Name: Paarung und Tetrad Trennung von Chlamydomonas reinhardtii Für genetische Analysen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Lernen Sie die Paarung und Tetradentrennung von Chlamydomonas reinhardtii für genetische Analysen. Diese Methoden ermöglichen Gametogenese, Zygotenkeimung und genetische Untersuchungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dieses Protokoll basiert auf Techniken, die in dem Labor von Francis-André Wollman am Institut de Biologie Physikalisch-Chimique, Paris, Frankreich gelernt basiert. Die Autoren schulden Dank Jacqueline Girard-Bascou, die ursprünglich eingeführt DBS zu Chlamydomonas genetischen Techniken. Chlamydomonas Forschung in der Autoren-Labor von der National Science Foundation Award MCB-0646350 wird unterstützt.

Teil 1: Vorbereitung der Stämme für Gametogenese Hinweis: Alle Manipulationen sollte bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Höhere oder niedrigere Temperaturen beeinträchtigen die Geschwindigkeit der Zygote Keimung und können sich negativ auf die Lebensfähigkeit. Wichtige Überlegung: Es ist wichtig, dass die Stämme zu paaren sind robust wachsen und sind frei von verunreinigenden Pilze oder Bakterien. Wenn die Stämme nicht regelmäßig übertragen worden sind, sollten Passage auf Vollmedium vorausgehen Generation von Keimzellen. <ol><li> Strains zu verpaart werden auf TAP-Platten (100 × 15 mm), 1-2 Stämme pro Platte übertragen. Die Zellen sollten in eine konzentrierte Streifen ca. 1 cm in der Breite angebaut werden. </li><li> Inkubation auf TAP Platten sollte bis eine dicke Schicht robust wachsenden Zellen vorhanden ist, mit Zwischen-Transfers, wenn nötig. Stämme, die nicht kürzlich passagiert eventuell ein Durchgang und insgesamt 1 Woche, während Wildtyp-Stämme in regelmäßigen Gebrauch nur kann ein paar Tage und keine Passagen. Mutanten, die lichtempfindlich sind eventuell zusätzliche Zeit. </li><li> Übertragen Sie alle Zellen aus der TAP Platten N10 Platten, die noch unzureichend für Stickstoff und beginnt zu Gametogenese induzieren. Übertragen Sie die Zellen als eine dicke Platte, so wie sie auf dem TAP-Platte wurden. Dies erleichtert die anschließende Sammlung der Zellen. Nach 3 Tagen auf N10 werden die Zellen bereit, Gametogenese unterziehen. Die Zellteilung wird langsam auf N10, jedoch Zellen sollten dunkelgrün bleiben. Jede kontaminierte Stämme zu verwerfen als lebensfähig Zygoten nicht erreicht werden wird. </li></ol> Teil 2: Mating <ol><li> Jeder Stamm wird in einen 50 ml Erlenmeyerkolben überführt und erneut in ca. 2,5 ml sterilem destilliertem Wasser. Dies kann entweder mittels einer Drahtschlinge oder einer sterilen Stick sein, was wichtig ist, dass die Zellen gut suspendiert sind und nicht in Klumpen. Die genaue Menge Wasser sollte so eingestellt sein, dass die Zellkonzentration, wie mit dem Auge abschätzen, etwa die gleiche für jeden Stamm ist. </li><li> Die Zellen werden unter starkem Licht (1,260 μ E / m 2 / sec) für 2 Stunden gerührt, während welcher Zeit die Zellen beweglich Gameten werden. Motilität sollte unter einem Lichtmikroskop überprüft werden. Wenn die Gameten schlecht schwimmen, ist Paarung wahrscheinlich ineffizient. Allerdings wird auch schlecht bewegliche Stämme Kumpel eine verminderte Häufigkeit. </li><li> Next gleiche Volumen von mt + und mt-Gameten sind in einem einzigen 50 ml Flasche kombiniert. Gameten werden unter starkem Licht (1,260 μ E / m 2 / sec) ohne Bewegung nach links. </li><li> Mating sofort unter dem Lichtmikroskop überprüft werden. Paare von Gameten bilden