Name: Messen pflanzlichen Zellwand Extension (Creep) durch saure pH-Wert und von Alpha-Expansin Induced (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Erfahren Sie die Messung von Zellwand-Dehnung (Creep) bei Pflanzen durch sauren pH-Wert und Alpha-Expansin-Induktion. Diese Methode mit dem Kraft-Extensometer erleichtert die Untersuchung pflanzlicher Wachstumsmechanismen.

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Die hier gezeigten Techniken wurden mit Förderung durch Zuschüsse aus dem Department of Energy (Bioenergy Sciences) und der National Science Foundation entwickelt.

Teil 1: Anbau und Lagerung geeignet Pflanzenmaterial <ol><li> Nach unserer Erfahrung dienen junge Hypokotylen aus etiolierten Gurkenkeimlingen als eine bequeme Quelle für Zellwandmaterial für diese Experimente. Gurken Samen werden auf feuchtem Papier in einer lichtdichten Box, die in einem abgedunkelten Schrank in einem Raum mit konstanter Temperatur bei 26 gesetzt ist ° C zu halten gesät Die genaue Temperatur ist nicht entscheidend, wie alles, was zwischen 22 ° und 30 ° C sollte in Ordnung sein, aber die Temperatur bestimmen, wie schnell die Sämlinge eine angemessene Stufe der Entwicklung zu erreichen. Je wärmer die Temperatur, desto schneller werden die Sämlinge entwickeln. Wir verwenden in der Regel Sämlinge, wenn sie auf ca. 5 cm in der Länge, die 3-4 Tagen erreicht wird nach der Aussaat gewachsen. Es ist wichtig, dass die Sämlinge im Dunkeln gezüchtet werden, da schon geringe Mengen von Licht beeinflussen sowohl die Rate der Keimling Entwicklung und der Zellwand Eigenschaften, die wir mit dieser Technik zu messen. Am Tag 3 können Sie Einblick in die Box, mit einem dunklen grün gefilterte Licht, auf Sämling Entwicklung zu überprüfen. </li><li> Sämlinge sind schnell geschnitten und verpackt in kleinen Plastikdosen, 100-150 Sämlinge pro Feld und bei -80 ° C. Bei dieser Temperatur bleiben sie nützlich für Wochen. </li></ol> Teil 2: Vorbereiten Zellwand Proben <ol><li> Kleine Gruppen (8-10) von gefrorenen Schnitt Sämlinge aus dem Gefrierschrank, um eine isolierte Behälter mit einer -80 Gefrierschrank Block übertragen. </li><li> Die Kutikula für das Hypokotyl ist mit Carborundum abgerieben. Dies wird durch wiederholtes Ziehen der Hypokotyl zwischen Daumen und Zeigefinger, die mit einem dicken Brei aus nassen carborundum pulverbeschichtet sind fertig. Es dauert ein wenig Erfahrung, um die richtige Menge an Druck zu nutzen wissen: zu viel Druck und die Epidermis beginnt zu geschreddert und zerrissen, zu wenig Druck und die Nagelhaut wird nicht permeabilisiert werden. Man muss auch schnell arbeiten, weil die gefrorenen Hypokotyl taut, es schlaff und schwer zu verwalten wird. </li><li> Der Abrieb Hypokotyl ist in Eiswasser getaucht, um die meisten der anhaftenden Carborundum und dann auf Eiswasser gelagert zu entfernen, während die restlichen Hypokotylen in ähnlicher Weise zubereitet werden. </li><li> Die Hypocotyle sind auf die gewünschte Länge, in der Regel 1,2 cm schneiden, mit einem neuen einschneidig Rasierklinge und dann auf eine Glasplatte ausgerichtet. </li><li> Jetzt müssen wir die Wände zu reduzieren, um Zellsaft zu entfernen und zu erleichtern Spannen. Eine zweite Glasplatte befindet sich oben auf die Gruppe von 8-10 Proben platziert und bildet ein Sandwich. Ein Gewicht (400-500 g) befindet sich oben auf dem Objektträger für 5 min gestellt. Für das Gewicht verwenden wir routinemäßig ein Becherglas mit einer geeigneten Menge Wasser. </li><li> Optionaler Schritt: Je nach Experiment, die Hypokotyle kann mit einer kurzen Wärmebehandlung an dieser Stelle inaktiviert werden. Dazu binden wir die Glasplatten zusammen mit einem Paar von Gummibändern, legen Sie die Montage in einen Behälter mit 100 ml deionisiertem Wasser bei Raumtemperatur und legen Sie sie in der Mikrowelle bei voller Leistung. Mit unserer Mikrowelle das Wasser beginnt bei ca. 50 s kochen und wir stoppen die Mikrowelle 15 s nach dem Kochen beginnt. Das heiße Wasser wird schnell abgegossen und ersetzt mit kaltem Wasser, um eine Denaturierung zu stoppen. Eventuell müssen Sie diese Zeiten variieren, wie Ihre Mikrowelle kann anders als bei uns. Mit übermäßige Erwärmung der Proben werden schwach und brechen leicht. Bei ungenügender Beheizung des endogenen expansin nicht inaktiviert und der Wand Proben behalten einige Reaktionsfähigkeit auf sauren pH-Wert. </li></ol> Teil 3: Extensometer Setup <ol><li> Die Wand Proben werden nun in einer konstanten Kraft Extensometer geklemmt. Dies ist eine custom-built-Gerät, das aus einem Plexiglas Küvette besteht für die Abhaltung der basalen Ende der Wand Probe und eine bewegliche Klemme an der apikalen Ende der Probe. Die beweglichen Bügel am Ende einer Stange, die durch die offenen Spulen von einem Lagesensor Pässe montiert ist, ein LVDT