Name: Generierung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus Nervengewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-07T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit dem gentleMACS Dissociator lebensfähige Einzelzellsuspensionen aus Maus-Nervengewebe gewinnen. Diese Methode bewahrt Antigen-Epitope und ermöglicht präzise Zellidentifizierung.

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Um Arbeit unter sterilen Bedingungen, ist es empfehlenswert, alle Schritte in einer Sterilbank durchgeführt. 1. Materialien <ul><li> Neural Gewebedissoziation Kit (P) (Komponenten: Lösung 1,2, 3 und 4, Storage Buffer) </li><li> Pre-Separation-Filter </li><li> (Optional) Myelin Removal Beads </li><li> Beta-Mercaptoethanol </li><li> gentleMACS Dissociator </li><li> C Tubes </li><li> MACSmix Tube Rotator </li><li> HBSS (w / o) </li><li> HBSS (w) </li></ul><ol><li> Stellen Sie folgende Lösungen vor Beginn des Protokolls: <ol><li> Hanks 'Salzlösung ohne zweiwertige Kationen Ca 2 + oder Mg 2 + (HBSS (w / o) </li><li> HBSS, Standard, dh mit Ca 2 + und Mg 2 + (HBSS (w) </li></ol></li><li> Abhängig von der Antigen-Epitop von Interesse in den folgenden Anwendungen verwenden entweder die Papain-basierte Neural Gewebedissoziation Kit (P) oder Trypsin-basierte Neural Gewebedissoziation Kit (T). </li><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen aus dem Nervengewebe Dissoziation Kit: <ol><li> Lösung 2: add beta-Mercaptoethanol bis 0,067 mM </li><li> Lösung 4: Das Pulver in 0,7 ml Lagerpuffer (sofern im Kit enthalten), vorsichtig mischen (nicht vortexen) </li><li> Enzyme Mix 1: Pipette 1,9 ml Lösung 2 und 50 ul Lösung 1 (beide aus Kit) in eine C Tube und Inkubation für 10-15 min bei 37 ° C. Das genügt, um 400 mg des Gehirngewebes zu distanzieren. </li></ol></li></ol> 2. Dissoziation der Nervengewebe <ol><li> Wiegen Hirngewebe in ein Röhrchen mit 1 ml HBSS (w / o) </li><li> Transfer-Maus Gehirn in der C Rohr mit 1950 ul vorgewärmtes Enzyme Mix 1. (Hinweis: Dieses Protokoll ist für ≤ 400 mg geschrieben, aber Lösung Volumes können skaliert auf bis zu 1600 mg Hirngewebe pro C Rohr sein) </li><li> Legen Sie die C Tube auf die gentleMACS Dissociator und Run-Programm "m_brain_01". </li><li> Inkubieren mit Rotation (4 min mit einem MACSmix Tube Rotator) für 15 min bei 37 ° C. </li><li> Legen Sie die C Tube auf die gentleMACS Dissociator und Run-Programm "m_brain_02". </li><li> Während der Dissoziation Schritt vorzubereiten 30 ul Enzym Mix 2 pro 400 mg Gewebe durch vorsichtiges Mischen von 20 ul der Lösung 3 und 10 ul Lösung 4. </li><li> Add Enzyme Mix 2 der C Rohr über das Septum-Dichtkappe und vorsichtig mischen, ohne Verwirbelungen. </li><li> Inkubieren Sie die C Tube mit Rotation für 10 min bei 37 ° C im Brutschrank. </li><li> Legen Sie die C Tube auf die gentleMACS Dissociator und Run-Programm "m_brain_03". </li><li> Inkubieren Sie die C Tube mit Rotation für 10 min bei 37 ° C im Brutschrank. </li><li> Kurz zentrifugieren, um die Probe am Boden des Röhrchens zu sammeln. </li></ol> 3. Filtration <ol><li> Wählen Sie einen Filter groß genug, um den Durchgang zu den Zellen von Interesse erlauben. Zum Beispiel sind Purkinjezellen zu groß, um durch eine 30 pm Filter passieren, aber Prominin-1 + Zellen. </li><li> Verwenden Sie einen suitable1000 ul Pipette auf die Zellen zu entfernen bilden die C Rohr durch das Septum verschlossenen Deckel und es auf die Pre-Separation-Filter auf einem 15 ml-Collection-Tube. (Hinweis: Bei größeren Stichproben mit einem 50 ml-Collection-Tube). </li><li> Waschen Sie den Filter mit 10 ml HBSS (w). </li><li> Centrifuge die gefilterten Zellen bei 300 xg für 10 min bei RT. </li><li> Resuspendieren der Überstand in Ihrem Medium oder Puffer der Wahl für spätere Anwendungen. </li><li> So entfernen Sie Myelin Trümmer, verwenden Myelin Removal Perlen. </li></ol> 4. Repräsentatives Ergebnis: siehe Abbildungen 1-3 <img src="/files/ftp_upload/1267/Fig_1.png" alt="Abb. 1"> Abbildung. 1 Das Gehirn Dissoziation mit der gentleMACS Dissociator führte in 97% lebensfähige Zellen, wie die durchflusszytometrische Analyse zeigt. <img src="/files/ftp_upload/1267/1267fig2.png" alt="Abb. 2"> Abbildung. 2 Light-Aufnahme von Neurosphäre Bildung nach magnetischer Zellsortierung mit Anti-Prominin-1 MicroBeads nach 7 Tagen Kultivierung in MACS ® NeuroMedium mit MACS Supplement B27 PLUS ergänzt. Die Zellen wurden aus CD1 Gehirn der Maus (P3) mit dem Neural Gewebedissoziation Kit (P) vorbereitet. <img src="/files/ftp_upload/1267/1267fig4.jpg" alt="Abb. 3.5"> Abbildung. 3 Myelin Trümmer in Einzel-Zellsuspensionen erheblich beeinträchtigt Zellisolation und das Entfernen von Myelin Trümmer von Myelin Removal Perlen steigert die Effizienz Zelle Trennungen. Für MACS Separations mit Anti-Prominin-1 MicroBeads wurde P22 Maushirn dissoziiert mit dem Neural Gewebedissoziation Kit (P). Zellen aus der Einzel-Zell-Suspension wurden entweder direkt für die Trennung verwendet werden, oder wurden eingereicht, um einer Verarmung Myelin mit Myelin Removal Perlen. Vergleicht man die Trennung von Proben ohne und mit Myelin Entfernung, zeigt, dass die Reinheit höher ist für Proben mit früheren Myelin Entfernung.

