Batch Immunfärbung für Large-Scale Protein-Nachweis im Whole Affenhirn

Dieses Verfahren beginnt nach Erhalt eines mit 4 % PFA perfundierten, externen und kryoprotegierten Gehirns, das an Neuroscience Associates zur Einbettung unter Verwendung von Ausrichtungsmarkierungen, die in der umgebenden Matrix eingebettet sind, gesendet wurde. Das Gehirn kann in koronaler Ebene geschnitten werden, um serielle Schnitte mit einer gewünschten Dicke herzustellen, die den gesamten anterioren bis posterioren Bereich des Gehirns darstellen, wobei spezialisierte Körbe und Behälter verwendet werden. Eine Chargen-Immunverarbeitung kann durchgeführt werden, um das räumliche Expressionsmuster eines Proteins im gesamten Gehirn zu bestimmen.

Hallo, ich bin Dr. Shaheen Zur vom Labor für Visuelle Neurowissenschaften am Institut für Optometrie der Universität Montreal. Hallo, ich bin Dr. Mark Burke, ebenfalls vom Labor für Visuelle Neurowissenschaften am Institut für Optometrie der Universität Montreal. Hallo, ich bin Dr. Mo Petto, Leiter des Labors für Visuelle Neurowissenschaften am Institut für Optometrie der Universität Montreal.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur chargenweisen Immunfärbung zur umfassenden Proteindetektion im gesamten Affengehirn. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Expressionsmuster von Zielproteinen im gesamten Gehirn zu untersuchen und den Ausdruck dieser Proteine innerhalb desselben Gehirns zu vergleichen. Beginnen wir also.

Vor der histologischen Aufarbeitung ein Primatenhirn beschaffen, das durch systemische Perfusion konserviert und nachfixiert sowie durch sukzessive Saccharoslösungen kryoprotegiert wurde. Zu diesem Zeitpunkt wird das Gehirn an Neuroscience Associates gesendet, um es mit deren proprietärer Technologie einzubetten und frei zu schneiden. Nach Rücksendung wird man feststellen, dass sieben Orientierungsmerkmale in der Einbettungsmatrix platziert sind, damit die Schnitte korrekt ausgerichtet und nach Abschluss der histologischen Verarbeitung wieder exakt positioniert werden können.

Während des Schneidens werden digitale Bilder aufgenommen, die später zur 3D-Rekonstruktion anatomischer Karten verwendet werden können. Der Neuroscientist-Verbund verarbeitet unser Gewebe, um serielle, 50 Mikrometer dicke, frei schwimmende koronale Schnitte über das gesamte Gehirn zu erhalten. Sobald dies abgeschlossen ist, können wir mit der histologischen Aufarbeitung der Schnitte beginnen.

Wenn wir mit der histologischen Aufarbeitung beginnen, haben wir typischerweise pro Antikörper oder Färbung etwa 140 Schnitte zu bearbeiten. Hier werden wir die Technik an einem kleineren Probensatz demonstrieren, bestehend aus Schnitten, die mit dem Antikörper SMI 32 behandelt wurden, einem monoklonalen Antikörper gegen nicht phosphorylierte Neurofilamentproteine. Während des gesamten Verfahrens kommen spezielle Färbegefäße und -körbchen zum Einsatz, die es ermöglichen, eine große Anzahl schwimmender Schnitte gleichzeitig und effizient zu verarbeiten.

Dies gewährleistet eine gleichmäßige Färbung über alle Schnitte hinweg. Im ersten Schritt werden die Schnitte 60 Minuten lang in einer auf PBS basierenden Lösung, die TRITON X 100 und normales Pferdeserum enthält, inkubiert. Dadurch wird die unspezifische Bindung von Antikörpermolekülen verringert, die zu Hintergrundfärbungen führen würde.

Anschließend werden die Schnitte über Nacht inkubiert. Am folgenden Tag werden sie in einer auf PBS basierenden SMI-32-Antikörperlösung, die mit Triton X-100 und normalem Pferdeserum ergänzt ist, für jeweils 10 Minuten dreimal in Waschlösung gewaschen und anschließend zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, und zwar in einer auf PBS basierenden biotinylierten sekundären Muse-Antikörperlösung, die Triton X-100 und normales Pferdeserum enthält.

Nach einer Serie von drei zusätzlichen 10-minütigen Waschungen werden die Schnitte eine Stunde bei Raumtemperatur in eine Lösung des mit Biotin konjugierten Avidin-Peroxidase-Komplexes gegeben. Schließlich werden die Schnitte nach einer weiteren Waschserie 10 Minuten lang in eine D-Amino-Benzidin-Reaktion gegeben, die eine braune Färbung in den immunreaktiven Neuronen erzeugt. Die Reaktion wird dann gestoppt, indem der Färbebehälter entfernt und die Schnitte in PBS getaucht werden.

Nach zwei bis drei Spülgängen mit jeweils fünf Minuten in PBS sind die Schnitte bereit, einzeln auf Objektträgern aufgebracht zu werden, um den Aufbringungsprozess unter Verwendung einer großen Petrischale und sehr weicher Pinsel zu beginnen. Die Schnitte werden aus dem PBS-Pufferbehälter angehoben und einzeln auf mit Gelatine beschichteten Objektträgern platziert. Anschließend werden die Proben am folgenden Tag über Nacht in einem Abzug lufttrocknen gelassen.

Die Schnitte werden durch Eintauchen in deionisiertes Wasser gespült, um eventuell verbliebene Salzkristalle aus dem Einbettungsprozess zu entfernen. Anschließend werden die Objektträger in aufsteigenden Ethanolstufen dehydriert, in Xylol gereinigt und mit Permount-Einbettmedium mit Deckgläsern versehen. In diesem Stadium sollten die Objektträger etwa eine Woche bis zehn Tage in horizontaler Lage gelagert werden, damit das Einbettmedium aushärten kann.

Danach können die Objektträger in einer Objektträgerbox aufbewahrt oder mittels Mikroskopie bildlich dargestellt werden. Diese Methode liefert ein vollständiges Expressionsprofil eines Zielproteins über das gesamte Affengehirn hinweg. Hier zeigen wir repräsentative koronare Schnitte, die einen Überblick über die Expression von FMRP, neuem n und SMI 32 bieten.

Im gleichen Affengehirn. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man eine manuelle Immunfärbung für ein Zielprotein über das gesamte Gehirn hinweg durchführt. Bei dieser Prozedur ist es wichtig sicherzustellen, dass alle Schnitte während der Inkubation in verschiedenen Lösungen leicht agitiert werden und zu jeder Zeit vollständig eingetaucht bleiben.

Des Weiteren sollten Sie sich beim Einbetten der Präparationen in Glas Zeit lassen und so viele Falten und Kräuselungen wie möglich entfernen, ohne die Integrität des Gewebes zu beschädigen. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.