sich rasch, und erscheint so schnell bewegenden Zellen trat bei der Geißeln. Wenn Paarung zu sein scheint extrem schnelle, sollten die Proben innerhalb von 30 min -1 hr für die Erzeugung von Zygoten genommen werden. Wenn nicht, können Paarung jede Stunde überprüft werden, obwohl dies optional. Seit Zeiten geben die optimale Dichte von Zygoten stark variieren wird zwischen kreuzt, ist es am besten, Aliquots der Paarung Mischung zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Vereinigung Gameten, z. B. nach 1 Stunde, 2 Stunden, 3 Stunden und 4 Stunden. 3-4 Punkte pro Platte; Dies ist durch die Übertragung von 300 ul Proben TAP-3% Difco-Agar 60 × 15 mm-Platten durchgeführt. Achten Sie darauf, nicht auf die Paarung Mischung rühren, als dieser Paarung Paare stören können. Difco-Agar wird verwendet, weil sie weniger Schadstoffe als preisgünstigere Agars hat, und es wird einfacher sein, Zygoten unter dem Mikroskop zu sehen. Die nicht verwendeten Paarung Mischung kann in der Flasche über Nacht stehen gelassen werden, und die Qualität der Paarung Reaktion wird offensichtlich am nächsten Tag. Beim Stecken effizient ist, werden die Zygoten an der Wand oder Boden des Kolbens haften und das Medium erscheint klar. Auch Bewegung der Kolben wird nicht die Zygoten zu entfernen. Wenn nichts haftet an Glas, wenn die Mischung mit hinreichender Kraft bewegt wird, dann Paarung war ineffizient oder gar nicht stattfinden. </li><li> Die TAP-Difco-Platten, die Paarung Mischung in eine sterile Haube getrocknet, mit dem Deckel offen, bis jeder Oberfläche Flüssigkeit aufgesogen ist. Die Platten sind in der Regel in das Licht (700 nE / m 2 / sec) für 18 Stunden belassen, dann in Folie verpackt, da Zygospore Reifung nur stattfinden wird in der Dunkelheit. Die Stämme gekreuzt, Paarung Uhrzeit und Datum werden auf beiden Platten und die Folie geschrieben. Platten gespeichert sind 5 bis 7 Tage und länger gehalten werden, obwohl Zygote Keimung Effizienz sinkt schrittweise. </li></ol> Teil 3: Tetrad Dissection <ol><li> Vegetative Zellen sollten ausgeschaltet werden getrocknet Flecken der Paarung Mischung mit einer stumpfen Klinge, wie ein Skalpell abgekratzt. Die Klinge kann verwendet werden, um eine Fläche von Zygoten, die dicht halten wird, die 3%-Agar freizulegen. Dieser Schritt ist in der Regel nachmittags durchgeführt, so dass die Zygoten haben am nächsten Morgen gekeimt, aber nicht eine zweite, vegetative Teilung, die würde unterzogenAusbeute 8 Nachkommen. Chlamydomonas Biologen lernen schnell, Zygoten unter dem Mikroskop zu erkennen, da sie größer als vegetative Zellen, und verfügen über einen dicken Zygospore Wand, die eine schwarze Kontur verleiht. Zygosporen oft gelb erscheinen, kann aber auch etwas grün. Die wichtigste Zeichen ist, dass sie auf Agar-Stick, während vegetative Zellen leicht bewegt werden beiseite. Allerdings sind, wenn die Platten zu trocken wird dies nicht der Fall sein. Auch, wenn die Paarung Mischung zu dicht wurde, kann Zygoten Form einer Matte, die machen Übertragung einzelner Zygoten schwierig oder unmöglich wird. Entsprechende Dichten sind in Schritt 2.1 etabliert und wird schnell mit der Erfahrung gelernt werden. </li><li> Glass Nadeln sind für die Sammlung und Trennung Zygoten Tetrade Nachkommen vorbereitet. Diese werden durch Ziehen 3 mm Glasstäbe in einer kleinen Flamme zu einem langen, dünnen Faden, der auch scheitern kann generieren vorbereitet. Die Spitzen dieser verjüngten Enden geglättet oder in die Haken gebogen, durch kurzes Erhitzen in einer kleinen Flamme (z. B. Alkohol