Name: Standardisierte Erstellung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus Lungengewebe mit dem gentleMACS Dissociator (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Erfahren Sie die standardisierte Herstellung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus Lungengewebe mit dem gentleMACS Dissociator. Diese Methode liefert lebensfähige Zellen für Leukozyten- und Endothelzell-Analysen.

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Die Autoren sind Mitarbeiter von Miltenyi Biotec GmbH, Deutschland.

Um Arbeit unter sterilen Bedingungen, ist es empfehlenswert, alle Schritte in einer Sterilbank durchgeführt. 1. Materialien <ol><li> HEPES-Puffer: 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1,8 mM CaCl 2) </li><li> Collagenase D Lösung: Collagenase D: 100 mg / mL (Collagenase D&gt; 0,15 U / mg), in HEPES-Puffer </li><li> DNase I-Lösung: 20.000 U / mL DNase I </li><li> PBS-Puffer bei pH 7,2 </li><li> PEB-Puffer: 1 Teil BSA-Stammlösung in 20 Teile autoMACS Mundspüllösung </li><li> Tissue: Lunge von 6 / 7 Woche alt erwachsenen weiblichen BALB / C Maus, frei von angrenzenden Organen abgeleitet. </li><li> Optional: CD11c MicroBeads, MACS MS Spalten, MACS Separator für die Isolierung von dendritischen Zellen aus der Maus Lunge Einzel-Zell-Suspension </li></ol> 2. Distanziert das Lungengewebe <ol><li> Das Gewebe spülen in eine Petrischale mit PBS auf die Erythrozyten zu entfernen. </li><li> Transfer von maximal 450 mg Lungengewebe zu einer gentleMACS C Tube mit 4,9 ml HEPES-Puffer. </li><li> 100 l Collagenase D-Lösung auf eine Endkonzentration von 2 mg / ml Collagenase D. </li><li> Add 10 l DNase I-Lösung für bis zu 150 mg Gewebe (Endkonzentration von 40 U / ml DNase I) oder 20 ul DNase I für 150-450 mg Lungengewebe (Endkonzentration von 80 U / ml DNase I). </li><li> Verschließen Sie die C Rohr und befestigen Sie es auf die gentleMACS Dissociator. Dann starten Sie das Programm "m_lung_01". </li><li> Inkubieren für 30 min bei 37 ° C mit automatischer Rotation oder manuelles Drehen alle 5 min. </li><li> Return Probe auf die gentleMACS Dissociator und starten Sie das Programm "m_lung_02". </li></ol> 3. Filtration <ol><li> Bereiten Sie eine 50-ml-Tube zum Sammeln filtrierten Zellen durch das Ersetzen der Kappe mit 70 um Maschenweite Zellsieb. </li><li> Sobald die zweite gentleMACS Programm endet in Abhängigkeit von der Verteilung des Probenmaterials in die Röhre, können Sie das Rohr kurz zentrifugieren, um das Probenmaterial am Boden des Röhrchens zu sammeln. </li><li> Entfernen Sie die Zellen durch das Septum verschlossenen Deckel des C Rohr mit einem geeigneten 1000 ul Pipettenspitze und sie auf die Zelle Sieb. </li><li> Waschen Sie die Zelle Sieb mit 5 ml HEPES-Puffer bei RT. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen, um ein Pellet in einer 50 ml Tube bei 300xg für 10 min. </li><li> Saugen Sie den Überstand und Zellpellet in Ihrer gewünschten Volumen von PEB-Puffer. </li></ol> Teil 4: Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/1266/1266fig1.jpg" alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Lung Dissoziation mit der gentleMACS ™ Dissociator führte in 92% lebensfähige Zellen. Tote Zellen wurden Fluoreszenz mit Propidiumiodid (PI) (;: keine PI-Färbung linken Dot-Plot rechten Dot-Plot) gefärbt. <img src="/files/ftp_upload/1266/1266fig2.jpg" alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Dissoziation von Maus Lungengewebe mit dem gentleMACS Dissociator Ergebnisse in einem hohen Prozentsatz lebensfähiger Leukozyten und Endothelzellen. Die abgeleiteten Einzel-Zellsuspensionen wurden mit CD45-PE und CD146-FITC oder CD31-FITC gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert. <img src="/files/ftp_upload/1266/1266figure2c.png" alt="Abbildung 2C"> Abbildung 3. Single-Zellsuspension aus der Maus Lungengewebe abgeleitet wurde mit CD11c-FITC und Anti-mPDCA-1-APC Maus CD11c tief m-PDCA-1 + plasmazytoide DCs sowie CD11c hoch Zellen erkennen gefärbt. <img src="/files/ftp_upload/1266/1266fig4.jpg" alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Anreicherung von dendritischen Zellen mit CD11c MicroBeads, ein MiniMACS Separator und zwei MS Spalten.

