Name: Maus Brustepithelzellen Form Mammospheres Während lactogenic Differenzierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-06T16:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 51 s
Description: Lernen Sie die Induktion lactogener Differenzierung in HC11-Mausbrustepithelzellen durch Mammosphärenbildung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung hormoneller Regulationsmechanismen in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Funds from vom Kongress Regie Medical Research Fund gewähren (DAMD17-01 bis 0264) zu ML Cutler und United States Military Cancer Institute zu ML Cutler unterstützte die Arbeit.

<ol><li> Die HC11 Zellen wurden bis zur Konfluenz für 6 Tage in RPMI 1640 Medium mit 10% fötalem Kälberserum, 5μg/ml Insulin, 10 mM HEPES, 10ng/ml epidermal growth factor (EGF), um Kompetenz zu etablieren ergänzt gewachsen. </li><li> Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und gepflegt in Nährmedien ohne EGF für 24 Stunden. </li><li> Zur Induktion lactogenic Differenzierung wurden die Zellen bei der Differenzierung Medien, dh RPMI mit Dexamethason (10 -6 M), Insulin (5 ug / ml) und Prolaktin (5 ug / ml) genannt DIP inkubiert. </li><li> Bei den angegebenen Zeiten post-DIP Zusätzlich wurden mammospheres fotografiert und aufgelistet durch Phasenkontrast-Mikroskopie mit einer Olympus IX71-Mikroskop mit Digitalkamera. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Geringe Leistungsaufnahme Vergrößerung der normalen Brustepithelzellen Zellmonoschichten und mehrere mammospheres sowie hohe Leistung Vergrößerung eines einzelnen mammosphere sind in Abbildung 1 gezeigt. <img src="/files/ftp_upload/1265/1265fig1.jpg" alt="" /> Abbildung 1. Mammospheres. (A) Normal Brustepithelzellen Zellmonoschichten sollte als eine flache Schicht von konfluenten Zellen angezeigt werden. (B) Nach 3-5 Tagen der DIP Stimulation mehrerer mammospheres erscheinen. Foto genommen 5 Tage nach der DIP hinaus. (C) Höhere Vergrößerung eines einzelnen Feld mit mammospheres bei 5 Tage nach der DIP hinaus.

<ol><li>Blatchford, D. R., Hendry, K. A., Turner, M. D., Burgoyne, R. D., Wilde, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectorial+secretion+by+constitutive+and+regulated+secretory+pathways+in+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Epithelial+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vectorial secretion by constitutive and regulated secretory pathways in mammary epithelial cells.</a> Epithelial Cell Biol. 4, 8-16 (1995).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+induced+expression+of+connective+tissue+growth+factor+contributes+to+lactogenic+differentiation+of+mouse+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid induced expression of connective tissue growth factor contributes to lactogenic differentiation of mouse mammary epithelial cells.</a> J Cell Physiol. 214, 38-46 (2008).</li>
</ol>

Um für diese Technik erfolgreich zu sein und von bester Qualität, die Epithelzellen sind bei Konfluenz gehalten werden, bevor die mit lactogenic Hormone induziert. Es kann Situationen geben, wo es zahlreiche mammospheres, die die Quantifizierung erschwert werden. So quantitative Zwecke ist es am besten, die mammospheres zu einem Zeitpunkt fotografieren, wenn die Zahl der mammospheres kann gezählt werden. Zwar gibt es verschiedene molekulare Marker verwendet werden, um den Grad der Differenzi...

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>21870076</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Quality Biological, Inc.</td><td>118089060</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Digitalkamera</td><td>QImaging</td><td>Retiga 2000RV Fast 1394</td><td></td></tr></tbody></table>

maus brustepithelzellen form mammospheres während lactogenic differenzierung

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

Eine phänotypische Maßnahme häufig verwendet, um den Grad der Differenzierung in lactogenic Maus Brustepithelzellen Zellkulturen zu bestimmen, ist die Bildung von kuppelförmigen Zellstrukturen genannt mammospheres<sup&gt; 1</sup&gt;. Die HC11-Zelllinie wurde als Modellsystem für die Untersuchung der Regulation der Brustdrüse lactogenic Differenzierung beide berufstätig<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 2</sup&gt;. Die HC11 Zellen differenzieren und zu synthetisieren Milchproteine ​​in Reaktion auf die Behandlung mit lactogenic Hormone. Nach dem Wachstum der HC11 Maus Brustepithelzellen zur Konfluenz wurde lactogenic Differenzierung durch die Zugabe einer Kombination von lactogenic Hormone einschließlich Dexamethason, Insulin und Prolaktin induziert, die so genannte DIP. Die HC11 Zellen induziert zu unterscheiden waren zeitweise bis zu 120 Stunden nach der Induktion der Differenzierung und die Anzahl der mammospheres, dass in jeder Kultur erschienen war aufgezählt fotografiert. Die Größe der einzelnen mammospheres korreliert mit dem Grad der Differenzierung und das ist in den Bildern der differenzierenden Zellen dargestellt.