oder &quot;Linear Variable Differential Transformer&quot;, die elektronisch erfasst die Position eines kleinen Metallzylinder oder &quot;Kern&quot;, das heißt an der Stange. Das obere Ende der Stange ist mit einem Hebel mit einem verstellbaren Gegengewicht verbunden. Dieser Hebel wirkt eine einstellbare Menge an aufwärts gerichtete Kraft auf die Wand Probe. Die Kraft wird durch das Hinzufügen oder Entfernen kalibrierten Gewichten aus Metall zum anderen Ende des Hebels eingestellt. </li><li> Zurück an der Wand Probe - der basalen Ende des Hypokotyl Probe wird mit feinen Pinzetten und ~ 2-3 mm von der apikalen Ende ist in zwischen den geöffneten Rachen des beweglichen Klammer gesetzt abgeholt. Diese Klemme ist eine federbelastete Krokodilklemme, deren Metall-Backen sind mit Kunststoff beschichtet, um einen direkten Kontakt zwischen der Metalloberfläche und der Pufferlösung oder an der Wand Probe zu verhindern. In unserer Erfahrung Metallionen können Lauge aus der Klemme und hemmen die Wand der Fähigkeit zu erweitern, und so halten wir das Metall bedeckt. </li><li> Halten Sie die beweglichen Klemmanordnung in einer Hand, ist die basale Ende der Wand Exemplar jetzt zwischen den beiden klappbaren Teile des Plexiglas Küvette und die Küvette manövriertStücke werden zusammen gebracht und fest verschraubt, damit Verriegelung am unteren Ende der Wand Probe in der Küvette. </li><li> Die bewegliche Klammer Montage ist nun sanft gelöst, so dass die volle Kraft der Gegengewichte an der Wand Probe übertragen werden. Wir verwenden routinemäßig insgesamt Gegengewicht von 20 g für die Wand-Proben aus Gurke Hypokotylen vorbereitet. Andere Wandmaterialien oder Experimente könnten erfordern unterschiedliche Gewichte. </li><li> Die Küvette wird mit Puffer gefüllt (200 UL) und die Position der Küvette nach oben oder unten mit einer Stellschraube, so dass die bewegliche Klemme am unteren Ende des LVDT Messbereich gebracht wird. Unsere LVDT ist es, eine Datenerfassungseinheit von einem Mikrocomputer verbunden ist, und so beobachten wir LVDT Position durch den Computer. Wir haben acht LVDT Baugruppen parallel mit einem Computer, die uns zu 8 Wand Proben gleichzeitig laufen zu lassen verbunden. Der Computer zeichnet die Position von jedem der LVDT Baugruppen einmal alle 30 s. </li></ol> Teil 4: Mess-Erweiterung als Reaktion auf saure pH-Wert oder expansin - Repräsentative Ergebnisse <ol><li> [First Experiment] Für die Messung des Säure-induzierten Verlängerung, beginnen wir mit einheimischen Wand Proben (dh nicht mit Hitze inaktiviert) und neutralen Puffer wird in die Küvette gegeben. Die Wand Proben zu verlängern für ein paar Minuten, in Reaktion auf die zusätzliche Spannung, aber die Erweiterung zerfällt zu einer niedrigen Rate nach ein paar Minuten. Unsere Computer lässt uns Monitor entweder die Veränderung der Länge der Probe (dh die Veränderung der Position des beweglichen Klammer, nach dem Start des Experiments), oder wir können die zeitliche Ableitung der Position zu überwachen, in anderen Worten: die Rate der Erweiterung . Die Erweiterung Rate stabilisiert auf einen niedrigen Wert mit der Zeit. </li><li> Nach ca. 20 min, ist die neutrale Puffer entfernt. Wir verwenden ein dünnes Metallrohr, aus einer großen Spurweite Injektionsnadel aus, verbunden mit einer Vakuumpumpe in den Puffer schnell zu entfernen, mit minimaler Störung der Wand oder der mechanischen Montage. Saure-Puffer zugegeben, manchmal mit 1-2 schnellen Austausch der kompletten Austausch zu sauren Puffer zu versichern. Dann haben wir lehnen Sie sich zurück und beobachten Sie die Reaktion der Wand. In der Regel können wir die Beschleunigung der Erweiterung in wenigen Minuten zu erkennen. Nach 60 min wir haben in der Regel genügend Informationen, um die Erweiterung Antwort zu bewerten, obwohl in einigen Fällen die Messungen auf längere Zeiträume erstrecken können. </li><li> [Zweiter Versuch] Zur Messung der expansin-induzierte Zellwand-Erweiterung, beginnen wir mit hitzeinaktiviertem Wand Proben und sauren Puffer in die Küvette gegeben. Wie bei dem ersten Versuch, die Rate der Zellwand Erweiterung allmählich stabilisiert auf einen niedrigen Wert, weil der Mangel an funktionellen expansin. </li><li> Nach ca. 20 min ist expansin Protein in die Küvette durch &quot;Aufstocken&quot; mit dem Puffer in die Küvette mit 10-20 uL einer expansin Lösung gegeben. Die expansin schnell dringt durch die Zellwand Probe und innerhalb weniger Minuten sehen wir, dass die Erweiterung gestiegen ist. Diese Erweiterung Antwort kann für eine Stunde oder mehr verfolgt werden. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1263/fig1.png" alt="" width="600" height="469" /> Abbildung 1: Überblick über Verfahren zur Vorbereitung der Zellwände zu Säure-induzierte oder expansin-induzierte Wandfortsatz beurteilen.

