Paarung und Tetrad Trennung von Chlamydomonas reinhardtii Für genetische Analysen

Chlamydomonas ist eine einzellige Grünalge, die sich unter idealen Wachstumsbedingungen ungeschlechtlich teilt. Wenn sich die Bedingungen verschlechtern, tritt der Organismus in einen sexuellen Fortpflanzungszyklus ein. Die Gametogenese kann durch Übertragung von Stämmen von der TAP-Schnecke auf die stickstoffarme Schnecke induziert werden, und 10 Schneckenzellen werden resuspendiert und unter starkem Licht gerührt, um modales MT plus und MT minus gat zu erzeugen, die dann in einem einzigen Kolben für die Paarung kombiniert werden. Proben werden auf einer TAP-Schneckenplatte und Licht gefleckt und dann in Folie eingewickelt für die Zigas-Four-Reifung.

Nach fünf bis sieben Tagen werden vegetative Zellen abgekratzt, wodurch die Zygoten freigelegt werden, die fest an der Schnecke kleben. Diese werden zur Keimung auf TAP DCO-Platten übertragen. Bei schwachem Licht werden dann die Tetraden abgetrennt und unter entsprechenden Bedingungen gezüchtet.

Bis sichtbare Klone erscheinen, können diese für die nachfolgende Analyse ausgewählt werden. Hallo, ich bin David Stern, Präsident des Boy Thompson Institute for Plant Research. Heute zeigen wir Ihnen die Verfahren zur Paarung und Tetra-Dissektion für das Modell Grünalgenmuschel MOUs REINE herzhaftes Auge.

Viele Laboratorien verwenden diese Techniken, um vegetative Diploide für die Analyse der Dominanz zu erzeugen oder um nach der Profildissektion die Vererbung von Kern- und Organellen festzustellen. Um ALM zu testen, Epistase zu analysieren oder Populationen zum Zwecke des kartenbasierten Klonens zu generieren. Darüber hinaus werden genetische Kreuzungen routinemäßig verwendet, um Organellen-Genotypen mit bestimmten Kerngenotypen zu kombinieren.

Ich möchte Ihnen meinen Postdoktoranden Jan vorstellen, der Sie durch die Details der Verfahren führen wird. Also lasst uns loslegen. Um das Experiment zu starten, übertragen Sie die MT plus- und MT minus-Stämme auf Trisacetatphosphat- oder TAP-Platten. Züchten Sie die Zellen in einem ein Zentimeter breiten konzentrierten Streifen.

Bei älteren Stängeln kann eine Zwischenübertragung notwendig sein. Sobald eine dicke Schicht wachsender Zellen erscheint, übertragen Sie die Zellen als dicke Platte auf N 10 Platten. Diese Platten weisen einen Stickstoffmangel auf.

Um die Gametogenese zu induzieren, inkubieren Sie die Zellen drei Tage lang. Überprüfen Sie nach drei Tagen, ob die Zellen immer noch dunkelgrün erscheinen, und entsorgen Sie alle kontaminierten Stämme. Da sie keine lebensfähigen Zygoten produzieren, sind die verbleibenden Stämme nun bereit für die Gametogenese.

Nachdem die Gametogenese eingeleitet wurde, beginnen Sie die Paarung, indem Sie zwei 50-Milliliter-Flaschen vorbereiten. Jeweils mit 2,5 Millilitern sterilem destilliertem Wasser. Übertragen Sie jeden Stamm mit einer Drahtschlaufe in einen separaten Kolben und schleifen Sie ihn im Wasser nach.

Stellen Sie sicher, dass keine Klumpen vorhanden sind. Messen Sie die Zellkonzentration mit dem Auge. Fügen Sie Wasser hinzu, um gleiche Zellkonzentrationen zu erreichen.

Rühren Sie die Zellen anschließend zwei Stunden lang unter starkem Licht, damit sich modale Gameten bilden. Überprüfen Sie die Beweglichkeit unter einem Lichtmikroskop. Denke daran, dass sich selbst schlecht modale Stämme paaren.

In einem weiteren 50-Milliliter-Kolben. Kombinieren Sie gleiche Volumina leerer Plus- und leerer Minusstämme, um eine Paarung zu ermöglichen. Lassen Sie die Gats unter starkem Licht, aber nicht sofort rühren, überprüfen Sie die Paarung unter dem Lichtmikroskop.

Suchen Sie nach sich schnell bewegenden Gamut-Paaren. An den Geißeln zusammengefügt, wobei darauf zu achten ist, dass die Mischung nicht aufgewirbelt und die Paarung gestört wird. Entnehmen Sie in den nächsten vier Stunden stündlich eine Probe von 300 Mikrolitern und legen Sie sie auf eine TAP-Schneckenplatte.

Lassen Sie die unbenutzte Gegenmischung bis zum nächsten Tag im Kolben. Lassen Sie die TAP Schneckenplatten in einer sterilen Haube mit den Deckeln Aja trocknen, bis keine Oberflächenflüssigkeit mehr zurückbleibt. Lassen Sie die Teller dann 18 Stunden im Licht.

Wickeln Sie die Platten in Folie ein, da die Reifung der CIGA-Sporen nur im Dunkeln stattfindet und lagern Sie die Platten eine Woche lang. Zum Schluss wird der Kolben mit der restlichen Gegenmischung umgerührt. Wenn das Medium klar erscheint, blieben die Zygoten an der Oberfläche des Kolbens haften, was auf eine effiziente Paarung hinweist.

