen. Sobald die Studienparameter festgelegt wurden, kann die Stichprobenentnahme im Gewebe unter niedriger Vergr&ouml;&szlig;erung beginnen. Das Programm fordert den Benutzer auf, den Referenzraum auf dem Schnitt nachzuzeichnen.Das System legt dann basierend auf den pro-Parametern ein Raster über den Abschnitt. Dieses Raster wird zur Volumenberechnung verwendet. Anschließend überprüft der Benutzer, ob die Punkte innerhalb des Referenzraums liegen.Wenn sich ein Punkt außerhalb des Referenzraums befindet, klicken Sie einfach auf den Punkt, und er wird nicht in die Volumenberechnung einbezogen. Anschließend legt das System basierend auf den Rahmenabstandsparametern ein neues Raster über den Referenzraum. Die Schnittpunkte dieses Rasters bestimmen die Position jedes Dissektors.Überprüfen Sie nun, ob die Schnittpunkte innerhalb des Referenzraums liegen. Das System fordert den Benutzer auf, zum Objektiv mit höherer Vergr&ouml;&szlig;erung zu wechseln und den Objekttisch zum ersten Dissektor zu bewegen. An diesem Punkt fordert das System den Benutzer auf, die obere und untere Grenze des Schnitts festzulegen.Dies erfolgt, um den TSF, den Dicken-Stichproben-Anteil, zu bestimmen, und wird an jeder Dissektor-Position wiederholt. Um die gemessene Dicke zu ermitteln, fokussieren Sie durch die Z-Ebene, bis die erste Zelle scharf wird. Gehen Sie dann leicht zurück an die Oberseite des Schnitts, bis das letzte Objekt gerade unscharf erscheint.Danach, um die Unterseite des Gewebes zu finden, fokussieren Sie durch die Z-Ebene, bis die Zellen beim Fokussieren durch die Z-Ebene gerade noch unscharf sind. Beachten Sie, dass die Zellen in jeder Tiefe angefärbt sein sollten. Andernfalls könnte dies auf eine unvollständige Penetration der Färbung oder eine nicht gleichmäßige Dehydrierung des Gewebes hinweisen, in welchem Fall die Schnitte erneut angefertigt werden sollten.Die Standard-Dissektorhöhe für diese Studie beträgt 10 Mikrometer. Die Differenz zwischen der Dissektorhöhe und der gemessenen Schnittdicke ist die Schutzhöhe, also das Gewebevolumen, in dem keine biologischen Strukturen gezählt werden. Anschließend legt das System den Stichprobenraum in der Z-Achse fest.Der Benutzer klickt dann auf jedes Objekt, das innerhalb des Dissektors durch die Z-Ebene fällt. Objekte, die die roten Linien oder den unteren Rand des Dissektors berühren, werden nicht gezählt. Nachdem jedes Objekt gezählt wurde, klicken Sie auf „Weiter“.Dies dient zur Berechnung der Gesamtanzahl der Objekte. Die Bühne bewegt sich zum nächsten Dissektor und wiederholt die vorherigen Schritte. Sobald alle Dissektoren für den Abschnitt gezählt wurden, fordert das System den Benutzer auf, den nächsten sequentiellen Abschnitt einzulegen, der untersucht werden soll.Die Schritte werden wiederholt, bis alle sequenziellen Abschnitte beprobt wurden. Nach Abschluss liefert das System die Berechnungen für die Flächenstichprobe, die Bruchteil-Abschnitts-Stichprobe, die Bruchteil-Gewebe-Stichprobe und die Gesamtanzahl der Objekte. Basierend auf diesen Parametern generiert das System ein geschätztes n-Referenzvolumen sowie Fehlerkoeffizienten sowohl für die geschätzte Anzahl als auch für das Volumen.Es liefert außerdem Empfehlungen, um effizienter zu werden oder den Fehlerkoeffizienten zu verringern. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man eine unverzerrte Theologie in einer biologischen Probe durchführt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, systematisch über den gesamten Referenzraum zu proben, die Gewebestärke in jedem optischen Dissektor sorgfältig zu messen und ein klar definiertes Untersuchungsobjekt zu haben.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

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Biology

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