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+long-term+extension+of+isolated+cell+walls+from+growing+cucumber+hypocotyls%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Characterization of long-term extension of isolated cell walls from growing cucumber hypocotyls.</a> Planta. 177, 121-130 (1989).</li>
<li>Rayle, D. L., Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Acid+Growth+Theory+of+auxin-induced+cell+elongation+is+alive+and+well%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Acid Growth Theory of auxin-induced cell elongation is alive and well.</a> Plant Physiol. 99, 1271-1274 (1992).</li>
<li>Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin-induced+growth+of+Avena+coleoptiles+involves+two+mechanisms+with+different+pH+optima%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Auxin-induced growth of Avena coleoptiles involves two mechanisms with different pH optima.</a> Plant Physiol. 99, 1556-1561 (1992).</li>
<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loosening+of+plant+cell+walls+by+expansins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Loosening of plant cell walls by expansins.</a> Nature. 407, 321-326 (2000).</li>
<li>McQueen-Mason, S., Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+endogenous+proteins+that+induce+cell+wall+expansion+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Two endogenous proteins that induce cell wall expansion in plants.</a> Plant Cell. 4, 1425-1433 (1992).</li>
</ol>

Für diese Demonstration verwendeten wir Zellwände von Gurken Hypokotylen, weil sie sich als eine zuverlässige Quelle für Wand-Proben, die leicht zu handhaben und mit guter Empfindlichkeit reagieren werden müssen. Wir haben auch schon gute Erfolge mit Wänden aus anderen Keimlingen sowie einige Materialien aus dem Supermarkt, wie junge Spinatblätter und Stangensellerie. Grundsätzlich sind jung, weich, schnell wachsende Pflanzengewebe wahrscheinlich leicht mit dieser Technik gemessen werden, sondern harte, alte, oxidierte ...