<ol><li>Hardt, O., Scholz, C., Küsters, D., Yanagawa, Y., Pennartz, S., Cremer, H., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+analysis+defines+differences+between+region-specific+GABAergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gene expression analysis defines differences between region-specific GABAergic neurons.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 418-428 (2008).</li>
<li>Lee, J. K., McCoy, M. K., Harms, A. S., Ruhn, K. A., Gold, S. J., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+of+G-protein+signaling+10+promotes+dopaminergic+neuron+survival+via+regulation+of+the+microglial+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response.</a> J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).</li>
<li>Környei, Z., Gócza, E., Rühl, R., Orsolits, B., Vörös, E., Szabó, B., Vágovits, B., Madarász, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglia-derived+retinoic+acid+is+a+key+factor+in+glia-induced+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Astroglia-derived retinoic acid is a key factor in glia-induced neurogenesis.</a> FASEB J. 21, 2496-2509 (2007).</li>
<li>Meylan, F., Davidson, T. S., Kahle, E., Kinder, M., Acharya, K., Jankovic, D., Bundoc, V., Hodges, M., Shevach, E. M., Keane-Myers, A., Wang, E. C., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TNF-family+receptor+DR3+is+essential+for+diverse+T+cell-mediated+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The TNF-family receptor DR3 is essential for diverse T cell-mediated inflammatory diseases.</a> Immunity. 29, 79-89 (2008).</li>
<li>Skog, J., Würdinger, T., van Rijn, S., Meijer, D. H., Gainche, L., Sena-Esteves, M., Curry, W. T. Jr, Carter, B. S., Krichevsky, A. M., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren sind Mitarbeiter von Miltenyi Biotec GmbH, Deutschland.