oder ein brennendes Zündholz). Bereiten Sie 3 oder mehr Glasnadeln, da sie relativ leicht zu brechen, vor allem für unerfahrene Anwender. </li><li> Zygoten auf die 3%-TAP-Difco Platte mit einem Glas Nadel in einen kleinen Haufen versammelt. Ein Quadrat von Agar (bis 0,5 cm 2) mit den Zygoten gebildet und ausgeschnitten mit einem stumpfen Skalpell. Dann wird der Agar-Block Gesicht nach unten auf eine 15 mm 1,5% TAP-Difco Platte, und rutschte entlang einer horizontalen Linie ca. 1,5 cm von der Oberseite der Platte, auf die Zygoten zu verteilen. Die obere horizontale Linie, und ein Gitter mit ca. 1,5 cm horizontal und 0,5 cm vertikalen Abstand in die Rückseite der Platten geätzt. Das Raster wird verwendet am folgenden Tag als Leitfaden für die Trennung der Tetrade Nachkommen (das Netz kann auch der Tag der Dissektion geätzt werden). Schließlich sind einzelne Zygoten auf die Schnittpunkte der oberen horizontalen Linien mit jeweils vertikalen Linie bewegen, mit etwa 20-30 Zygoten pro Platte. Obwohl nur 12 oder so wird seziert, nicht jede Zygote keimt, und einige werden zweimal teilen vor dem Bersten sind so zusätzliche Zygoten benötigt. </li><li> Nach der Verteilung der Zygoten und vegetativen Zellen, die versehentlich von der 3%-Agar-Platte übertragen werden, indem die umgekehrte Platte für 30 Sekunden bei einem Glas Schale mit einer dünnen (1-2 mm) Schicht aus Chloroform getötet. Der Abstand zwischen der Platte und Chloroform sollte etwa 5 cm betragen. Wenn zu viel Chloroform verwendet wird, oder wenn der Abstand zu klein oder groß, riskiert man entweder die Tötung der Zygoten, oder nicht die Tötung der vegetativen Zellen. Die Chloroform-Behandlung muss sofort erfolgen, nachdem die Zygosporen auf die Keimung Platte verteilt worden sind, um die Selektivität zu gewährleisten. </li><li> Die Keimung dauert 16-20 Stunden für die meisten Stämme, sondern wird mit Genotyp und mit dem Alter der Zygoten variieren. Für die Keimung werden die Platten unter schwachem Licht (239 nE / m 2 / sec) platziert oder in Medium Licht durch das Abdecken der Platte mit einem Gewebe abgeblendet. </li><li> Gekeimten Zygoten können unter dem Mikroskop als geschwollen oder manchmal platzen Zellen mit Tochterzellen in ihnen identifiziert werden. Wenn die Zygospore nicht gebrochen hat, wird sanft berührte mit einem Glas Nadel brechen die Wand, wenn die Keimung erfolgt ist. Daughter Zellen werden vorsichtig auf die Rasterpunkte unterhalb der Zygote gezogen. Am einfachsten ist es, diese durch die Erfassung der Zelle in eine kleine Menge flüssigen Medium aus dem Agar durch den Druck des Glases Nadel freigesetzt, und ziehen diese &quot;Pfütze&quot; hinter der Nadel zu tun. Eine Form der &quot;Versicherung&quot;, dass man eine Zygote und nicht um eine vegetative Zelle, die zweimal geteilt hat seziert, ist, dass abgesehen von den vier Tochter-Zellen, die &quot;Haut&quot; der Zygospore Wand bleiben. </li><li> Die seziert Nachkommen sind unter geeigneten Bedingungen gezüchtet, bis sichtbare clonies für die anschließende Analyse ausgewählt werden können. Die Platten sollten täglich auf Verschmutzungen kontrolliert werden. </li></ol> Hinweis: Generation des vegetativen Diploiden wird hier nicht behandelt, aber im Wesentlichen um Ausplattieren der Paarung Mischung auf Medium, das nicht unterstützt wird das Wachstum der beiden elterlichen Stammes, sondern wird das Wachstum des diploiden (zB zwei verschiedene auxotrophen Marker) zu unterstützen. Die Platten werden in das Licht, um die Bildung von Zygoten vermeiden gehalten.