messen pflanzlichen zellwand extension (creep) durch saure ph-wert und von alpha-expansin induced

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Wachsende pflanzlichen Zellwände charakteristisch weisen eine Eigenschaft als &quot;Säure Wachstum&quot;, mit denen wir meinen, sie sind mehr erweiterbare bei niedrigen pH-Wert (&lt;5) 1 bekannt. Das Pflanzenhormon Auxin schnell stimuliert Zellstreckung in jungen Stängel und ähnliche Gewebe zumindest teilweise durch eine Säure-Wachstums-Mechanismus 2, 3. Auxin aktiviert eine H +-Pumpe in der Plasmamembran, Versauerung der Zellwand Lösung. Wand Versauerung aktiviert expansins, die endogene Zellwand-Lockerung Proteine ​​4 sind, wodurch die Zellwand an der Wand Spannungen, die durch Zelle Turgor erstellt Ertrag. Als Folge beginnt die Zelle rasch vergrößern. Diese &quot;acid Wachstum&quot; Phänomen ist leicht in isolierten (unbelebten) Zellwand Proben gemessen. Die Fähigkeit der Zellwände zu Säure-induzierte Erweiterung unterzogen wird nicht einfach das Ergebnis der strukturellen Anordnung der Zellwand-Polysaccharide (zB Pektine), sondern hängt von der Aktivität der expansins 5. Expansins haben noch keine bekannten enzymatischen Aktivität und der einzige Weg, um Assay für expansin Aktivität ist es, ihre Induktion von Zellwand-Erweiterung zu messen. Dieses Video Bericht beschreibt ausführlich die Quellen und die Vorbereitung Techniken zur Gewinnung von geeigneten Wandmaterialien für expansin Assays und fährt fort, Säure-induzierte Verlängerung und expansin-induzierte Verlängerung der Wand Proben aus wachsenden Gurke Hypokotylen vorbereitet zu zeigen. Um geeignete Zellwand Proben, Gurkenkeimlingen im Dunkeln gezüchtet werden, die Hypokotyle geschnitten und bei -80 ° C eingefroren Gefrorene Hypokotylen abgetragen, abgeflacht, und dann bei konstanter Spannung in eine spezielle Küvette für Extensometer Messungen gespannt. Zur Messung säureinduzierte Erweiterung, die Wände sind zunächst im neutralen pH-gepuffert, so dass eine niedrige Aktivität der expansins, dass Komponenten des nativen Zellwände. Nach Puffer Austausch zu sauren pH-Wert, sind expansins aktiviert und die Zellwände zu verlängern schnell. Wir zeigen auch expansin Aktivität in einer Rekonstitution Assay. Für diesen Teil verwenden wir eine kurze Wärmebehandlung auf die native expansins in der Zellwand Proben zu denaturieren. Diese inaktivierten Zellwände nicht einmal verlängern in sauren Puffer, sondern zusätzlich von expansins die Zellwände schnell wieder ihre Fähigkeit, zu verlängern.

Wir zeigen die Verwendung eines konstanten Kraft Extensometer zur langfristigen Erweiterung (Kriechen) der pflanzlichen Zellwand Proben von sauren Puffern und expansin Protein induziert messen.

Messen pflanzlichen Zellwand Extension (Creep) durch saure pH-Wert und von Alpha-Expansin Induced

Wachsende Pflanzenzellwände weisen charakteristischerweise eine Eigenschaft auf, die als „Säurewachstum“ bezeichnet wird; damit ist gemeint, dass sie bei niedrigem pH-Wert (< 5) dehnbarer sind 1. Die ...