Die gentleMACS Dissociator erleichtert die standardisierte Erstellung von Einzel-Zellsuspensionen von Nervengewebe in einem geschlossenen System. Neural Gewebedissoziation Kits sind optimiert, um Antigen-Epitope für weitere Anwendungen wie Immunofärbungen und immunomagnetische Zellseparation 1-5 benötigt bewahren. In diesem Protokoll zeigen wir die schonende enzymatische Spaltung von Gehirn der Maus mit dem gentleMACS Dissociator und der Neural Gewebedissoziation Kit (P), was in 97% lebensfähige Zellen. 100 mg Nervengewebe Ausbeuten zwischen 5x10 6 und 1x10 7 Zellen, je nach dem Alter der Wirtsgewebe. Die gezielte Prominin-1 + Zellen wurden isoliert mit Anti-Prominin-1 MicroBeads und anschließend in Kultur genommen. Das Protokoll wird gezeigt werden, noch effektiver mit den zusätzlichen Einsatz von Myelin Removal Beads bei der Arbeit mit neuronalen Gewebe von Mäusen&gt; P7 abgeleitet.

<table><tbody><tr><td>C-Gefäße</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Bestellnr. 130-093-237</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; Starterset</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Bestellnr. 130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACSmix&amp;#8482; Röhrchenrotator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Bestellnr. 130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Neural Tissue Dissociation Kit (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Bestellnr. 130-092-628</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Vorabtrennfilter</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Bestellnr. 130-041-407</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Anti-Prominin-1 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Bestellnr. 130-092-333</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotac.com/de/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Anti-Prominin-1-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Bestellnr. 130-092-335</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Myelin-Entfernungskügelchen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Bestellnr. 130-094-544</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Art 1000 Reach Pipettenspitzen </td><td>Molecular BioProducts</td><td>Bestellnr. 2079</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61&quot;&gt;http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html&quot;&gt;http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Neural Tissue Dissociation Kit (T)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Bestellnr. 130-093-231</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Propidiumiodidlösung</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Bestellnr. 130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/de/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

generierung von einzel-zellsuspensionen aus maus nervengewebe

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Innerhalb des Nervensystems, haben Hunderte von neuronalen und glialen Zelltypen beschrieben worden. Jeder Zelltyp im Gehirn oder Rückenmark hat ein Repertoire von Zelloberflächen-Moleküle oder molekulare Determinanten, durch die sie identifiziert und charakterisiert werden können. Derzeit erfordern robuste Zelle Identifikation und Trenntechnik Single-Cell-Präparate zu erzeugen und gleichzeitig die Begrenzung Zelltod und die Zerstörung der charakteristischen Oberfläche Protein sein. Die gentleMACS Dissociator, wenn es in Kombination mit Trypsin oder Papain-basierte Dissoziation Kits verwendet wird, kann effektiv und schonend distanzieren Hirngewebe unter Beibehaltung Antigen-Epitope und die Begrenzung der Zellverlust. Standardisierte Erstellung von Einzel-Zell-Suspensionen erfolgt über C Rohre und optimiert, Preset gentleMACS Programme. Einmal erzeugt, Einzel-Zellsuspensionen mit monoklonalen Konjugate wie Anti-Prominin-1 MicroBeads, die neuralen Vorläuferzellen zu identifizieren, oder weiter gereinigt mit Myelin Removal Beads behandelt werden.

