Name: Batch Immunfärbung für Large-Scale Protein-Nachweis im Whole Affenhirn (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Erfahren Sie Batch-Immunfärbung für großflächigen Proteinnachweis im gesamten Affengehirn. Diese Methode ermöglicht die Analyse räumlicher Expressionsmuster und verbessert die Effizienz der Immunodetektion in der Neurowissenschaft.

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Wir bedanken uns bei Frank Ervin, Roberta Palmour und das Personal des Behavioural Sciences Foundation Laboratories in St Kitts, West Indies, für ihre anhaltende Unterstützung unserer Primaten Arbeit befindet. Betriebskostenzuschüsse von der Canadian Institutes of Health Research (AC) und der National Engineering and Research Council of Canada (MP) - Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium Fragile X Research Foundation of Canada (FXRFC) auf SZ und unterstützt.

Immunohistochemisty ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken zur Charakterisierung von Protein-Expression im Gehirn von verschiedenen experimentellen Tiermodellen. Es ist relativ leicht zu systematischen immunhistochemischen Verfahren auf die Gehirne der Nagetiere und andere gemeinsame experimentelle Modelle mit ähnlicher Größe des Gehirns führen. Allerdings gibt es keine veröffentlichten Arbeit, unser Wissen, dass eine umfassende Darstellung, wie die zur Durchführung dieser Immundetektion Verfahren im gesamten Affenhirn bietet. Was folgt, ist eine detaillierte Beschreibung, wie eine ganze Affenhirn für großflächige immunhistochemischen Nachweis von verschiedenen Zielproteine ​​vorzubereiten. Diese Arbeit wurde als Ergebnis der Zusammenarbeit zwischen kommerziellen und akademischen Bemühungen entstanden. Als solche Einzelheiten im Zusammenhang mit Gewebe Einbettung und Schneiden ein proprietäres Wissen NSA bleiben. Teil 1: Animal Behandlung und Gewebe Vorbereitung Das Gehirn eines Erwachsenen grünen Meerkatze (Cercopithecus aethiops) ist für das vorliegende Protokoll verwendet. Alle Verfahren sind in Übereinstimmung mit den Canadian Council on Animal Care (CCAC) Richtlinien für die Nutzung und Pflege von Tieren in der biomedizinischen Forschung 1 durchgeführt. <ol><li> Tiere ist tief mit Ketaminhydrochlorid (10 mg / kg, im), mit einer Überdosis Natrium-Pentobarbital (25 mg / kg, iv) und perfundierten transkardial mit 0,1 M PBS, bis sie vollständig ausgeblutet eingeschläfert sediert. </li><li> Dies wird durch eine 4% Paraformaldehyd-Lösung in PBS für 5 min (~ 1 Liter) folgten. </li><li> Die ausgelagerten Gehirn ist in abgestuften PBS-gepufferte Saccharose-Lösungen (10, 20 und 30%, in der Reihenfolge) mit 0,02% Natriumazid gelegt und bei 4 ˚ C, bis das Gehirn sinkt auf den Boden des Behälters. Die Lösung ersetzt wird alle paar Tage, bis Gehirn durchläuft Gefrier-Schnitte. </li><li> Zu ihren proprietären MultiBrain unterzogen werden ™ Einbettung und Frost-Schneiden-Technologie; Das Gehirn ist in den Neurowissenschaften Associates (Knoxville, TN NSA) gesendet. </li><li> Sieben (7) Ausrichtung Sehenswürdigkeiten sind in der Einbettungsmatrix platziert, so dass Abschnitte werden korrekt ausgerichtet (dh links-rechts-Orientierung) und neu ausgerichtet nach histologischen Verarbeitung abgeschlossen ist. </li><li> Der gefrorene Block wird digital auf den Block Gesicht fotografiert vor jedem seriellen Abschnitt aus dem Block gesammelt wird. Digitale Bilder sowie Teile von diesem Gehirn kann später zur 3D-Rekonstruktion der anatomischen und histologischen Karten verwendet werden, bzw.. </li><li> Serielle frei schwebenden koronalen Abschnitte, bei