Generierung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus Nervengewebe
7. Juli 2009
Distanziert Zellen aus bestimmten Gewebearten erfordert spezifische Parameter für Gewebe aggitation zu einem hohen Volumen von lebensfähigen, kultivierbaren Zellen zu erhalten. Die Miltenyi gentleMACS Dissociator optimiert diese Aufgabe mit einem einfachen, praktischen Protokoll. In dieser Veröffentlichung wird die Verwendung dieser Vorrichtung auf nerual Gewebe erklärt.
Im Nervensystem wurden Hunderte von neuronalen und glialen Zelltypen beschrieben. Jeder spezifische Zelltyp im Gehirn oder im Rückenmark verfügt über ein Repertoire an Zelloberflächenmolekülen oder molekularen Determinanten, durch die er identifiziert und charakterisiert werden kann.
Derzeit erfordern robuste Technologien zur Zellidentifizierung und -separation die Erzeugung von Einzelzellpräparationen, wobei gleichzeitig der Zelltod und die Zerstörung charakteristischer Oberflächenproteine begrenzt werden müssen. Der Gentle Max Associator kann in Kombination mit Trypsin- oder Pepane-basierten Dissoziationskits effektiv und schonend Gehirngewebe dissoziieren, wobei die Antigen-Epitope erhalten bleiben und der Zellverlust minimiert wird. Einmal erzeugte Einzelzell-Suspensionen können anschließend mit monoklonalen Konjugaten wie Anti-Prominent-One-Mikroperlen behandelt werden, die neurogene Vorläuferzellen identifizieren, oder mithilfe von Myelin-Entfernungspartikeln weiter gereinigt werden.
Hallo, mein Name ist Sandra PeNAT. Ich bin Projektmanagerin für Neurowissenschaftsprodukte bei Mil Biotech hier in Bagge Gabert, Deutschland. Heute zeige ich Ihnen, wie man eine Einzelzell-Suspension aus Maushirngewebe mit dem Genix-Disasziator herstellt.
Der Genix-Dissoziator ist ein Gerät, das eine Vielzahl von Gewebetypen in einer geschlossenen, sterilen Umgebung dissoziieren kann und somit die Notwendigkeit für zeitaufwändige manuelle mechanische Dissoziation eliminiert. Beginnen wir also. Verwenden Sie je nach dem interessierenden Antigenepitop in nachfolgenden Anwendungen entweder das auf Papain basierende Kit zur Neuralgewebs-Dissoziation oder das auf Trypsin basierende Kit zur Neuralgewebs-Dissoziation.
Für das heutige Experiment bevorzugen wir das Neuro-Gewebe-Dissociationskit P, da wir prominente positive Zellen mithilfe von Anti-Prominent-One-Mikroperlen isolieren möchten. Prominent One ist weder gegenüber Pepan noch gegenüber Trypsin empfindlich, und in einem solchen Fall ist das Neuro-Gewebe-Dissociationskit P die bessere Wahl. Bevor das Protokoll gestartet wird, müssen die Reagenzien und Lösungen für dieses Kit vorbereitet werden.
Haben Sie Ihre eigene Lagerlösung von Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Calciumionen und Magnesiumionen sowie HBSS mit Calcium- und Magnesiumionen und Beta-Mercaptoethanol bereit. Beginnen Sie mit der Herstellung von Lösung zwei, Lösung vier und anschließend der Enzymmischung eins. Geben Sie zunächst Beta-Mercaptoethanol zu Lösung zwei, um eine Endkonzentration von 0,067 Millimolar zu erreichen.
Die Lösung ist nun bei einer Lagerung bei vier Grad Celsius bis zu einem Monat stabil. Als Nächstes lösen Sie das lyophilisierte Pulver und eine als Lösung gekennzeichnete Ampulle Vier. Geben Sie 0,7 Milliliter Lagerpuffer hinzu und mischen Sie vorsichtig, ohne zu wirbeln.
Bereiten Sie nun das Enzymgemisch eins vor, indem Sie 1900 Mikroliter Lösung zwei und 50 Mikroliter Lösung eins in ein C-Gefäß pipettieren. Diese Menge reicht aus, um 400 Milligramm Gewebe zu dissociieren; wenn mehr Gewebe dissociiert werden soll, bereiten Sie zusätzliches Enzymgemisch eins vor. In einem C-Gefäß können maximal 1600 Milligramm Hirngewebe verarbeitet werden.