Distanziert Zellen aus bestimmten Gewebearten erfordert spezifische Parameter für Gewebe aggitation zu einem hohen Volumen von lebensfähigen, kultivierbaren Zellen zu erhalten. Die Miltenyi gentleMACS Dissociator optimiert diese Aufgabe mit einem einfachen, praktischen Protokoll. In dieser Veröffentlichung wird die Verwendung dieser Vorrichtung auf nerual Gewebe erklärt.

Generierung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus Nervengewebe

Innerhalb des Nervensystems wurden Hunderte von neuronalen und glialen Zelltypen beschrieben. Jeder spezifische Zelltyp im Gehirn oder Rückenmark besitzt eine ...

Im Nervensystem wurden Hunderte von neuronalen und glialen Zelltypen beschrieben. Jeder spezifische Zelltyp im Gehirn oder im Rückenmark verfügt über ein Repertoire an Zelloberflächenmolekülen oder molekularen Determinanten, durch die er identifiziert und charakterisiert werden kann.Derzeit erfordern robuste Technologien zur Zellidentifizierung und -separation die Erzeugung von Einzelzellpräparationen, wobei gleichzeitig der Zelltod und die Zerstörung charakteristischer Oberflächenproteine begrenzt werden müssen. Der Gentle Max Associator kann in Kombination mit Trypsin- oder Pepane-basierten Dissoziationskits effektiv und schonend Gehirngewebe dissoziieren, wobei die Antigen-Epitope erhalten bleiben und der Zellverlust minimiert wird. Einmal erzeugte Einzelzell-Suspensionen können anschließend mit monoklonalen Konjugaten wie Anti-Prominent-One-Mikroperlen behandelt werden, die neurogene Vorläuferzellen identifizieren, oder mithilfe von Myelin-Entfernungspartikeln weiter gereinigt werden.Hallo, mein Name ist Sandra PeNAT. Ich bin Projektmanagerin für Neurowissenschaftsprodukte bei Mil Biotech hier in Bagge Gabert, Deutschland. Heute zeige ich Ihnen, wie man eine Einzelzell-Suspension aus Maushirngewebe mit dem Genix-Disasziator herstellt.Der Genix-Dissoziator ist ein Gerät, das eine Vielzahl von Gewebetypen in einer geschlossenen, sterilen Umgebung dissoziieren kann und somit die Notwendigkeit für zeitaufwändige manuelle mechanische Dissoziation eliminiert. Beginnen wir also. Verwenden Sie je nach dem interessierenden Antigenepitop in nachfolgenden Anwendungen entweder das auf Papain basierende Kit zur Neuralgewebs-Dissoziation oder das auf Trypsin basierende Kit zur Neuralgewebs-Dissoziation.Für das heutige Experiment bevorzugen wir das Neuro-Gewebe-Dissociationskit P, da wir prominente positive Zellen mithilfe von Anti-Prominent-One-Mikroperlen isolieren möchten. Prominent One ist weder gegenüber Pepan noch gegenüber Trypsin empfindlich, und in einem solchen Fall ist das Neuro-Gewebe-Dissociationskit P die bessere Wahl. Bevor das Protokoll gestartet wird, müssen die Reagenzien und Lösungen für dieses Kit vorbereitet werden.Haben Sie Ihre eigene Lagerlösung von Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Calciumionen und Magnesiumionen sowie HBSS mit Calcium- und Magnesiumionen und Beta-Mercaptoethanol bereit. Beginnen Sie mit der Herstellung von Lösung zwei, Lösung vier und anschließend der Enzymmischung eins. Geben Sie zunächst Beta-Mercaptoethanol zu Lösung zwei, um eine Endkonzentration von 0,067 Millimolar zu erreichen.Die Lösung ist nun bei einer Lagerung bei vier Grad Celsius bis zu einem Monat stabil. Als Nächstes