<ol><li>Swanson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flt3-Ligand%2C+IL-4%2C+GM-CSF%2C+and+Adherence-Mediated+Isolation+of+Murine+Lung+Dendritic+Cells%3A+Assessment+of+Isolation+Technique+on+Phenotype+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function.</a> J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).</li>
<li>Vermaelen, K., Pauwels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+and+simple+discrimination+of+mouse+pulmonary+dendritic+cell+and+macrophage+populations+by+flow+cytometry%3A+Methodology+and+new+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights.</a> Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).</li>
</ol>

Die Autoren sind Angestellte der Miltenyi Biotec GmbH, die das in diesem Artikel verwendete Instrument herstellt.

In diesem Video stellen wir eine neue Methode für die Dissoziation von Maus Lungengewebe. Wir zeigen, dass eine Kombination von mechanischen und enzymatischen Behandlung von Lungengewebe zu einem hohen Prozentsatz lebensfähiger Leukozyten und Endothel-Zellen ergab. Insbesondere wurde die mechanische Zerstörung des Gewebes durch die gentleMACS Dissociator erreicht. Die gentleMACS C Tubes umfassen einen Rotor - Stator-System, das distanziert Gewebe auf sanfte Weise. Das Verfahren wird durch die Programm-Einstellungen des ...

<table><tbody><tr><td>C-Gefäße</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Bestellnr. 130-093-237</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; Starterset</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Bestellnr. 130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACSmix&amp;#8482; Röhrchenrotator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Bestellnr. 130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>autoMACS&amp;#8482; Spüllösung</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Bestellnr. 130-091-222</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS&amp;#174; BSA-Standardlösung</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Bestellnr. 130-091-376</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD11c MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Bestellnr. 130-052-001</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD11c-FITC, CD11c-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Bestellnr. 130-092-026130-091-830</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_599_329_CD11c.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_599_329_CD11c.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Anti-mPDCA-1-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Bestellnr. 130-091-963</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD146-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Bestellnr. 130-092-026</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD45-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Bestellnr. 130-091-610</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_599_331_CD45.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_599_331_CD45.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Lösung aus Propidiumiodid</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Bestellnr. 130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Art 1000 Reach Pipettenspitzen</td><td>Molecular BioProducts</td><td>Bestellnr. 2079</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61&quot;&gt;http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html&quot;&gt;http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

standardisierte erstellung von einzel-zellsuspensionen aus maus lungengewebe mit dem gentlemacs dissociator

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

Die Herstellung von ein-Zellsuspensionen aus den Geweben ist eine wichtige Voraussetzung für viele Experimente in Zellforschung. Der Prozess der Dissoziation ganzen Organen erfordert spezifische Parameter, um eine hohe Anzahl von lebensfähigen Zellen in reproduzierbarer Weise zu erhalten. Die gentleMACS Dissociator optimiert diese Aufgabe mit einem einfachen, praktischen Protokoll. Das Gerät enthält vorprogrammierte Einstellungen, die für die effiziente, aber schonende Dissoziation von einer Vielzahl von Gewebearten, darunter Mauslungen optimiert sind. In dieser Veröffentlichung wird die Nutzung des gentleMACS Dissociator auf das Lungengewebe von Mäusen abgeleitet wird demonstriert.

Distanziert Zellen aus bestimmten Gewebearten erfordert spezifische Parameter für die Gewebe-Agitation um ein hohes Volumen an lebensfähigen, kultivierbaren Zellen zu erhalten. Die Miltenyi gentleMACS dissociator optimiert diese Aufgabe mit einem einfachen, praktischen Protokoll. In dieser Veröffentlichung wird die Verwendung dieser Vorrichtung auf das Lungengewebe erklärt.

Standardisierte Erstellung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus Lungengewebe mit dem gentleMACS Dissociator

Die Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus Geweben ist eine wichtige Voraussetzung für viele Experimente in der Zellforschung. Der Prozess der ...

In diesem Video-Protokoll sehen Sie, wie man Lungengewebe von erwachsenen Mäusen mit gentle max nach der Dissoziation des Lungengewebes abspaltet. In Gegenwart von Kollagenase D und DNase werden Zellsuspensionen durch einen 70-Mikron-Zellsieb-Zentrifugenfilter geleitet und für weitere Anwendungen suspendiert. Hallo, ich bin Melanie Mlu von Mil Biotech in Deutschland.Heute zeige ich Ihnen ein reproduzierbares und automatisiertes Verfahren zur Herstellung einer Einzelzell-Suspension aus Maus-Lungengewebe unter Verwendung der GenX-Dissociation. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um Einzelzell-Suspensionen für die Gewinnung von Leukozyten oder endothelialen Zellen vorzubereiten. Gut, fangen wir an.Bevor wir mit dem Protokoll beginnen, müssen einige Standardlösungen vorbereitet und bereitgestellt werden. Zunächst benötigen wir HEPES-Puffer. Zweitens eine Kollagenase-D-Lösung, die 100 Milligramm pro Milliliter Enzym und HEPES-Puffer enthält.Drittens eine Dase-One-Lösung mit 20.000 Einheiten pro Milliliter Dase One. Zuletzt zwei gängige Pufferlösungen: ein typischer PBS-Puffer bei pH 7,2 und ein PEB-Puffer, abgeleitet von der AutoMax-Spüllösung und der BSA-Standardlösung.Wir

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video beschreibt eine einfache, zeitsparende Technik für die automatisierte Gewebedissoziation mit dem gentleMACS Dissociator zu Single-Zellsuspensionen von Maus-Splenozyten vorzubereiten.