Hier demonstrieren wir Methoden zur Messung der Ausdehnung und Aktivität durch die Zellwanddehngeometrie. Geeignete Wandpräparate können aus den Hypokotylen von behandelten Gurkensämlingen gewonnen werden, um die säureinduzierte Streckung zu messen, die durch endogene Expansine katalysiert wird, die an native Zellwände gebunden sind. Wir spannen die Wände in neutralem Puffer mit einem Dehnungsmessgerät ein; nach dem Wechsel auf sauren pH-Wert werden die Expansine aktiviert und die Zellwände dehnen sich rasch aus.Wir demonstrieren außerdem einen Expansions-Rekonstitutions-Assay. Für diesen Teil verwenden wir eine kurze Hitzebehandlung, um endogene Expansine zu denaturieren. Durch Hitze inaktivierte Zellwände dehnen sich nicht einmal in saurem Puffer aus, doch die Zugabe von Expansin stellt die Dehnbarkeit der Wand schnell wieder her.Hallo, ich bin Dan De Roko aus dem Labor von Dr. Daniel Cosgrove am Fachbereich Biologie der Penn State University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Messung der irreversiblen Streckung oder Kriechbewegung isolierter Pflanzenzellwände. Beginnen wir also.Nach unseren Erfahrungen eignen sich junge Hypokotyle von Avocadopflanzen aus etiolierten Gurkensämlingen als geeignete Quelle für Zellwandmaterial. Für diese Experimente werden Gurkensamen auf nassem Papier in einer lichtundurchlässigen Schachtel ausgesät, die in einem abgedunkelten Schrank und einem Raum mit konstanter Temperatur von 26 Grad Celsius aufbewahrt wird. Temperaturen zwischen 22 und 30 Grad Celsius sind ebenfalls geeignet, wobei jedoch zu beachten ist, dass die Temperatur die Wachstumsgeschwindigkeit bestimmt.Je wärmer die Temperatur, desto schneller entwickeln sich die Keimlinge. Die Aufrechterhaltung einer dunklen Wachstumsumgebung ist entscheidend, da bereits geringe Lichtmengen sowohl die Geschwindigkeit der Keimlingsentwicklung als auch die Zellwand-Eigenschaften beeinflussen, die wir mit dieser Methode messen. Am dritten Tag können Sie mit einem abgedunkelten, grüngefilterten Licht in die Box schauen, um den Entwicklungsstand der Keimlinge zu überprüfen.In der Regel findet man beim Blick in die Box am dritten oder vierten Tag Sämlinge, die etwa fünf Zentimeter lang gewachsen sind, was typischerweise für unsere Experimente verwendet wurde. Diese Sämlinge können vor der Verwendung bei minus 80 Grad Celsius eingefroren werden. Um die Zellwandproben vorzubereiten, werden kleine Gruppen von acht bis 10 eingefrorenen, geschnittenen Sämlingen aus dem Gefrierschrank in einen isolierten Behälter überführt, der einen Gefrierblock mit minus 80 Grad Celsius enthält. Mithilfe einer dicken Paste aus Carborund-Pulver, die Daumen und Zeigefinger bedeckt, wird die Kutikula, die den Hypokotyl bedeckt, entfernt, indem der Hypokotyl wiederholt zwischen Daumen und Zeigefinger abgerieben wird.Bei der Durchführung dieser Technik ist es entscheidend, den richtigen Druck einzusetzen, um eine Durchdringung der Kutikula sicherzustellen, ohne die epidermale Schicht zu beschädigen. Man sollte außerdem schnell arbeiten, da das gefrorene Hypocotyl beim Auftauen weich und schwer zu handhaben wird, wodurch es schwierig ist, den anhaftenden Carum weitgehend zu entfernen. Das abgeschliffene Hypocotyl wird eingetaucht und anschließend in Eiswasser aufbewahrt, während die verbleibenden Hypocotyle vorbereitet werden.Nach der Entfernung der Cuticula an allen Keimlingen werden diese üblicherweise mit einer neuen Einweg-Rasierklinge auf die gewünschte Länge von 1,2 Zentimetern gekürzt und