einer Dicke von 50 um pro Abschnitt werden aus dem gesamten Gehirn gesammelt. </li></ol> Teil 2: Histologische Bearbeitung Die Schnitte werden in einem bestimmten räumlichen Abstand gewählt (zB 500-um) und für unsere experimentelle Zwecke wurden mit den folgenden Antikörpern verarbeitet: fragile-X mentale Retardierung Protein (FMRP; Chemicon; Temecula, CA), SMI32 (Sternberger Monoklonale Antikörper Inc.; Baltimore, MD) und NeuN (Chemicon; Temecula, CA). FMRP ist ein zytoplasmatische Protein, das reichlich in den Nervenzellen von normalen und Permutation Träger Gehirne 2 gefunden. NeuN (Neuronal Nuclei) erkennt spezifisch die DNA-bindende Neuronen-spezifische Protein NeuN die in den meisten Neuronen ist und in neuronalen Kerne, Perikarya und einige proximalen neuronale Prozesse 3 verteilt. SMI-32 ist ein monoklonaler Antikörper, der die nicht-phosphorylierten Epitop auf Neurofilament Proteinen 4 erkennt. <ol><li> Im Abstand von 500 um, sind etwa 140 Teile pro Antikörper verwendet. </li><li> Alle Inkubationen, Waschungen und Färbungen Schritte werden mit leichtem Rühren mit spezialisierten Färbung Schüsseln und Körbe (; Knoxville, TN HistoTools) durchgeführt. </li><li> Die Schnitte werden zunächst in einer Lösung mit 0,1 M PBS/0.3% Triton X-100 (TX) / 5% normal heiser Serum (NHS) für 60 min, um unspezifische Bindung von Antikörper-Moleküle und die daraus resultierenden Hintergrundfärbung zu reduzieren inkubiert. </li><li> Abschnitte für FMRP Immunfärbung markiert durchlaufen einen zusätzlichen Schritt der Antigen Wiederherstellung mithilfe Antigen Demaskierung Solution (Vector Labs, Burlingame, CA) nach Anweisungen des Herstellers. </li><li> Abschnitte werden dann über Nacht inkubiert und an unterschiedlichen Tagen in den jeweiligen Antikörper-Lösungen, die 0,1 M PBS/0.3% TX / 3% NHS (mit einem Verdünnungsfaktor von 1 / 5, 000 für FMRP und SMI-32 und 1 / 2, 000 für NeuN Antikörper. </li><li> 1 /; Am nächsten Tag sind die Abschnitte für die drei 10-min Perioden in Waschlösung (0,1 M PBS/0.3% TX) durch Inkubation für 2 h bei Raumtemperatur in biotinylierten Anti-Maus-sekundären Antikörper in Pferd angehoben (Vector Labs gewaschen, gefolgt 1000 Verdünnung in 0,1 M PBS/0.3% TX / 3% NHS). </li><li> Nach einem weiteren Satz von 3 10-min wäscht, sind die Abschnitte in einer Lösung aus Avidin-Biotin-konjugierte Meerrettichperoxidase-Komplex (Vector Labs) für 1 h bei Raumtemperatur gegeben. </li><li> Endlich, nach einem anderen Satz von wäscht, sind die Abschnitte für 10 min auf eine Nickel verbesserte dia unterzogenminobenzidine (Ni-DAB) Reaktion, die ein dunkelblaues innerhalb immunreaktiven Neuronen Fleck produziert. </li><li> Nach Abschluss der histologischen Verfahren, sind Abschnitte auf Gelatine-beschichteten Glasträger montiert. </li><li> Alle Abschnitte sind über Nacht luftgetrocknet und mit einem Deckglas nach Standardverfahren. </li></ol> Teil 3: Repräsentative Ergebnisse: Diese Methode produziert eine komplette Expressionsprofil eines Zielproteins von Interesse im gesamten Affenhirn. Hier zeigen wir repräsentative koronalen Abschnitte, die eine Momentaufnahme der FMRP, NeuN und SMI32 Ausdruck in der gleichen Affenhirn bieten. <img src="/files/ftp_upload/1286/1286fig1.png" alt="" /> Abbildung 1: Die Färbung Schale (A) und Korb (B) für eine groß angelegte Batch-Verarbeitung der im Streubesitz befindlichen Abschnitte für Immundetektion verwendet. <img src="/files/ftp_upload/1286/1286fig2.png" alt="" /> Abbildung 2: Repräsentative koronalen Abschnitte aus einer grünen Meerkatze Gehirn für FMRP (A), NeuN (B) und SMI32 (C) Antikörper gefärbt.