Erstellung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus-Milz mit dem gentleMACS Dissociator

Distanziert Zellen aus bestimmten Gewebearten erfordert spezifische Parameter für Gewebe aggitation zu einem hohen Volumen von lebensfähigen, kultivierbaren Zellen zu erhalten. Die Miltenyi gentleMACS Dissociator optimiert diese Aufgabe mit einem einfachen, praktischen Protokoll. In dieser Veröffentlichung wird die Verwendung dieser Vorrichtung auf nerual Gewebe erklärt.

Generierung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus Nervengewebe

In diesem Artikel zeigen wir die Isolierung von murinen Wohnsitz Lunge mesenchymalen Stammzellen (MSC Lunge), deren Expansion, Charakterisierung und Analyse der immunmodulatorischen Eigenschaften.

Isolation und Charakterisierung von Hoechst Low CD45 Negative Mouse Lung mesenchymalen Stammzellen

Ein hoch gereinigte Präparation von Mauslunge dendritischen Zellen beschrieben wird. Besonderer Nachdruck wird auf die Isolierung von konventionellen dendritischen Zellen Teilmenge gegeben.

Isolierung von Maus Lung Dendritischen Zellen

Dieses Video beschreibt die Vorbereitung einer Lungenzellsuspension aus der Maus für die durchflusszytometrische Analyse zur Untersuchung der PD-L1-Expression von Lungenadenokarzinomzellen.

Lungenvorbereitung der Maus für die Durchflusszytometrie: Erzeugung von Zellsuspension aus Lungengewebe für die durchflusszytometrische Analyse

Diese Arbeit beschreibt die Standardisierung eines Verfahrens, um gereinigte Keimzellpopulationen aus Hodengewebe verschiedener Säugetierarten zu erhalten. Es ist ein einfaches Protokoll, das mechanische Hodendissoziation, Färbung mit Hoechst-33342 und Propidiumjodid und FACS-Sortierung kombiniert, mit breiten Anwendungen in vergleichenden Studien der männlichen Fortpflanzungsbiologie.

Ein standardisierter Ansatz für Multispezies Reinigung von männlichen männlichen Keimzellen durch mechanische Gewebedissoziation und Durchflusszytometrie

Diese Studie stellt zwei entscheidende experimentelle Techniken vor: die Konstruktion eines murinen Wundmodells zur Beurteilung des Wundverschlusses und die Herstellung von einzelligen Suspensionen aus der Haut von Mäusen, um die zelluläre Lebensfähigkeit zu erhalten.

Maus-Wundmodelle und Herstellung von Einzelzellsuspensionen

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Identifizierung seltener antigenspezifischer T-Zellpopulationen in der Lunge von Mäusen durch magnetische T-Zell-Anreicherung und Peptid:Major Histocompatibility Complex (MHC)-Tetramere.

Identifizierung seltener antigenspezifischer T-Zellen aus der Lunge von Mäusen mit Peptid:Major-Histokompatibilitätskomplex-Tetrameren

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung lebender immuner und nicht-immuner Populationen aus der Lunge von Mäusen in einem stabilen Zustand und nach einer Influenzainfektion. Es bietet auch Gating-Strategien zur Identifizierung von epithelialen und myeloischen Zelluntergruppen.

Isolierung von lebenden myeloischen und epithelialen Zellpopulationen aus der Lunge der Maus

Das im Folgenden beschriebene Protokoll ist eine einfache und effektive Methode zur Isolierung von Retinoid-haltigen Zellen aus hochgradig heterogenen Lungenzellpopulationen unter Verwendung spezifischer Retinoid-Autofluoreszenz und unter Anwendung einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung.

Isolierung von Lungen-Retinoid-haltigen Zellen durch Zellsortierung

Dieses Protokoll stellt eine detaillierte Methode zur Isolierung hochwertiger Einzelzell-Suspensionen sowohl aus gesundem als auch tumortragendem Mauslungengewebe vor. Dieses Protokoll kann auf scRNA-Seq, Durchflusszytometrieanalyse und primäre Zellisolation angewendet werden.

Optimierte Vorbereitung von ganzem, tumortragendem Lungengewebe der Maus für Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierung

Erfahren Sie die standardisierte Herstellung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus Lungengewebe mit dem gentleMACS Dissociator. Diese Methode liefert lebensfähige Zellen für Leukozyten- und Endothelzell-Analysen.

Standardisierte Erstellung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus Lungengewebe mit dem gentleMACS Dissociator

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