anschließend nach der Ausrichtung auf einem Objektträger angeordnet. Ein zweiter Objektträger wird auf die Gruppe von acht bis zehn Proben gelegt, und ein Gewicht von 400 bis 500 Gramm wird für fünf Minuten auf den Objektträger gegeben. Typischerweise verwenden wir einen Becher, der mit einer geeigneten Menge Wasser gefüllt ist.Das Gewicht des Bechers wird die Zellwände abflachen, um den Zellsaft zu entfernen und das Klemmen zu erleichtern. Abhängig vom Experiment können die Hypoknollen an dieser Stelle durch eine kurze Hitzeeinwirkung inaktiviert werden. Dazu binden wir die Objektträger mit zwei Gummibändern zusammen, legen die Konstruktion in einen Behälter mit hundert Millilitern entionisiertem Wasser bei Raumtemperatur und stellen sie in einen Mikrowellenherd bei voller Leistung mit unserem Mikrowellenherd.Das Wasser beginnt nach etwa 50 Sekunden zu kochen, und wir stoppen die Mikrowelle 15 Sekunden nach Beginn des Kochens; das heiße Wasser wird schnell abgegossen und durch kaltes Wasser ersetzt, um die Denaturierung zu stoppen. Eine optimale Erhitzung bedeutet, dass die Proben keine Reaktion auf niedrigen pH-Wert zeigen, gleichzeitig aber nicht schwach werden und leicht brechen. Die Wandproben werden nun in einem Extensometer mit konstanter Kraft X eingespannt.Dies ist eine speziell angefertigte Vorrichtung, die aus einem Plexiglaswürfel besteht, der das basale Ende der Wandprobe hält, sowie einer beweglichen Klemme, die am apikalen (APIC) Ende der Probe befestigt ist. Die bewegliche Klemme ist am Ende eines Stabes montiert, der durch die offenen Spulen eines Positionssensors – eines Differenzdruckwandlers (LVDT, linear variable differential transformer) – verläuft und elektronisch die Position eines kleinen Metallzylinders oder Kerns erfasst, der mit dem Stab verbunden ist.Das obere Ende des Stabes ist mit einem Hebel verbunden, der ein verstellbares Gegengewicht besitzt. Dieser Hebel übt eine einstellbare Aufwärtskraft auf die Zellwandprobe aus. Die Kraft wird angepasst, indem kalibrierte Metallgewichte am äußeren Ende des Hebels hinzugefügt oder entfernt werden, um Proben für die Messung der Zellwanderweiterung vorzubereiten.Das basale Ende der Hypocotylprobe wird mit feinen Pinzetten erfasst, wobei etwa zwei bis drei Millimeter des APIC-Endes zwischen die geöffneten Backen der beweglichen Klammer platziert werden. Diese Klammer ist eine federbelastete Alligatorklemme. Die Metallbacken sind mit Kunststoff beschichtet, um direkten Kontakt zwischen der Metalloberfläche und der Pufferlösung oder der Gewebeprobe zu verhindern.Unsere Erfahrung zeigt, dass Metallionen aus der Klammer austreten und die Fähigkeit der Wand, sich auszudehnen, hemmen können. Daher halten wir das Metall bedeckt. Während die bewegliche Klammeranordnung mit einer Hand gehalten wird, wird das basale Ende der Wandprobe nun zwischen die beiden Scharnierstücke der Plexiglas-Vorrichtung („vete“) geführt, und die Teile der Vorrichtung werden zusammengeführt und festgeschraubt, wodurch das untere Ende der Wandprobe in der Vorrichtung fixiert ist. Die bewegliche Klammeranordnung wird nun vorsichtig gelöst, sodass die volle Kraft der Gegengewichte auf die Wandprobe übertragen wird. Üblicherweise verwenden wir ein Gesamtgegengewicht von 20 Gramm für Wandproben, die aus Gurken, Hypokotylen, gewonnen wurden.Andere Wandmaterialien oder Experimente erfordern möglicherweise unterschiedliche Gewichte. Das QVE wird mit Puffer gefüllt, und die Position des QVE wird mithilfe einer Verstellschraube nach oben oder