<ol><li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chlamydomonas+Sourcebook%3A+Introduction+to+Chlamydomonas+and+Its+Laboratory+Use%5BTitle%5D)+AND+%22Conf+Proc+IEEE+Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2nd Edition, Academic Press. San Diego, CA. Volume 1 119-273 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Genetische Analyse ist einfach in Chlamydomonas, aber es erfordert spezielle Techniken, um Gameten und separate Tetrade Nachkommen zu erzeugen. Mit gesunder Stämme sind die Techniken leicht erworben. Bei einigen Mutanten, wird es eher eine Kunst, und der Leser sollte Band 1 der kürzlich veröffentlichten Chlamydomonas Sourcebook für historische Anmerkungen und praktische Hinweise beziehen. Darüber hinaus ist anzumerken, dass es viele Variationen über das Grundthema oben beschrieben, von der Methode zur ...

<table><tbody><tr><td>CC-125</td><td>Verpaarungstyp &lt;em&gt;plus&lt;/em&gt;-Stamm</td><td>Chlamydomonas Stock Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CC-124</td><td>Verpaarungstyp &lt;em&gt;minus&lt;/em&gt;-Stamm</td><td>Chlamydomonas Stock Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-Acetat-Phosphat (TAP)</td><td>Wachstumsmedium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N10</td><td>Wachstumsmedium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Difco-Agar</td><td>Reagenz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Edelstahlklingen</td><td>Werkzeuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-916-5B</td><td></td></tr><tr><td>BD Chirurgische Klingenhalter</td><td>Werkzeuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-914-5</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Metallskalpelle</td><td>Werkzeuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-920A</td><td></td></tr></tbody></table>

paarung und tetrad trennung von chlamydomonas reinhardtii für genetische analysen

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Die einzellige Grünalge<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em&gt; (<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;) Hat sich zu einem beliebten Organismus für die Forschung in den verschiedensten Bereichen der Zellbiologie und Genetik wegen seiner einfachen Lebenszyklus, Leichtigkeit des Wachstums und der Manipulation der genetischen Analyse genomischer Ressourcen und Wandelbarkeit des Kerns und beide Organellen. Mating-Stämme ist eine gängige Praxis, wenn genetische Ansätze in werden<em&gt; Chlamydomonass</em&gt;, Um vegetative Diploiden für die Analyse von Dominanz zu erstellen, oder folgende Tetrade Dissektion feststellen nuklearen vs Organellen Erbe, auf Allelietest, um epistasy analysieren, oder die Bevölkerung zum Zwecke der map-basierte Klonen zu erzeugen. Darüber hinaus sind genetische Kreuze routinemäßig verwendet, um Organellen Genotypen mit bestimmten nuklearen Genotypen zu kombinieren. Hier zeigen wir Standard-Methoden zur Gametogenese, Paarung, Zygote Keimung und Tetrade Trennung. Dieses Protokoll besteht aus einem einfach zu folgen Reihe von Schritten, um genetische Ansätze zugänglich Wissenschaftler, die weniger vertraut sind werden<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;. Key-Parameter und Krisenherde sind erläutert. Schließlich werden die Ressourcen für weitere Informationen und alternative Methoden zur Verfügung gestellt.

Paarung und Tetrade Trennung sind für die genetische Analyse benötigt<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em&gt;. Hier zeigen wir Standard-Methoden zur Gametogenese, Paarung, Zygote Keimung und Tetrade Dissektion. Dieses Protokoll besteht aus einem einfach zu folgen Reihe von Schritten, um genetische Ansätze zugänglich Wissenschaftler, die weniger vertraut sind werden<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;.