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+to+the+Care+and+Use+of+Experimental+Animals%22">Guide to the Care and Use of Experimental Animals</a>. Olfert, E. D., Cross, B. M., McWilliam, A. A. , Canadian Council on Animal Care. Ottawa. (1993).</li>
<li>Devys, D., Lutz, Y., Rouyer, N., Bellocq, J. P., Mandel, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FMR-1+protein+is+cytoplasmic%2C+most+abundant+in+neurons+and+appears+normal+in+carriers+of+a+fragile+X+premutation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X premutation.</a> Nat Genet. 4, 335-340 (1993).</li>
<li>Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuN%2C+a+neuronal+specific+nuclear+protein+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates.</a> Development. 116, 201-211 (1992).</li>
<li>Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+distinguish+phosphorylated+and+nonphosphorylated+forms+of+neurofilaments+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80, 6126-6130 (1983).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Offenlegungen vorzunehmen.

Es gibt zwei kritische Schritte in diesem Verfahren, dass groß angelegte Nachweis von Proteinen in einer ganzen Affenhirn möglich zu machen. Eine davon ist die Einbettung und Schneiden-Protokoll, das die proprietäre Wissen NSA bleibt. Die andere ist die Verwendung der Färbung Schüsseln und Körbe von HistoTools zur Verfügung gestellt. Letzteres ermöglicht eine einfache und schnelle Handhabung von vielen (~ 40) Abschnitte zu einem bestimmten Zeitpunkt. Es bietet auch die Mittel für die gleichmäßige Behandlung aller Abschn...

<table><tbody><tr><td>anti-FMRP monoklonaler Antikörper</td><td>Chemicon International</td><td>MAB2160</td><td>Erfordert die Antigenfreilegung in fixiertem Gewebe.</td></tr><tr><td>anti-NeuN monoklonaler Antikörper</td><td>Chemicon International</td><td>MAB377</td><td>k.A.</td></tr><tr><td>anti-Neurofilament H monoklonaler Antikörper</td><td>Sternberger Monoclonals Inc.</td><td>SMI32</td><td>k.A.</td></tr><tr><td>Lösung zur Antigenfreilegung</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3300</td><td>k.A.</td></tr><tr><td>Normales Pferdeserum</td><td>Invitrogen</td><td>16050122</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Biotinylierter Anti-Maus-IgG (H+L), hergestellt in Pferd</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-2000</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC-Kit (Standard)</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4000</td><td>1,5 mg</td></tr><tr><td>Färbeschale für schwimmende Schnitte</td><td>HistoTools</td><td>10009</td><td>12 x 65 mm</td></tr><tr><td>Transportkorb für Färbeschalen</td><td>HistoTools</td><td>10012</td><td>groß&lt;br/&gt;(passt für 12 x 65 mm Schale)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>P8514B</td><td>k.A.</td></tr><tr><td>DAB</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC11209-0050</td><td>k.A.</td></tr></tbody></table>