unten verschoben, sodass die bewegliche Klammer an das untere Ende des Messbereichs des LVDT gebracht wird. Unser LVDT ist mit einer Datenerfassungseinheit des Computers verbunden.Wir haben acht DMS-Baugruppen parallel mit einem Computer verbunden, was es uns ermöglicht, acht Wandproben gleichzeitig zu betreiben. Der Computer zeichnet alle 30 Sekunden die Position jeder DMS-Baugruppe auf, um die säureinduzierte Streckung zu messen. Wir beginnen mit nativen Wandproben, die nicht durch Hitze inaktiviert wurden, und fügen einen neutralen Puffer zum Probengefäß hinzu.Die Wandproben dehnen sich als Reaktion auf die hinzugefügte Spannung einige Minuten lang aus, doch die Dehnung verlangsamt sich auf eine geringe Rate. Nach einigen Minuten ermöglicht uns unser Computer entweder die Längenänderung der Probe zu überwachen, also die Positionsänderung der beweglichen Klammer ab Beginn des Experiments, oder wir können die zeitliche Ableitung der Position überwachen. Mit anderen Worten: die Dehnungsrate.Die Ausdehnungsgeschwindigkeit stabilisiert sich im Laufe der Zeit auf einen niedrigen Wert. Nach etwa 20 Minuten wird der neutrale Puffer mithilfe eines dünnen Metallrohrs, das aus einer Hohlnadel mit großem Durchmesser hergestellt ist und an eine Vakuumpumpe angeschlossen wird, entfernt. Um den Puffer schnell zu entfernen.Die Einrichtung ermöglicht es, das Pufferlösung mit minimaler Störung der Wand oder der mechanischen Vorrichtung zu entfernen. Anschließend wird saure Pufferlösung hinzugefügt, manchmal mit ein bis zwei schnellen Wechseln, um einen vollständigen Austausch gegen die saure Pufferlösung sicherzustellen. Danach beobachten wir die Reaktion der Wand.In der Regel können wir die schnellere Ausdehnungsrate innerhalb weniger Minuten nachweisen. Nach 60 Minuten liegen gewöhnlich ausreichende Informationen zur Beurteilung der Ausdehnungsreaktion vor, obwohl in einigen Fällen die Messungen über längere Zeiträume fortgesetzt werden können. Zur Messung der durch Expansion induzierten Zellwandausdehnung beginnen wir mit hitzeinaktivierten Wandproben, und saurer Puffer wird der qve hinzugefügt.Wie im ersten Experiment stabilisiert sich die Rate der Zellwandverlängerung aufgrund des Fehlens funktioneller Expansine allmählich auf einem niedrigen Wert. Nach etwa 20 Minuten Expansion wird Protein der Q vet hinzugefügt, indem mit 10 bis 20 Mikrolitern einer Expansionslösung in den Puffer der Q vet injiziert wird. Da der Cuticula entfernt wurde, dringt die Expansinlösung rasch in die Zellwandprobe ein, und innerhalb weniger Minuten beobachten wir eine Zunahme der Verlängerungsrate.Diese Dehnungsreaktion kann eine Stunde oder länger andauern. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man die Zellwanddehnung infolge endogener Expansine sowie infolge der Zugabe von Expansinen misst. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, mechanische Vibrationen und Temperaturschwankungen so gering wie möglich zu halten, da sie Rauschen in den Dehnungskurven erzeugen.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Verlängerungsassays.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben eine Methode zur Kartierung mechanischer Eigenschaften von Pflanzengewebe mit Hilfe eines Rasterkraftmikroskops (AFM). Wir konzentrieren uns darauf, wie mechanische Veränderungen, die während der Pflanzenentwicklung in der Pflanzenentwicklung auf der Weitfeld-Mesoskala stattfinden, aufgezeichnet werden können, um diese Veränderungen mit Wachstum und Morphogenese korrelieren zu können.