Paarung und Tetrad Trennung von Chlamydomonas reinhardtii Für genetische Analysen

Die einzellige Grünalge Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) ist zu einem populären Organismus für die Forschung in verschiedenen Bereichen der Zellbiologie und ...

Chlamydomonas ist eine einzellige grüne Alge, die sich unter idealen Wachstumsbedingungen asexuell teilt. Wenn sich die Bedingungen verschlechtern, beginnt der Organismus einen sexuellen Fortpflanzungszyklus. Die Gametogenese kann induziert werden, indem Stämme von TAP-Auger in stickstofffreies Medium überführt werden, und 10 Auger-Zellen werden resuspendiert und unter starkem Licht geschüttelt, um modale MT-plus- und MT-minus-Gameten zu erzeugen, die anschließend in einem einzigen Kolben zur Befruchtung zusammengegeben werden. Proben werden auf einer TAP-Auger-Platte mit Licht aufgebracht und dann zur Reifung der Zygosporen vier Tage lang in Folie eingewickelt.Nach fünf bis sieben Tagen werden die vegetativen Zellen abgeschabt, wodurch die Zygoten freigelegt werden, die fest am Bohrer haften. Diese werden zur Keimung auf TAP-DCO-Platten übertragen. Unter schwachem Licht werden anschließend die Tetraden getrennt und unter geeigneten Bedingungen kultiviert.Bis sichtbare Klone erscheinen, können diese zur anschließenden Analyse ausgewählt werden. Hallo, ich bin David Stern, Präsident des Boy Thompson Institute for Plant Research. Heute zeigen wir Ihnen die Verfahren zur Kreuzung und Tetraden-Dissektion für die Modell-Grünalge Chlamydomonas reinhardtii.Viele Labore verwenden diese Techniken, um vegetative Diploide zur Analyse der Dominanz oder nach der Sporenabtrennung zur Klärung der nukleären gegenüber der Organellvererbung herzustellen. Um alm zu testen, Epistasen zu analysieren oder Populationen für die genbasierte Kartierung zu erzeugen. Zusätzlich werden genetische Kreuzungen routinemäßig eingesetzt, um Genotypen der Organellen mit bestimmten nuklearen Genotypen zu kombinieren.Ich möchte Ihnen meinen Postdoktoranden Jan vorstellen, der Sie durch die Einzelheiten der Verfahren führen wird. Beginnen wir also. Übertragen Sie zur Initiierung des Experiments die MT plus- und MT minus-Stämme auf Tris-Acetat-Phosphat- oder TAP-Platten. Kultivieren Sie die Zellen in einem einen Zentimeter breiten, konzentrierten Streifen.Bei älteren Stämmen kann ein Zwischentransfer erforderlich sein. Sobald sich eine dicke Schicht wachsender Zellen gebildet hat, überführen Sie die Zellen als dicken Belag auf N 10-Platten. Diese Platten sind stickstoffarm.Um die Gametogenese auszulösen, inkubieren Sie die Zellen drei Tage lang. Nach drei Tagen überprüfen Sie, ob die Zellen weiterhin dunkelgrün aussehen, und entsorgen Sie kontaminierte Stämme. Da sie keine lebensfähigen Zygoten bilden werden, sind die verbleibenden Stämme nun bereit, die Gametogenese durchzulaufen. Nachdem die Gametogenese induziert wurde, beginnen Sie die Kreuzung, indem Sie zwei 50-Milliliter-Flaschen vorbereiten, von denen jede 2,5 Milliliter sterilem destilliertem Wasser enthält. Überführen Sie mithilfe einer Drahtschleife jeden