Standardisierte Erstellung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus Lungengewebe mit dem gentleMACS Dissociator

In diesem Videoprotokoll sehen Sie, wie Sie Lungengewebe von adulten Mäusen mit Hilfe von Gentle Max nach der Dissoziation des Lungengewebes dissoziieren. In Gegenwart von Kollagenase d und DNAS werden die Ein-Zell-Suspensionen mit einer 70-Mikron-Zellsiebzentrifuge filtriert und für weitere Anwendungen suspendiert. Hallo, ich bin Melanie Mlu von Mil Biotech in Deutschland.

Heute zeige ich Ihnen ein reproduzierbares und automatisiertes Verfahren zur Herstellung einer Einzelzellsuspension aus Lungengewebe von Mäusen mit Hilfe der GenX-Dissoziation. Dieses Verfahren verwenden wir in unserem Labor, um Einzelzellsuspensionen für die Aufbereitung von Leukozyten oder Endothelzellen herzustellen. Okay, fangen wir an.

Bevor wir mit dem Protokoll beginnen, müssen einige Standardlösungen vorbereitet und griffbereit sein. Zuerst benötigen wir einen Hebes-Puffer. Zweitens eine Kollagenase-D-Lösung, die 100 Milligramm pro Milliliter Enzym und Hebes-Puffer enthält.

Drittens, eine dase one Lösung, die 20.000 Einheiten pro Milliliter enthält. Zum Schluss noch zwei gängige Pufferlösungen. Ein typischer PBS-Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 und ein PEB-Puffer, der aus der AutoMax-Spüllösung und der BSA-Stammlösung gewonnen wurde.

Wir beginnen unser Protokoll mit einer präparierten Lunge, die von einer sechs bis sieben Wochen alten weiblichen Biopsiemaus stammt. Achten Sie darauf, dass die Lunge frei von angrenzenden Organen wie Herz und Thymusdrüse, efferenten und afferenten Blutgefäßen, Luftröhre und Bindegewebe ist. Spülen Sie das Gewebe in einer Petrischale, die PBS enthält, um Erythrozyten zu entfernen.

Typischerweise wiegt eine Mauslunge in diesem Alter zwischen 110 und 150 Milligramm. Wenn Sie vorhaben, Lungen von älteren Tieren oder anderen Mausstämmen zu assoziieren, wiegen Sie das Gewebe und den Puffer. Pro Röhrchen können maximal 450 Milligramm Gewebe dissoziiert werden.

Übertragen Sie das Lungengewebe in ein sanftes Max-C-Röhrchen, das mit 4,9 Millilitern Heis-Puffer beladen ist. Geben Sie 100 Mikroliter Kollagenase-D-Lösung bis zu einer Endkonzentration von zwei Milligramm pro Milliliter in das Lungengewebe und den Puffer. Jetzt 10 Mikroliter dase.

Eine Lösung für mehr als 150 Milligramm Gewebe. Fügen Sie 20 Mikroliter dase eine Lösung hinzu. Stellen Sie sicher, dass das C-Rohr fest verschlossen ist, und stellen Sie es kopfüber auf den sanften Max Dis.

Stellen Sie sicher, dass sich das Gewebe zwischen dem Rotor und dem Stator befindet. Wählen Sie das Lungenprogramm aus und führen Sie es aus, indem Sie die Starttaste drücken, wenn das Programm beendet ist. Nehmen Sie das C-Rohr aus dem Gerät und inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang.

In einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator sollte das Röhrchen während der Inkubation mit dem Max-Mix-Röhrchenrotator gedreht oder alle fünf Minuten manuell gedreht werden. Bringen Sie das C-Röhrchen nach der Inkubation wieder in den gentle max Associator zurück und führen Sie das zweite Lungenprogramm durch. Bereiten Sie während des Programms ein 50-Milliliter-Röhrchen zum Sammeln gefilterter Zellen vor, indem Sie die Kappe durch ein 70-Mikrometer-Netzzellensieb ersetzen. Nach Beendigung des dissoziierten Programms kann es je nach Verteilung des Probenmaterials im Röhrchen sinnvoll sein, das Röhrchen kurz zu zentrifugieren, um das Probenmaterial zu konzentrieren.

Die dissoziierten Zellen können aus dem Röhrchen entnommen werden, indem sie durch die mit dem Septum versiegelte Kappe des C-Röhrchens pipettiert werden. Mit einer geeigneten 1000-Mikroliter-Pipettenspitze wird die Zellsuspension auf das Zellsieb aufgetragen, um größere Partikel oder Aggregate zu entfernen. Sobald die Lösung abgelassen ist, waschen Sie das Zellsieb, indem Sie weitere fünf Milliliter Raumtemperatur und Puffer hinzufügen, um die gefilterten Zellen zu pelletieren.

Das 50-Milliliter-Röhrchen bei 300 GS 10 Minuten lang zentrifugieren. Saugen Sie nun den Überstand an und resuspendieren Sie das Zellpellet bei der gewünschten Raumtemperatur. PEB-Puffer.

Den Überstand nicht dekantieren. Sie können nun mit Ihrer Downstream-Anwendung fortfahren. Die Dissoziation von Lungengewebe der Maus mit diesem Verfahren ergibt einen hohen Prozentsatz an lebensfähigen Leukozyten und Endothelzellen.

Die abgeleiteten Einzelzellsuspensionen wurden mit CD 45 PE als CD 1 46 FITC oder CD 31 FITC gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Dieses Diagramm zeigt die Anreicherung dendritischer Zellen mit CD 11 C Mikrokügelchen, einem Minimax-Separator und zwei MS-Säulen. Okay. Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie Sie einzellige Suspensionen aus Lungengewebe von Mäusen standardisiert herstellen können, indem Sie die schonende Mix-Dissoziation und C-Röhrchen verwenden.

Diese Methode ermöglicht eine effiziente und generelle Dissoziation des Gewebes. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Lunge richtig zu präparieren und das Gewebe unmittelbar nach der Dissektion zu bearbeiten. Die vorbereiteten Einzelzellsuspensionen können dann für weitere Experimente verwendet werden.

Zum Beispiel die magnetische Markierung der Zellen und dann die Trennung von Leukozyten oder Endothelzellen. Okay, das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.