batch immunfärbung für large-scale protein-nachweis im whole affenhirn

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunhistochemie (IHC) ist eine der am häufigsten verwendeten Labor-Techniken für die Detektion von Target-Proteinen<em&gt; In situ</em&gt;. Fragen über die Expressionsmuster eines Zielproteins über das gesamte Gehirn sind relativ leicht zu beantworten, wenn Sie IHC in kleinen Gehirne, wie die von Nagetieren. Doch die gleichen Fragen in großen und gewundenen Gehirne, wie die der Primaten stellt eine Reihe von Herausforderungen. Hier präsentieren wir einen systematischen Ansatz für die Immundetektion der Zielproteine ​​in einer erwachsenen Affen Gehirn. Dieser Ansatz stützt sich auf das Gewebe eingebettet und Schnitte Methodik der NeuroScience Associates (NSA) sowie Tools, die speziell für die Batch-Färbung der im Streubesitz befindlichen Abschnitten entwickelt. Es führt zu einer gleichmäßigen Färbung von einer Reihe von Abschnitten, die in einem bestimmten Intervall, stellt das gesamte Gehirn. Die daraus resultierenden gefärbten Schnitten kann auf eine Vielzahl von analytischen Verfahren unterzogen werden, um Protein-Spiegel, die Bevölkerung von Neuronen, die ein bestimmtes Protein zu messen.

Großflächige Immundetektion der Zielproteine ​​in der gesamten Primatengehirn wird durch den Einsatz von neuartigen Gewebe Einbettung und Schneiden Methoden mit dem Einsatz von kreativen Apparat für Batch-Färbung von mehreren frei schwebenden Abschnitte zu einem bestimmten Zeitpunkt in Kombination möglich.

Batch Immunfärbung für Large-Scale Protein-Nachweis im Whole Affenhirn

Die Immunhistochemie (IHC) ist eine der am häufigsten eingesetzten Labortechniken zum Nachweis von Zielproteinen in situ. Fragen bezüglich der ...

Dieses Verfahren beginnt nach Erhalt eines mit 4 % PFA perfundierten, externen und kryoprotegierten Gehirns, das an Neuroscience Associates zur Einbettung unter Verwendung von Ausrichtungsmarkierungen, die in der umgebenden Matrix eingebettet sind, gesendet wurde. Das Gehirn kann in koronaler Ebene geschnitten werden, um serielle Schnitte mit einer gewünschten Dicke herzustellen, die den gesamten anterioren bis posterioren Bereich des Gehirns darstellen, wobei spezialisierte Körbe und Behälter verwendet werden. Eine Chargen-Immunverarbeitung kann durchgeführt werden, um das räumliche Expressionsmuster eines Proteins im gesamten Gehirn zu bestimmen.Hallo, ich bin Dr. Shaheen Zur vom Labor für Visuelle Neurowissenschaften am Institut für Optometrie der Universität Montreal. Hallo, ich bin Dr. Mark Burke, ebenfalls vom Labor für Visuelle Neurowissenschaften am Institut für Optometrie der Universität Montreal. Hallo, ich bin Dr. Mo Petto, Leiter des Labors für Visuelle Neurowissenschaften am Institut für Optometrie der Universität Montreal.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur chargenweisen Immunfärbung zur umfassenden Proteindetektion im gesamten Affengehirn. Wir verwenden dieses V

batch-immunostaining-for-large-scale-protein-detection-whole-monkey

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Brain-Banking: Making the Most Ihrer Forschung Proben

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Die serielle Zwei-Photonen-Tomographie (STPT) ist eine Technik, bei der eine Gewebemasse in ihrer dreidimensionalen Form abgebildet wird, indem die Zwei-Photonen-Bildgebung mit der automatischen Tischsteuerung und dem Mikrotom-Schneiden kombiniert wird. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Implementierung für Weißbüschelaffengehirne, um ihre strukturellen Merkmale besser zu verstehen.

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Erfahren Sie Batch-Immunfärbung für großflächigen Proteinnachweis im gesamten Affengehirn. Diese Methode ermöglicht die Analyse räumlicher Expressionsmuster und verbessert die Effizienz der Immunodetektion in der Neurowissenschaft.

Batch Immunfärbung für Large-Scale Protein-Nachweis im Whole Affenhirn

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