Stamm in eine separate Flasche und resuspendieren Sie in dem Wasser.Stellen Sie sicher, dass keine Klumpen vorhanden sind. Schätzen Sie die Zellkonzentration visuell ein. Geben Sie Wasser hinzu, um gleiche Zellkonzentrationen zu erreichen.Als Nächstes schütteln Sie die Zellen zwei Stunden lang unter starkem Licht, damit sich modale Gameten bilden. Überprüfen Sie die Beweglichkeit unter einem Lichtmikroskop. Beachten Sie, dass auch schlecht modale Stämme konjugieren können.In einem weiteren 50-Milliliter-Fläschchen gleiche Volumina der leeren Plus- und Minus-Stämme mischen, um die Paarung zu ermöglichen. Die Kulturen unter starkem Licht belassen, aber sofort die Paarung im Lichtmikroskop überprüfen, ohne sie zunächst zu schütteln.Suchen Sie nach schnell bewegten Gametenpaaren. Diese sind am Geißelansatz verbunden; achten Sie darauf, die Mischung nicht zu stark zu bewegen, um die Paarung zu stören. Nehmen Sie in den nächsten vier Stunden stündlich eine 300-Mikroliter-Probe und geben Sie sie auf eine TAP-Agarplatte.Lassen Sie die ungenutzte Paarungs-Mischung bis zum nächsten Tag im Kolben stehen. Lassen Sie die TAP-Auger-Platten in einer sterilen Haube mit geöffneten Deckeln trocknen, bis keine Flüssigkeit mehr auf der Oberfläche vorhanden ist. Anschließend belassen Sie die Platten 18 Stunden lang im Licht.Wickeln Sie die Platten in Folie ein, da die Sporenreifung von CIGA nur im Dunkeln erfolgt, und lagern Sie die Platten eine Woche lang. Schütteln Sie schließlich den Kolben, der das verbleibende Kopplungsgemisch enthält. Wenn das Medium klar erscheint, sind die Zygoten an der Oberfläche des Kolbens haften geblieben, was auf eine effiziente Paarung hinweist.Wenn die Agitation zu einer Ablösung führt, war die Befruchtung der Zygote ineffizient oder ist in der folgenden Woche fehlgeschlagen, wodurch sich Zago-Sporen auf den Platten bilden und die Tetras zur Dissektion bereitstehen. Nach fünf Tagen haben die miteinander verpaarten Zygote Zago-Sporen gebildet. Daher kann die Tetra-Dissektion mit einem stumpfen Skalpell beginnen.Entfernen Sie die vegetativen Zellen abkratzend, wodurch die Zygoten freigelegt werden, die fest am Bohrer haften. Untersuchen Sie unter dem Mikroskop, um Zygoten von vegetativen Zellen zu unterscheiden. Zygoten sind größer, meist gelb und weisen eine schwarze Umrandung auf.Bereiten Sie als Nächstes Glasnadeln zur Manipulation der Zellen vor. Ziehen Sie drei Millimeter starke Glasstäbchen in einer Alkoholflamme, um einen langen, dünnen Faden zu erzeugen. Brechen Sie den langen Faden ab.Erhitzen Sie kurz die konische Vertiefung des Glasgewindes, um sie zu einem Haken zu verbiegen. Verwenden Sie nun die Glasnadel, um die Zygoten auf der TAP-Schneckenplatte zu einem kleinen Haufen zusammenzusammeln. Formen Sie ein Viereck aus Schnecke, das die Zygoten enthält, und schneiden Sie es mit einem Skalpell aus, bevor Sie die Zygoten übertragen.Um die Tetraden zu dissezieren, markieren Sie die Unterseite einer 1,5 %igen TAP-Agarplatte. Zeichnen Sie eine horizontale Linie 1,5 Zentimeter vom oberen Rand der Platte entfernt