Wenn sich die Bewegung löst, die Paarung der Zygoten ineffizient war oder in der folgenden Woche fehlgeschlagen ist, bilden sich die Zago-Sporen auf den Platten und die Salmler sind bereit für die Sektion. Nach fünf Tagen haben die verpaarten Zygoten Zago-Sporen gebildet. Die Tetra-Dissektion kann also mit einem stumpfen Skalpell beginnen.

Kratzen Sie die vegetativen Zellen ab und legen Sie die Zygoten frei, die fest an der Schnecke haften. Schauen Sie unter das Mikroskop, um Zygoten von vegetativen Zellen zu unterscheiden. Zygoten sind größer, normalerweise gelb, und haben einen schwarzen Umriss.

Bereiten Sie als Nächstes Glasnadeln für die Manipulation der Zellen vor. Ziehen Sie drei Millimeter lange Glasstäbe an einer Alkoholflamme, um einen langen, dünnen Faden zu erzeugen. Den langen Faden abbrechen.

Die konische Delle des Glasfadens kurz erhitzen, um sie zu einem Haken zu biegen. Sammeln Sie nun mit der Glasnadel die Zygoten zu einem kleinen Haufen auf der TAP-Schneckenplatte. Bilden Sie ein Schneckenquadrat mit den Zygoten und schneiden Sie es mit einem Skalpell heraus, bevor Sie die Zygoten übertragen.

Zum Präparieren der Tetraden den Boden einer 1,5%TAP Schneckenplatte markieren. Zeichne eine horizontale Linie 1,5 Zentimeter von der Oberseite der Platte entfernt. Zeichnen Sie zusätzlich ein Raster mit einem horizontalen Abstand von ca. 1,5 Zentimetern und einem vertikalen Abstand von 0,5 Zentimetern.

Legen Sie dann den Schneckenblock mit der bedruckten Seite nach unten auf die obere horizontale Linie, die auf der 1,5 %TAP-Schneckenplatte gezeichnet ist. Schieben Sie den Schneckenblock entlang der oberen horizontalen Linie, um die Zygoten zu verteilen. Verschieben Sie schließlich einzelne Zygoten zu den Schnittpunkten der oberen horizontalen Linien, wobei jede vertikale Linie mit etwa 20 bis 30 Zygoten pro Platte endet.

Unmittelbar nach dem Verteilen der Zygoten die Platten für 30 Sekunden über eine Glasschale mit einer dünnen Schicht Chloroform drehen. Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen der Platte und dem Chloroform fünf Zentimeter beträgt. Und verwenden Sie nicht zu viel Chloroform.

Diese Behandlung tötet alle vegetativen Zellen ab, die versehentlich übertragen wurden. Stelle die Platten 16 Stunden lang unter schwaches Licht, damit die Keimung stattfinden kann. Der nächste Schritt wird die Tetradendissektion sein.

Jetzt, da die Zellen mit der Inkubation fertig sind, suchen Sie nach gekeimten Zygoten. Dabei handelt es sich um geschwollene Zellen, die manchmal mit Tochterzellen in sich geplatzt sind. Wenn die Keimung stattgefunden hat, aber die Zago-Spore nicht geplatzt ist, berühre sie vorsichtig mit einer Glasnadel, um die Wand zu durchbrechen.

Beginnen Sie nun, die Tetraden zu trennen. Drücken Sie mit der Glasnadel die Schnecke neben die Tochterzellen. Die Tochterzellen werden in der freigesetzten Flüssigkeit eingefangen.

Ziehen Sie die Tochterzellen in der Pfütze hinter der Nadel zu den Rasterpunkten unterhalb der Zygote. Jetzt, da der Salmler abgetrennt ist, suchen Sie nach einer übrig gebliebenen Schale. Nachdem Sie die Tochterzellen entfernt haben, um sicherzustellen, dass eine Zygote und keine vegetative Zelle seziert wurde, die sich zweimal geteilt hat, züchten Sie die präparierten Nachkommen, bis sichtbare Kolonien für die nachfolgende Analyse entnommen werden können.

Überwachen Sie die Platten täglich auf Kontamination. Wenn das Protokoll korrekt durchgeführt wird, wachsen die vier sezierten Nachkommen jeder Zygote zu sichtbaren Klonen heran. Zwei der Nachkommen sind leer plus und zwei sind leer, minus alle Nachkommen erben den Chloroplasten, die DNA des MT plus Elternteils.

Wir haben Dir gerade Standardmethoden für die Paarung von Gametogenese, die Keimung und die Profildissektion für Muschel-DMS gezeigt. Bei der Anwendung dieser Techniken ist es wichtig sicherzustellen, dass die Zellen gesund und ohne Infektionen sind. Es ist allgemein bekannt, dass sich laborangepasste Stämme, die über längere Zeiträume nicht gekreuzt wurden, nicht gut paaren können und die Wasserqualität auch die Mutagenese beeinträchtigen kann.

Indem Du auf diese Details und andere oben erwähnte technische Details achtest, solltest Du viel Erfolg mit Deiner Kletterdämonen-Genetik haben. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.