Die Enzymmischung eins im C-Gefäß wird anschließend 10 bis 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert. Geben Sie zur Initiierung der Dissoziation ein Milliliter HBSS ohne Calcium- und Magnesiumionen mittels Pipette in das Gefäß. Stellen Sie das Gefäß auf eine Waage, fügen Sie das Gehirngewebe hinzu und notieren Sie dessen Masse.
Dieses P4-Mausgehirn wiegt etwa 0,2 Gramm. Ein erwachsenes Gehirn würde etwa 0,4 Gramm wiegen; für alle Gewebeproben unter 400 Milligramm sind die Lösungsvolumina, die wir heute verwenden, ausreichend.
Wenn Ihr Gewebe mehr als 400 Milligramm wiegt, skalieren Sie alle Reagenzvolumina entsprechend hoch; bis zu 1600 Milligramm Gewebe können in einem C-Gefäß verarbeitet werden. Überführen Sie das Maushirn in das vorbereitete C-Gefäß, das 1.950 Mikroliter vorgewärmtes Enzym enthält. Mischen Sie einmalig und verschließen Sie die Kappe fest.
Platzieren Sie nun das C-Röhrchen mit der Kappe nach unten auf den Gen Max Associator und stellen Sie sicher, dass sich das Gewebe im Bereich des Stators befindet. Wählen Sie das Programm MCO brain O one aus und führen Sie es aus. Dies ist das erste der drei Programme, die Sie bei der Dissoziation ausführen werden; starten Sie das nächste Programm, sobald das vorherige beendet ist.
Entfernen Sie die C-Röhre und inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius unter langsamer kontinuierlicher Rotation. Verwenden Sie den Max-Mix-Röhrenrotator, wobei die Laufart des Geräts vier U/min entspricht. Nach der ersten Inkubation setzen Sie die Röhre umgekehrt wieder auf die Dissoziationseinheit und führen das Programm M brain O2 aus. Während der nächsten Assoziation bereiten Sie 30 Mikroliter Enzymmix zwei pro 400 Milligramm Gewebe vor, indem Sie 20 Mikroliter Lösung drei zu 10 Mikrolitern Lösung vier hinzufügen.
Wenn der zweite Assoziator-Zyklus beendet ist, pipettieren Sie 30 Mikroliter Enzym-Mix zwei in die C-Röhre direkt durch die mit einem Septum verschlossene Öffnung in der Mitte des Verschlusses. Um die Sterilität zu gewährleisten, drehen Sie die C-Röhre vorsichtig um, um zu mischen, und verwenden Sie keinen Vortex. Stellen Sie die C-Röhre anschließend zurück auf den Max-Mix-Röhrenrotator und inkubieren Sie die Probe 10 Minuten bei 37 Grad Celsius mit einer Mischgeschwindigkeit von vier Umdrehungen pro Minute.
Dann wird die CTU zum dritten und letzten Mal auf den sanften Max-Dis-Dissociator zurückgebracht, und das Programm M brain oh drei wird ausgeführt. Sobald das dritte Programm abgeschlossen ist, stellen Sie die C-Röhrchen auf den Rotator und inkubieren sie weitere 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie nun die Probe kurz, um die Zellen am Boden des Röhrchens zu sammeln.
Jetzt sind wir bereit, die Zellen zu filtrieren. Wählen Sie einen Zellsieb entsprechend der Größe Ihres interessierenden Zelltyps aus. Wenn die Zellen, die Sie sammeln möchten, einen Durchmesser von mehr als 30 Mikrometern aufweisen, wie beispielsweise Kinji-Zellen, muss die Porengröße groß genug sein, um Zellkörper dieses Durchmessers passieren zu lassen.
Für deutlich positive Zellen eignet sich ein 30-Mikrometer-Filter. Entfernen Sie das dissoziierte Gewebe aus der C-Röhre mithilfe von 1000-Mikroliter-Pipettenspitzen, die durch die mit einem Septum verschlossene Öffnung im C-Röhrenverschluss passen. Geben Sie die Zellsuspension auf den vorgeschalteten Trennfilter, der auf einer 15-Milliliter-Sammelröhre platziert ist.
Für größere Probenvolumina kann ein 50-Milliliter-Röhrchen erforderlich sein. Lassen Sie die Zellsuspension durch den Filter laufen. Spülen Sie anschließend den Filter mit 10 Milliliter HBSS-Lösung mit Calcium- und Magnesiumionen aus.