ein. Zusätzlich zeichnen Sie ein Gitter mit einem horizontalen Abstand von etwa 1,5 Zentimetern und einem vertikalen Abstand von 0,5 Zentimetern.Danach das Bohrblock-Gesicht nach unten auf die obere horizontale Linie legen, die auf der 1,5 %igen TAP-Bohrplatte eingezeichnet ist. Den Bohrblock entlang der oberen horizontalen Linie verschieben, um die Zygoten zu verteilen. Schließlich einzelne Zygoten zu den Schnittpunkten der oberen horizontalen Linien mit jeder vertikalen Linie bewegen, wobei etwa 20 bis 30 Zygoten pro Platte verbleiben.Verteilen Sie die Zygoten unmittelbar nach der Verteilung für 30 Sekunden über eine Glaswanne, die eine dünne Schicht Chloroform enthält. Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen der Platte und dem Chloroform fünf Zentimeter beträgt, und verwenden Sie nicht zu viel Chloroform.Diese Behandlung tötet alle vegetativen Zellen ab, die versehentlich übertragen wurden. Stellen Sie die Platten 16 Stunden lang unter schwachem Licht, um die Keimung zu ermöglichen. Der nächste Schritt wird die Tetraden-Dissektion sein.Nun, da die Zellen die Inkubation abgeschlossen haben, suchen Sie nach gekeimten Zygosporen. Dabei handelt es sich um aufgequollene Zellen, die teilweise geplatzt sind und Tochterzellen enthalten. Falls eine Keimung stattgefunden hat, der Zygospore aber noch nicht aufgebrochen ist, berühren Sie sie vorsichtig mit einer Glasnadel, um die Zellwand zu durchbrechen.Beginnen Sie nun mit der Trennung der Tetraden. Drücken Sie den Bohrer neben die Tochterzellen mit der Glasnadel. Die Tochterzellen werden in der freigesetzten Flüssigkeit eingefangen.Ziehen Sie die Tochterzellen in der Flüssigkeitstropfen hinter der Nadel zu den Gitterpunkten unterhalb des Zygots. Nachdem das Tetra getrennt ist, suchen Sie nach einer übrig gebliebenen Hülle. Nach dem Entfernen der Tochterzellen überprüfen Sie, ob ein Zygote und keine vegetative Zelle, die sich zweimal geteilt hat, disseziert wurde. Kultivieren Sie die dissezierten Nachkommen, bis sichtbare Kolonien vorhanden sind, die für die anschließende Analyse isoliert werden können.Überprüfen Sie die Platten täglich auf Kontaminationen. Wenn das Protokoll korrekt durchgeführt wird, entwickeln sich die vier dissezierten Nachkommen aus jeder Zygote zu sichtbaren Klonen. Zwei der Nachkommen sind leer plus und zwei sind leer, minus; alle Nachkommen erben das Chloroplasten-DNA des MT-plus-Elternteils.Wir haben Ihnen soeben Standardmethoden für Gametogenese, Paarung, Keimung von Zygosporen und die Dissektion von Myzelsträngen bei Clam-DMS gezeigt. Bei Anwendung dieser Techniken ist es wichtig sicherzustellen, dass die Zellen gesund sind und keinerlei Infektionen aufweisen. Bekanntermaßen paaren sich im Labor angepasste Stämme, die über längere Zeiträume nicht gekreuzt wurden, möglicherweise schlecht, und auch die Wasserqualität kann die Effizienz der Mutagenese beeinflussen.Wenn Sie auf diese und die oben genannten technischen Details achten, sollten Sie große Erfolge mit Ihrer Genetik der kletternden Dämonen erzielen. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