lösen Sie das lyophilisierte Pulver und eine als Lösung gekennzeichnete Ampulle Vier. Geben Sie 0,7 Milliliter Lagerpuffer hinzu und mischen Sie vorsichtig, ohne zu wirbeln.Bereiten Sie nun das Enzymgemisch eins vor, indem Sie 1900 Mikroliter Lösung zwei und 50 Mikroliter Lösung eins in ein C-Gefäß pipettieren. Diese Menge reicht aus, um 400 Milligramm Gewebe zu dissociieren; wenn mehr Gewebe dissociiert werden soll, bereiten Sie zusätzliches Enzymgemisch eins vor. In einem C-Gefäß können maximal 1600 Milligramm Hirngewebe verarbeitet werden.Die Enzymmischung eins im C-Gefäß wird anschließend 10 bis 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert. Geben Sie zur Initiierung der Dissoziation ein Milliliter HBSS ohne Calcium- und Magnesiumionen mittels Pipette in das Gefäß. Stellen Sie das Gefäß auf eine Waage, fügen Sie das Gehirngewebe hinzu und notieren Sie dessen Masse.Dieses P4-Mausgehirn wiegt etwa 0,2 Gramm. Ein erwachsenes Gehirn würde etwa 0,4 Gramm wiegen; für alle Gewebeproben unter 400 Milligramm sind die Lösungsvolumina, die wir heute verwenden, ausreichend.Wenn Ihr Gewebe mehr als 400 Milligramm wiegt, skalieren Sie alle Reagenzvolumina entsprechend hoch; bis zu 1600 Milligramm Gewebe können in einem C-Gefäß verarbeitet werden. Überführen Sie das Maushirn in das vorbereitete C-Gefäß, das 1.950 Mikroliter vorgewärmtes Enzym enthält. Mischen Sie einmalig und verschließen Sie die Kappe fest.Platzieren Sie nun das C-Röhrchen mit der Kappe nach unten auf den Gen Max Associator und stellen Sie sicher, dass sich das Gewebe im Bereich des Stators befindet. Wählen Sie das Programm MCO brain O one aus und führen Sie es aus. Dies ist das erste der drei Programme, die Sie bei der Dissoziation ausführen werden; starten Sie das nächste Programm, sobald das vorherige beendet ist.Entfernen Sie die C-Röhre und inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius unter langsamer kontinuierlicher Rotation. Verwenden Sie den Max-Mix-Röhrenrotator, wobei die Laufart des Geräts vier U/min entspricht. Nach der ersten Inkubation setzen Sie die Röhre umgekehrt wieder auf die Dissoziationseinheit und führen das Programm M brain O2 aus. Während der nächsten Assoziation bereiten Sie 30 Mikroliter Enzymmix zwei pro 400 Milligramm Gewebe vor, indem Sie 20 Mikroliter Lösung drei zu 10 Mikrolitern Lösung vier hinzufügen.Wenn der zweite Assoziator-Zyklus beendet ist, pipettieren Sie 30 Mikroliter Enzym-Mix zwei in die C-Röhre direkt durch die mit einem Septum verschlossene Öffnung in der Mitte des Verschlusses. Um die Sterilität zu gewährleisten, drehen Sie die C-Röhre vorsichtig um, um zu mischen, und verwenden Sie keinen Vortex. Stellen Sie die C-Röhre anschließend zurück auf den Max-Mix-Röhrenrotator und inkubieren Sie die Probe 10 Minuten bei 37 Grad Celsius mit einer Mischgeschwindigkeit von vier Umdrehungen pro Minute.Dann wird die CTU zum dritten und letzten Mal auf den sanften Max-Dis-Dissociator zurückgebracht, und das Programm M brain oh drei wird ausgeführt. Sobald das dritte Programm abgeschlossen ist, stellen Sie die C-Röhrchen auf den Rotator und inkubieren sie weitere 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie nun die Probe kurz, um die Zellen am Boden des Röhrchens zu sammeln.Jetzt sind wir bereit, die Zellen