Wenn Gewebemengen von mehr als 400 Milligramm verwendet werden, wenden Sie bis zu 30 Milliliter HBSS mit Calcium- und Magnesiumionen zur Spülung des Filters an. Pelletieren Sie nun die Zellen im Sammelröhrchen durch Zentrifugation bei 300 ×g für 10 Minuten bei Raumtemperatur, entfernen Sie das Überstandsvolumen vollständig und resuspendieren Sie das Zellenpellet in Ihrem gewünschten Puffer oder Medium. An dieser Stelle können Sie eventuell vorhandenes Myelingewebe entfernen, da dieses die Zellisolierung und Antikörperfärbung beeinträchtigen kann.
Um Myelintrümmer zu entfernen, empfehlen wir die Verwendung von Myelin-Entfernungskügelchen. Andernfalls sind die Zellen bereit für weitere Anwendungen. Dieses Punktediagramm basierend auf der Anfärbung mit Propidiumiodid zeigt, dass 97 % der Zellen in einer Einzelzell-Suspension aus einer Mausverletzung, wie der in diesem Video erzeugten Suspension, vital sind.
Diese Zellen können weitergereinigt werden, indem anti-prominente Mikroperlen verwendet werden, um neuronale Vorläuferzellen zu erhalten, die in Max-Neuro-Medium, ergänzt mit B 27 Plus, Neurophären in diesen Punktdiagrammen bilden können. Der Vorteil der Behandlung von Suspensionen mit Myelin-Entfernungspellets wird sichtbar. Ein signifikant höherer Prozentsatz an prominent-1-exprimierenden neuronalen Vorläuferzellen wird durch Max-Trennung nach Myelin-Depletion aus einer Einzelzell-Suspension erhalten.
Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie man eine Einzelzell-Suspension aus Mausehirngewebe unter Verwendung der Genix-Dissociation und des Neural Tissue Dissociation Kit herstellt. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, dass alle Lösungen entsprechend der richtigen Wahl des Neural Tissue Dissociation Kit, Typ T oder P, geeignet vorbereitet werden. Bitte beachten Sie das Anwendungsnotiz oder Datenblatt des NDK. Mit dieser Methode können embryonales Gewebe sowie D-Gewebeschnitte oder das gesamte Gehirn unter sterilen Bedingungen zeitsparend und standardisiert verarbeitet werden.
Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
Übersicht
In diesem Artikel wird die Verwendung des Miltenyi gentleMACS-Dissociators zur Gewinnung lebensfähiger und kultivierbarer Zellen aus Nervengewebe beschrieben. Das Protokoll unterstreicht die Bedeutung spezifischer Dissoziierungsparameter zum Erhalt der Zellviabilität und Oberflächenproteine.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Gewebedissoziationstechniken
Hintergrund
- Neuronale und gliale Zelltypen im Nervensystem zeichnen sich durch einzigartige Oberflächenmoleküle aus.
- Einzellpräparationen sind entscheidend für eine genaue Zellidentifizierung und -trennung.
- Die Erhaltung der Zellviabilität und der Oberflächenproteine während der Dissoziation ist von entscheidender Bedeutung.
- Der gentleMACS Dissociator bietet eine geschlossene, sterile Umgebung für die Gewebedissoziation.
Zweck der Studie
- Eine wirksame Methode zur Dissoziation von Maushirngewebe demonstrieren.
- Die Vorteile der Verwendung des gentleMACS Dissociators beim Erhalt von Antigen-Epitopen hervorheben.
- Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für Forscher in der Neurowissenschaft bereitstellen.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Enzymgemischen zur Gewebe-Dissociation.
- Verwendung des gentleMACS Dissociators zur mechanischen Dissociation.
- Bebrütung von Gewebeproben unter kontrollierten Bedingungen.
- Filterung dissociierter Zellen zur Isolierung spezifischer Zelltypen.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll löst Maushirngewebe erfolgreich auf, während die Zellviabilität erhalten bleibt.
- Spezifische Enzymkits verbessern die Erhaltung von Oberflächenproteinen.
- Einzellösungen können effektiv für weitere Analysen filtriert werden.
- Der gentleMACS-Dissociator vereinfacht den Dissoziationsprozess im Vergleich zu manuellen Methoden.
Schlussfolgerungen
- Der gentleMACS-Dissociator ist ein wertvolles Werkzeug für die Neurowissenschaftsforschung.
- Optimierte Dissoziierungsprotokolle können zu einer besseren Zellrückgewinnung und Charakterisierung führen.