mating-tetrad-separation-chlamydomonas-reinhardtii-for-genetic

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben eine Methode zur Genanalyse in Chlamydia auf chemische Mutagenese und Sequenzierung des gesamten Genoms basiert durchzuführen. Außerdem wird ein System zum Austausch DNA in infizierten Zellen beschrieben, die für die genetische Kartierung verwendet werden. Diese Methode ist breit anwendbar zu mikrobiellen Systemen fehlt Transformation Systeme und molekulargenetische Werkzeuge.

Vorwärts Genetische Ansätze in<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Die beschriebenen Vergleichs, quantitative Proteomik-Ansatz zielt auf die Erlangung Einblicke in die Zusammensetzung von Multiproteinkomplexen unter verschiedenen Bedingungen und wird durch den Vergleich genetisch verschiedenen Stämmen nachgewiesen. Für die quantitative Analyse gleichen Volumina verschiedener Fraktionen aus einem Saccharose-Dichtegradienten durch Massenspektrometrie vermischt und analysiert.

Ein neuer Ansatz für die vergleichende Analyse von Multiproteinkomplexen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung und quantitative Massenspektrometrie

Barcode Aktiviert Sequenzierung Tetrads (BEST) ersetzt die manuellen Prozesse zu isolieren, zu stören und Abstand Tetraden. BESTE isoliert Tetraden durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung auf Agarplatten, trennt die Sporen durch Schütteln mit Glasperlen, und bestimmt, welche zufällig angeordnet Kolonien wurden aus der gleichen ursprünglichen Tetrade mit Molekular Barcodes abgeleitet.

BEST: Barcode Aktiviert Sequenzierung Tetrads

Temperaturempfindliche (ts) letale Mutanten sind wertvolle Werkzeuge, um wesentliche Funktionen zu identifizieren und zu analysieren. Hier beschreiben wir Methoden zur Generierung und Klassifizierung von ts letalen Mutanten im Hochdurchsatz.

Hochdurchsatz-robotically Assisted Isolation von temperaturempfindlichen Lethal Mutants in<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Wir beschreiben die Chromatin-endogene Spaltung, gekoppelt mit der Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChEC-seq), einer Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) -orthogonalen Methode zur Kartierung von Proteinbindungsstellen genomweit mit Mikrokokken-Nuklease (MNase) -Fusionsproteinen.

Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Zebrafisch wurden als zuverlässige genetische Modellorganismen in der biomedizinischen Forschung, vor allem mit dem Aufkommen von Gen-Bearbeitung Technologien verwendet. Wenn Larven Phänotypen zu erwarten sind, kann DNA-Extraktion und Genotyp Identifizierung schwierig sein. Hier beschreiben wir eine effiziente Genotypisierung Verfahren für zebrafischlarven durch Rute zuschneiden, so früh wie 72 h nach Befruchtung.

Hochdurchsatz-DNA-Extraktion und Genotypisierung von 3dpf Zebrafischlarven durch Fin Clipping

Wir haben eine Strategie, um zu reinigen und Bild eine große Anzahl von Centriolen in verschiedenen Ausrichtungen für Höchstauflösung Mikroskopie und Single-Teilchen im Durchschnitt entwickelt.

Isolation und Fluoreszenz-Imaging für Single-Particle-Rekonstruktion der Chlamydomonas Centriolen

Die systemweite Analyse mehrerer Biomoleküle ist entscheidend, um funktionelle und mechanistische Einblicke in biologische Prozesse zu gewinnen. Dabei wird ein umfangreiches Protokoll zur Hochdurchsatzextraktion von Lipiden, Metaboliten, Proteinen und Stärke aus einer einzigen Probe beschrieben, die aus synchronisierter Chlamydomonas-Kultur geerntet wird.

Eine Multi-Omics Extraktionsmethode für die In-Depth-Analyse synchronisierter Kulturen der Grünen Alga Chlamydomonas reinhardtii

Die In-vitro-Reaktivierung beweglicher Zellen ist ein entscheidendes Experiment zum Verständnis der Mechanismen der Zellmotilität. Das Protokoll beschreibt die Reaktivierung der demembranierten Zellmodelle von Chlamydomonas reinhardtii, einem Modellorganismus zur Untersuchung von Zilien / Flagellen.

Reaktivierung demembranierter Zellmodelle in Chlamydomonas reinhardtii

Die meisten schwimmenden photoautotrophen Organismen zeigen photoinduzierte Verhaltensänderungen (Photobehavior). Das vorliegende Protokoll beobachtet das besagte Photoverhalten im Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii.

Beobachtung des Photoverhaltens bei Chlamydomonas reinhardtii

Lernen Sie die Paarung und Tetradentrennung von Chlamydomonas reinhardtii für genetische Analysen. Diese Methoden ermöglichen Gametogenese, Zygotenkeimung und genetische Untersuchungen.

Paarung und Tetrad Trennung von Chlamydomonas reinhardtii Für genetische Analysen

Weitere Videos entdecken