zu filtrieren. Wählen Sie einen Zellsieb entsprechend der Größe Ihres interessierenden Zelltyps aus. Wenn die Zellen, die Sie sammeln möchten, einen Durchmesser von mehr als 30 Mikrometern aufweisen, wie beispielsweise Kinji-Zellen, muss die Porengröße groß genug sein, um Zellkörper dieses Durchmessers passieren zu lassen.Für deutlich positive Zellen eignet sich ein 30-Mikrometer-Filter. Entfernen Sie das dissoziierte Gewebe aus der C-Röhre mithilfe von 1000-Mikroliter-Pipettenspitzen, die durch die mit einem Septum verschlossene Öffnung im C-Röhrenverschluss passen. Geben Sie die Zellsuspension auf den vorgeschalteten Trennfilter, der auf einer 15-Milliliter-Sammelröhre platziert ist. Für größere Probenvolumina kann ein 50-Milliliter-Röhrchen erforderlich sein. Lassen Sie die Zellsuspension durch den Filter laufen. Spülen Sie anschließend den Filter mit 10 Milliliter HBSS-Lösung mit Calcium- und Magnesiumionen aus.Wenn Gewebemengen von mehr als 400 Milligramm verwendet werden, wenden Sie bis zu 30 Milliliter HBSS mit Calcium- und Magnesiumionen zur Spülung des Filters an. Pelletieren Sie nun die Zellen im Sammelröhrchen durch Zentrifugation bei 300 ×g für 10 Minuten bei Raumtemperatur, entfernen Sie das Überstandsvolumen vollständig und resuspendieren Sie das Zellenpellet in Ihrem gewünschten Puffer oder Medium. An dieser Stelle können Sie eventuell vorhandenes Myelingewebe entfernen, da dieses die Zellisolierung und Antikörperfärbung beeinträchtigen kann.Um Myelintrümmer zu entfernen, empfehlen wir die Verwendung von Myelin-Entfernungskügelchen. Andernfalls sind die Zellen bereit für weitere Anwendungen. Dieses Punktediagramm basierend auf der Anfärbung mit Propidiumiodid zeigt, dass 97 % der Zellen in einer Einzelzell-Suspension aus einer Mausverletzung, wie der in diesem Video erzeugten Suspension, vital sind.Diese Zellen können weitergereinigt werden, indem anti-prominente Mikroperlen verwendet werden, um neuronale Vorläuferzellen zu erhalten, die in Max-Neuro-Medium, ergänzt mit B 27 Plus, Neurophären in diesen Punktdiagrammen bilden können. Der Vorteil der Behandlung von Suspensionen mit Myelin-Entfernungspellets wird sichtbar. Ein signifikant höherer Prozentsatz an prominent-1-exprimierenden neuronalen Vorläuferzellen wird durch Max-Trennung nach Myelin-Depletion aus einer Einzelzell-Suspension erhalten.Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie man eine Einzelzell-Suspension aus Mausehirngewebe unter Verwendung der Genix-Dissociation und des Neural Tissue Dissociation Kit herstellt. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, dass alle Lösungen entsprechend der richtigen Wahl des Neural Tissue Dissociation Kit, Typ T oder P, geeignet vorbereitet werden. Bitte beachten Sie das Anwendungsnotiz oder Datenblatt des NDK. Mit dieser Methode können embryonales Gewebe sowie D-Gewebeschnitte oder das gesamte Gehirn unter sterilen Bedingungen zeitsparend und standardisiert verarbeitet werden.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video beschreibt die Methode zur Isolierung von neuroprecursors aus den Entwicklungsländern Kortex embryonaler Mäuse verwendet. Das Verfahren zur Entfernung von Embryonen aus der Gebärmutter, sezieren die kortikale Gewebe und verdauen die isolierten Hirnrinde dargestellt.