- Zukünftige Anwendungen könnten sich auf andere Gewebetypen und Forschungsbereiche ausdehnen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die standardisierte Erzeugung einer Einzelzell-Suspension aus Nervengewebe ermöglicht eine zuverlässige Analyse von Zelloberflächenmarkern und nachgeschaltete Aufreinigungsverfahren. Dieser Ansatz unterstützt die Zielvalidierung, indem er Antigen-Epitope erhält und gleichzeitig Zellverluste minimiert, was die Reproduzierbarkeit von Assays in Entdeckungspipelines direkt beeinflusst. Die Methode bietet eine skalierbare, geschlossene Systemlösung zur Herstellung krankheitsrelevanter neuronaler Zellpopulationen für die Untersuchung therapeutischer Zielstrukturen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Erhaltung von Zelloberflächenmolekülen, die für die Zielidentifizierung entscheidend sind.
- Operationaler Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem charakteristische Oberflächenproteine während der Dissoziation erhalten bleiben.
- Predictiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung durch die Erzeugung lebensfähiger Einzelzell-Suspensionen, die für funktionelle Validierungsassays geeignet sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Anwendungen wie die Markierung mit monoklonalen Konjugaten und die bead-basierte Trennung auf.
- Operativer Wert: Gewährleistet die Standardisierung von Assays durch voreingestellte gentleMACS-Programme und die standardisierte Aufbereitung der C Tubes.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die zuverlässige Evaluierung von Verbindungen durch eine konsistente Einzelzell-Suspension über verschiedene Gewebemengen hinweg bis zu 1600 mg.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationaler Wert: Erhält die Krankheitsrelevanz, indem Suspensionen aus murinem Nervengewebe erzeugt werden, die für die Isolierung von Vorläuferzellen geeignet sind.
- Kontinuitätswert: Unterstützt die translationale Biomarker-Abstimmung durch Erhalt von Oberflächenmarkern wie Prominin-1 zur Identifizierung neuronaler Vorläuferzellen.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht eine präklinische Kontinuität, indem die Entfernung von Myelintrümmern die Reinigungseffizienz verbessert.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Hypothese bis hin zur Leitstrukturidentifizierung und bietet standardisierte neuronale Zellpräparationen für nachgeschaltete Anwendungen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen, indem lebensfähige Zellsuspensionen erzeugt werden, die molekulare Oberflächendeterminanten der Zellen erhalten.
- Screening: Gewährleistet Bereitschaft für Assays durch reproduzierbare Dissoziations- und Filtrationsschritte, die mit der Zellfilter-basierten Trennung kompatibel sind.
- Analytik: Ermöglicht quantitative Messungen mittels flusszytometriegerechter Einzelzellsuspensionen zur Analyse von Vitalität und Markerexpression.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckungsforschung mit präklinischer Arbeit durch die Erhaltung von Oberflächenmarkern wie Prominin-1 zur Anreicherung neuronaler Vorläuferzellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare Methode zur Verarbeitung neuralen Gewebes aus embryonalen, postnatalen und adulten Proben unter sterilen Bedingungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit durch erhaltene antigene Epitope und hohe Vitalität (97 %, wie gezeigt).
- Operationaler Wert: Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch voreingestellte Dissoziierungsprogramme und reagentspezifische Kit-Auswahl (P oder T).
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen durch zuverlässige Isolierung neuraler Vorläuferzellen mittels Anti-Prominin-1 MicroBeads nach Myelindepletion.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung durch skalierbare Aufarbeitung von Hirngewebeschnitten oder gesamtem Gehirn in geschlossenen sterilen Umgebungen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit neuralen Geweben und bei der Auswahl von Dissoziationskits basierend auf der Empfindlichkeit des Ziel-Epitops.
- Benötigt einen gentleMACS-Dissoziator, C-Röhrchen und geeignete Dissoziationskits für neuronales Gewebe (papain- oder trypsinbasiert).
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über Teams hinweg bei der Zubereitung von Lösungen (HBSS-Varianten, Enzymgemische) und Inkubationsprotokollen voraus.
- Erfordert Anpassungen bei Gewebemengen über 400 mg, wobei die Reagenzienmengen bis zur Grenze von 1600 mg skaliert werden müssen.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen, wie beispielsweise die Notwendigkeit von Myelin-Entfernungskügelchen, um die Reinigungsausbeute der Zielpopulationen zu verbessern.