HC11 lactogenic Differenzierung kann durch die Bildung von Kuppelbauten genannt mammospheres charakterisiert werden. Die Strukturen können durch Phasenkontrast-Mikroskopie aufgezählt werden, um bei der Quantifizierung lactogenic Differenzierung zu unterstützen.

Maus Brustepithelzellen Form Mammospheres Während lactogenic Differenzierung

Ein phänotypisches Maß, das häufig verwendet wird, um den Grad der laktogenen Differenzierung in Kulturen von Maus-Mamma-Epithelzellen zu bestimmen, ist die Bildung von ...

Hallo, ich bin Bethany Morrison aus dem Labor von Dr. Mary Lou Cutler an der Abteilung für Pathologie der Uniformed Services University of the Health Sciences. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Entwicklung von Mammosphären aus HC11-Maus-Mammapithelzellen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die laktogene Differenzierung zu untersuchen.Beginnen wir mit dem Protokoll. HC-11-Zellen werden sechs Tage lang bis zur Konfluenz in RPMI-1640-Medium kultiviert, das mit 10 % Fetalrinderserum, 5 Mikrogramm pro Milliliter Insulin, 10 Mikromolar Heiss und 10 Nanogramm pro Milliliter epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) ergänzt ist, um die Kompetenz zu etablieren.Diese Zellen wurden umfassend in den Laboren von Nancy Hines und Bernard Groner verwendet, um die Regulation der genischen Differenzierung im Gewebekulturhauben zu untersuchen. Die Zellen werden anschließend mit PBS gewaschen und 24 Stunden lang in Wachstumsmedium ohne EGF kultiviert. Nach dieser Inkubation werden die Zellen in Differenzierungsmedium inkubiert, das aus RPMI ergänzt mit Dexamethason, Insulin und Prolaktin besteht, um nach der Inkubation eine laktoide Differenzierung zu induzieren.In den Differenzierungsmedien werden mamo-Sphären mit einem mit einer Digitalkamera ausgestatteten Olympus-IX-71-Mikroskop fotografiert und gezählt. Mithilfe der Phasenkontrastmikroskopie werden mamo-Sphären mehrfach innerhalb von 120 Stunden nach der Induktion fotografiert und gezählt. Diese Aufnahme zeigt eine Vergrößerung mit niedriger Vergrößerungsleistung eines normalen Speichers.Einschichtiges epitheliales Zellmonolayer muss ungefähr drei Tage vor der Stimulation mit genitalen Hormonen konfluent gehalten werden. Hier ist ein Blick auf neue, drei Tage nach der Induktion bei geringer Vergrößerung entstandene Mammosphären. Diese erscheinen zunächst als kleine, gewölbte Strukturen, die zufällig über das Epithel verstreut sind.Auch hier wieder bei niedriger Vergr&ouml;&szlig;erung. Hier ist ein Blick auf mehrere Mammosph&auml;ren, die f&uuml;nf Tage nach der Induktion entstanden sind. Die Mammosph&auml;ren sind weiterhin sowohl in Gr&ouml;&szlig;e als auch in Anzahl angewachsen; bei hoher Vergr&ouml;&szlig;erung ist die blasen- oder kuppelartige Charakteristik der Mammosph&auml;re deutlich erkennbar.Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Gedächtnis-Epithelzellen induziert, sodass sie Mammosphären bilden, die als Marker für die genische Differenzierung verwendet werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Zellen vor der Induktion konfluent zu halten, da die Zellen während dieser Zeit Matrixproteine produzieren, mit denen sie interagieren müssen, um vollständig in der Lage zu sein, auf genische Hormone zu reagieren. Es ist außerdem wichtig, den EGF vor der Behandlung aus dem Medium zu entfernen, da EGF den Differenzierungsprozess hemmt.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

mouse-mammary-epithelial-cells-form-mammospheres-during-lactogenic

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Diese Methode beschreibt, wie zu sezieren und zu bewerten Brustdrüse Entwicklung und Funktion von Mäusen. Abgeschnittene Milchdrüsen sind für den Grad der Entwicklung mit whole mount beurteilt, während Milchspendereflex wird ausgewertet, wobei Oxytocin-basierte myoepithelialen Zelle Kontraktion Assay.

Evaluation der Brustdrüse Entwicklung und Funktion in Mausmodellen

Eine einfache Methode ist für die Analyse von Auswirkungen von Fibroblasten aus dem Bindegewebe auf verbundene Epithelzellen beschrieben. Die Kombination dieser Verfahren und dreidimensionalen Gewebekultur Analyse von Zellen nach der Isolierung aus 3D zu erleichtern. Die Technik ist für Zellen unterschiedlicher maligne Potential, so dass systematische Untersuchung der Wirkungen von Tumor-assoziiertem Stroma auf Tumorzellen.

Isolierung von Brustepithelzellen aus dreidimensionalen Mixed-Zelle Spheroid Co-Kultur

Dieses Video beschreibt die Isolierung von Krebsstammzellen aus Brustkrebszelllinien. Wir kultivieren diese Krebsstammzellen, um primäre Mammosphären zu erzeugen, um die Selbsterneuerung zu beurteilen und die Effizienz der Kugelbildung zu berechnen, was einen Vergleich über verschiedene Aussaatdichten hinweg ermöglicht.