AFM-basierte Mapping der elastischen Eigenschaften der Zellwände: auf der Tissue-, Handy-und subzellulärer Beschlüsse

Ca2 + Signalweg reguliert verschiedene biologische Prozesse in Pflanzen. Hier präsentieren wir Ansätze zur Überwachung abiotischen Stress induziert räumliche und zeitliche Ca 2 +-Signale in Arabidopsis Zellen und Geweben unter Verwendung der genetisch codierten Ca2 +-Indikatoren Aequorin oder Case12.

Mess räumliche und zeitliche Ca 2 + Signale in Arabidopsis-Pflanzen

Ein neuartiges Bildgebungsprotokoll wurde entwickelt, das einen speziellen motorbetriebenen mechanischen Aktuator verwendet, um die Messung von Echtzeitreaktionen auf mechanische Dehnung in lebenden Zellen zu ermöglichen. Das für die Mechanobiologie relevante System kann Dehnungen von bis zu 20 % aufbringen und ermöglicht gleichzeitig eine Bildgebung nahezu in Echtzeit mit konfokaler oder Rasterkraftmikroskopie.

Live Cell Imaging bei Mechanical Stretch

Kristalline Cellulose ist ein wichtiger Bestandteil der pflanzlichen Zellwand. Die Quantifizierung mit zellulärer Auflösung ist jedoch eine technische Herausforderung.  Hier berichten wir über den Einsatz von Polarisationslichttechnologie und Wurzelquerschnitten, um Informationen über die Zusammensetzung der Zellwände mit raumzeitlicher Auflösung zu erhalten.

Hohe Auflösung Quantifizierung kristalliner Cellulose Akkumulation in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots Gewebespezifische Zellwand Änderungen überwachen

Die hierin beschriebenen Protokolle erleichtern die bequeme Untersuchung bakterieller Ethylenreaktionen durch die Verwendung von 2-Chlorethylphosphonsäure (CEPA).  Ethylen wird in situ durch die Zersetzung von CEPA in einem wässrigen bakteriellen Wachstumsmedium hergestellt, wodurch der Bedarf an reinem Ethylengas umgangen wird.

Unter Verwendung der Ethylen-freisetzenden Verbindung, 2-Chlorethylphosphonsäure, als Werkzeug Ethylen-Antwort in Bakterien zu studieren

Hier präsentieren wir Die Atomkraftmikroskopie (AFM), die als Nano- und Mikroeindrüsenwerkzeug für Zellen und Gewebe betrieben wird. Das Gerät ermöglicht die gleichzeitige Erfassung der 3D-Oberflächentopographie der Probe und ihrer mechanischen Eigenschaften, einschließlich zellwandiger Young-Moduls sowie Turgordruck.

Einsatz der Atomkraftmikroskopie zur Messung mechanischer Eigenschaften und Turgordruck von Pflanzenzellen und Pflanzengeweben

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Live-Zell-Bildgebung des kortikalen Mikrotubule-Zytoskeletts am triebförmigen Meristem und die Überwachung seiner Reaktion auf Veränderungen der physikalischen Kräfte.

Live Cell Imaging von Microtubule Cytoskeleton und mikromechanische Manipulation der Arabidopsis Schießen apical Meristem

Das Rasterkraftmikroskopie-Eindringprotokoll bietet die Möglichkeit, die Rolle der physikalischen Eigenschaften der Zellwand einer bestimmten Zelle eines Gewebes oder Organs während des normalen oder eingeschränkten Wachstums (d.h. unter Wasserdefizit) zu analysieren.

Rasterkraftmikroskopie zur Untersuchung der physikalischen Eigenschaften epidermaler Zellen lebender Arabidopsiswurzeln

Studien der Zellwandbiomechanik sind essentiell für das Verständnis des Pflanzenwachstums und der Morphogenese. Das folgende Protokoll wird vorgeschlagen, um dünne primäre Zellwände in den inneren Geweben junger Pflanzenorgane mittels Rasterkraftmikroskopie zu untersuchen.

Charakterisierung mechanischer Eigenschaften der primären Zellwand in lebenden Pflanzenorganen mittels Rasterkraftmikroskopie

Dieses Manuskript stellt ein detailliertes Protokoll zur Abbildung der 3D-Zellwanddynamik von lebendem Moosgewebe vor, das die Visualisierung der Ablösung von Zellwänden in ggb-Mutanten und die Verdickung von Zellwandmustern im Wildtyp während der Entwicklung über einen langen Zeitraum ermöglicht.

3D-Zeitraffer-Bildgebung der Zellwanddynamik mit Calcofluor im Moos Physcomitrium patens

Dieser Bericht beschreibt die grundlegenden Methoden, die zur Kultivierung und experimentellen Manipulation der einzelligen Streptophyten-Alge, Penium margaritaceum, verwendet werden. Es bietet auch grundlegende Protokolle für die mikroskopiebasierte Bildgebung, einschließlich der Lebendzellmarkierung mit monoklonalen Antikörpern und anderen Fluoreszenzsonden sowie der Rasterelektronenmikroskopie.

Experimentelle Screening-Protokolle, Immunzytochemie und mikroskopiebasierte Bildgebungsverfahren für Penium margaritaceum

Erfahren Sie die Messung von Zellwand-Dehnung (Creep) bei Pflanzen durch sauren pH-Wert und Alpha-Expansin-Induktion. Diese Methode mit dem Kraft-Extensometer erleichtert die Untersuchung pflanzlicher Wachstumsmechanismen.

Messen pflanzlichen Zellwand Extension (Creep) durch saure pH-Wert und von Alpha-Expansin Induced

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