Kultur der Maus Neural Stem Cell Precursors

Eine einfache und zuverlässige Methode zur Isolierung und Kultivierung von neuralen Stammzellen aus gebrauchten menschlichen fetalen kortikalen Gewebe wird beschrieben. Kulturen von bekannten menschlichen neurologischen Erkrankungen abgeleitet werden können für die Charakterisierung von pathologischen zellulären und molekularen Prozesse eingesetzt werden, sowie eine Plattform bieten, um pharmakologische Wirksamkeit zu beurteilen.

Generierung von neuralen Stammzellen aus menschlichen Föten Ausrangierte Rindengewebe

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung von Stammzellen aus dem postnatalen Kleinhirn der Maus und zur Differenzierung in Nervenzellen. Stammzellen aus der isolierten Zellsuspension werden mit Antikörper-beschichteten Magnetbeads aufgereinigt und zu Neurosphären kultiviert. Die Neurosphären werden dann in einem Differenzierungsmedium gehalten, um Nervenzellen zu erzeugen.

Isolierung von Stammzellen aus dem postnatalen Kleinhirn der Maus und Differenzierung in Nervenzellen

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Gewinnung einer hochgradig lebensfähigen Einzelzellsuspension aus dem Hippocampus des Mausgehirns unter Verwendung einer Kombination aus automatisierter mechanischer Dissoziation und einer Mischung von Enzymen, um die enzymatische Verdauung zu unterstützen.

Gewinnung einer einzelligen Suspension aus Hippocampusgewebe der Maus

Das Video zeigt die Herstellung einer Einzelzellsuspension von Immunzellen aus einem murinen Gehirngewebe. Es beinhaltet eine enzymatische Verdauung, um Zellen aus dem Gehirngewebe freizusetzen, gefolgt von einer Dichtegradientenzentrifugation, um die Immunzellen basierend auf ihrer Dichte zu isolieren und die Einzelzellsuspension zu erhalten.

Herstellung einer einzelligen Suspension von Immunzellen aus murinem Hirngewebe

Hier beschreiben wir eine detaillierte Protokoll für die gleichzeitige Erzeugung von neuralen Vorläuferzellkulturen, entweder als Mono-oder haftNeuroSphären, aus der Subventrikularzone und Gyrus dentatus der einzelnen erwachsenen Mäusen.

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

Die Etablierung von Kultursystemen für die Expansion adulter neuraler Stammzellen (aNSCs) ermöglicht die Untersuchung und Anwendung von aNSCs für die Therapie. Die subkallosale Zone (SCZ) wurde kürzlich als neuartige Neuroblasten-bildende Region bei erwachsenen Mäusen erkannt. Hier werden Methoden zur Isolierung, Expansion und Differenzierung von SCZ-aNSCs beschrieben.

Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus der Maus subcallosa Zone

Hier stellen wir eine neuartige mikrochirurgische Technik für die Isolierung von neuralen Stammzellen aus E13 Maus Embryo ganglionic Eminenz.

Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen

Hier beschreiben wir ein Nukleofektionssystem, das die Effizienz der Genübertragung in expandierten neuralen Stammzellen (NSCs) verbessern soll, die aus der adulten subventrikulären Zone von Mäusen isoliert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode die Genstörung in NSCs signifikant verbessert, die Wirksamkeit traditioneller Transfektionsprotokolle übertrifft und die Überlebensrate der Zellen erhöht.

Isolierung, Expansion und Nukleofektion von neuralen Stammzellen aus der adulten subventrikulären Zone der Maus

Um die Immunantwort auf Hirnerkrankungen zu untersuchen, ist ein gängiger Ansatz die Analyse von Veränderungen in Immunzellen. Hier werden zwei einfache und effektive Protokolle für die Isolierung von Immunzellen aus murinem Hirngewebe und Schädelknochenmark bereitgestellt.

Isolierung von Immunzellen aus dem Gehirn und dem Schädel von Mäusen

Erfahren Sie, wie Sie mit dem gentleMACS Dissociator lebensfähige Einzelzellsuspensionen aus Maus-Nervengewebe gewinnen. Diese Methode bewahrt Antigen-Epitope und ermöglicht präzise Zellidentifizierung.

Generierung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus Nervengewebe

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