Erzeugung primärer Mammosphären: Eine Technik zur Bestimmung der Zellpotenz

Primärzellkultur unter Verwendung von intaktem Gewebe Organoiden stellt ein Modellsystem, das die multizellulären Mikroumgebung in vivo nachahmt. Wir entwickelten ein Serum-freien Primär Brustepithel Gewebekulturmodell, das gemischte Zellkultur-Linien und Exponate differenzierte Morphologie perpetuiert, ohne enzymatische Gewebezerstörung. Breast Organoiden lebensfähig bleiben für&gt; 6 Monate.

Nicht-enzymatische, Serumfreie Zellkultur von Pre-invasive Brustläsionen für Spontane Erzeugung Mammospheres

Schwimmende Mammosphären-Assays können die Untergruppe von stammähnlichen Brustkrebszellen untersuchen, die unter Suspensionsbedingungen überleben und eine erhöhte Tumorgenese zeigen, wenn sie in Mäuse implantiert werden.  Dieses Protokoll bietet eine bequeme in vitro Messung der kugelbildenden Fähigkeit, einen Proxy für die in vivo Tumorgenese, und erleichtert gleichzeitig die Analyse der stammassoziierten Transkriptionslandschaft.

Mammosphere Formation Assay von Menschen Brustkrebs Geweben und Zelllinien

Die in diesem Artikel beschriebene indirekte Immunofluoreszenz-Protokoll ermöglicht den Nachweis und die Lokalisierung von Proteinen in der Milchdrüse der Maus. Eine vollständige Verfahren wird gegeben, um Brustdrüsenproben herzustellen, um die Immunhistochemie die Gewebeschnitte durch Fluoreszenzmikroskopie durchführen, um Bild und um Bilder zu rekonstruieren.

Die indirekte Immunfluoreszenz auf Gefrierschnitte von Mäusemilchdrüse

Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Reinigung, Quantifizierung und Charakterisierung von extrazellulären Vesikeln (EVs) / Exosomen aus nicht adhärenten / mesenchymalen Mamma-Epithelzellen und zur Verwendung derselben zur Übertragung der Brustdrüsen-bildenden Fähigkeit zu luminalen Mamma-Epithelzellen. EVs / Exosomen, die aus Stamm-ähnlichen Mamma-Epithelzellen gewonnen werden, können diese Zell-Eigenschaft in Zellen übertragen, die die EVs / Exosomen einnehmen.

Übertragung der Mamma-Drüsen-bildenden Fähigkeit zwischen Mamma-Basal-Epithelzellen und Mamma-Luminalzellen über extrazelluläre Vesikel / Exosomen

Wir beschreiben Techniken zur Differenzierungsinduktion von zwei Brustepithellinien, HC11 und EpH4. Während beide fetales Kalbsserum, Insulin und Prolaktin benötigen, um Milchproteine zu produzieren, können sich EpH4-Zellen in der dreidimensionalen Kultur vollständig in Mammosphären differenzieren. Diese komplementären Modelle sind nützlich für Signaltransduktionsstudien der Differenzierung und Neoplasie.

Differenzierung von Mausbrustepithel-HC11- und EpH4-Zellen

Hier beschreiben wir die Umsetzung und Interpretation der Ergebnisse eines in vitro Mammosphären-Selbsterneuerungquantitativen Assays.

Quantifizierung der Selbsterneuerung in Murine Mammosphärenkulturen

Die Brustdrüse ist eine zweischichtige Struktur, die äußere myoepitheliale und innere luminale Epithelzellen umfasst. Präsentiert ist ein Protokoll zur Vorbereitung von Organoiden mit Differential-Trypsinisierung. Diese effiziente Methode ermöglicht es Forschern, diese beiden Zelltypen getrennt zu manipulieren, um Fragen über ihre Rolle in der Form und Funktion der Brustdrüse zu untersuchen.

Generierung von Mosaik-Mammary-Organoiden durch Differential-Trypsinisierung

Dieses Protokoll beschreibt die Methode zur Einrichtung des Mammosphärenbildungstests, um Apoptosis Inhibitor 5 (Api5)-induzierte Krebsstammbildung in nicht-tumorigenen Brustepithelzellen zu untersuchen. Lysate, die aus Mammosphären der Primärgeneration gesammelt werden, werden auf verschiedene Stammmarker analysiert, um die Induktion stammzellähnlicher Eigenschaften zu bewerten.

Der Mammosphärentest zeigt api5-induzierte Stammbildung in nicht-tumorigenen Brustepithelzelllinien

Lernen Sie die Induktion lactogener Differenzierung in HC11-Mausbrustepithelzellen durch Mammosphärenbildung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung hormoneller Regulationsmechanismen in vitro.

Maus Brustepithelzellen Form Mammospheres Während lactogenic Differenzierung

Weitere Videos entdecken