Batch Immunfärbung für Large-Scale Protein-Nachweis im Whole Affenhirn

Dieses Verfahren beginnt nach Erhalt eines 4%PFA-perfundierten, externalisierten und kryogeschützten Gehirns, das zur Einbettung unter Verwendung von Ausrichtungsmarkierungen, die in die umgebende Matrix eingebettet sind, an Neuroscience Associates gesendet wurde. Das Gehirn kann in der koronalen Ebene geschnitten werden, um serielle Schnitte in einer gewünschten Dicke zu erzeugen, die die gesamte vordere posteriore Ausdehnung des Gehirns mit speziellen Körben und Behältern darstellen. Die Batch-Immunprozessierung kann durchgeführt werden, um das räumliche Expressionsmuster eines Proteins im gesamten Gehirn zu bestimmen.

Hallo, ich bin Dr. Shaheen Zur vom Visual Neurosciences Laboratory an der School of Optometry an der Universität Montreal. Hallo, ich bin Dr. Mark Burke, ebenfalls vom Visual Neurosciences Laboratory an der School of Optometry an der Universität Montreal. Hallo, ich bin Dr.Mo Petto, Direktor des Visual Neuroscience Laboratory an der School of Optometry der Universität Montreal.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Batch-Immunfärbung für den großflächigen Proteinnachweis in einem ganzen Affengehirn. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Expressionsmuster von Zielproteinen im gesamten Gehirn zu untersuchen und die Expression dieser Proteine innerhalb desselben Gehirns zu vergleichen und gegenüberzustellen. Also lasst uns loslegen.

Vor der histologischen Verarbeitung wird ein Primatengehirn erhalten, das durch systemische Perfusion und Postfixation konserviert und mit abgestuften Saccharoselösungen kryogeschützt wurde. In diesem Stadium wird das Gehirn an neurowissenschaftliche Mitarbeiter geschickt, um mit ihrer proprietären Technologie eingebettet und frei geschnitten zu werden. Bei der Rückkehr wird man feststellen, dass sieben Ausrichtungspunkte in der Einbettungsmatrix platziert sind, so dass die Schnitte richtig ausgerichtet und nach Abschluss der histologischen Verarbeitung neu ausgerichtet werden können.

Während der Schnitterstellung werden digitale Bilder aufgenommen, die später für die 3D-Rekonstruktion von anatomischen Karten verwendet werden können. Neurowissenschaftler assoziiert unser Gewebe so, dass es serielle, 50 Mikrometer dicke, frei schwebende koronale Schnitte über das gesamte Gehirn liefert. Sobald dies abgeschlossen ist, können wir mit der histologischen Bearbeitung der Schnitte beginnen.

Wenn wir mit der histologischen Verarbeitung beginnen, haben wir in der Regel etwa 140 Schnitte pro Antikörper oder Färbung zu bearbeiten. Hier werden wir die Technik mit einer kleineren Stichprobe von Schnitten demonstrieren, die mit dem Antikörper SMI 32 behandelt wurden, einem monoklonalen Antikörper gegen nicht phosphorylierte Neurofilamentproteine. Während des gesamten Verfahrens werden spezielle Färbeschalen und -körbe verwendet, so dass eine große Anzahl von frei schwebenden Abschnitten gleichzeitig und effizient bearbeitet werden kann.

Dadurch wird sichergestellt, dass der resultierende Fleck über alle Abschnitte hinweg gleichmäßig ist. Der erste Schritt besteht darin, die Schnitte in einer PBS-basierten Lösung, die TRITTON X 100 und normales Pferdeserum enthält, 60 Minuten lang zu inkubieren. Dadurch wird die unspezifische Bindung von Antikörpermolekülen reduziert, die zu einer Hintergrundfärbung führt.

Anschließend werden die Sektionen über Nacht inkubiert. In einer PBS-basierten SMI 32-Antikörperlösung, die am nächsten Tag mit Tritton X 100 und normalem Pferdeserum ergänzt wurde, werden die Schnitte drei Mal lang 10 Minuten lang in Waschlösung gewaschen und dann zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. In einer PBS-basierten biotinylierten Muse-Sekundärantikörperlösung, die Triton X 100 und normales Pferdeserum enthält.

Nach einem Satz von drei weiteren 10-minütigen Wäschen werden die Abschnitte eine Stunde lang bei Raumtemperatur in eine Lösung des Avadon-Biotin-konjugierten Meerrettichperoxidase-Komplexes gelegt. Nach einer weiteren Reihe von Waschungen werden die Abschnitte schließlich 10 Minuten lang einer D-Aminobenzin-Reaktion unterzogen, die einen braunen Fleck in den immunreaktiven Neuronen erzeugt. Die Reaktion wird dann gestoppt, indem der Färbekorb entfernt und die Schnitte in PBS getaucht werden.

Nach zwei bis drei bis drei Spülgängen sind die PBS-Sektionen bereit, die einzeln auf Glasobjektträger montiert werden können, um den Montageprozess mit einer großen Petrischale und sehr weichen Pinseln zu beginnen. Die Abschnitte werden aus dem PBS-Pufferbehälter entnommen und einzeln auf gelatinebeschichtete Objektträger montiert. Die Proben werden dann am nächsten Tag über Nacht in einem Abzug an der Luft trocknen gelassen.

Die Abschnitte werden gespült, indem sie in deionisiertes Wasser getaucht werden, um eventuelle Salzkristalle abzuwaschen, die beim Einbetten übrig geblieben sind. Die Objektträger werden dann in abgestuften Ethanolstufen dehydriert, in Xylol gereinigt und mit Einbettmedium abgedeckt. Zu diesem Zeitpunkt sollten Dias etwa eine Woche bis 10 Tage in horizontaler Position gelagert werden, damit das Montagemedium aushärten kann.

Danach können die Objektträger in einer Objektträgerbox aufbewahrt oder einer Bildgebung mittels Mikroskopie unterzogen werden. Diese Methode erzeugt ein vollständiges Expressionsprofil eines Zielproteins von Interesse über ein gesamtes Affengehirn. Hier zeigen wir repräsentative koronale Schnitte, die eine Momentaufnahme der Expression von FMRP, new n und SMI 32 liefern.

Im selben Affengehirn. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die Batch-Immunfärbung für ein Zielprotein von Interesse im gesamten Gehirn durchführen können. Bei diesem Verfahren ist darauf zu achten, dass alle Teile während der Inkubation in verschiedenen Lösungen leicht gerührt werden und dass sie immer vollständig eingetaucht bleiben.

Nehmen Sie sich außerdem Zeit bei der Glasmontage der Dissektionen und entfernen Sie so viele Falten und Falten wie möglich, ohne die Integrität des Gewebes zu beeinträchtigen. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.