Name: Cell Block Vorbereitung von Zytologie Probe mit Vorherrschaft von Individuell verstreuten Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Lernen Sie die Zellblockpräparation nach Shidham für zytologische Proben mit verstreuten Einzelzellen. Diese Methode mit AV-Marker und HistoGel verbessert die Immundurchfärbung und Spezialfärbung signifikant.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren danken Chris Chartrand, HT (VKS) für den Nachweis der Abschnitt Schneiden der Zellenblock mit AV-Marker.

Einleitung: Dies ist ein Video beschreibt Shidham Methode für Zellenblock Vorbereitung von flüssigen Zytologie (LBC) Probe mit HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG). Im Gegensatz zu anderen zufälligen Ansätze verglichen, die folgenden sind die beiden kritischen Merkmale dieses Protokoll für die Vorbereitung Zellblöcke von relativ hypozellulären Proben mit einzeln verstreuten lose Zellen (1-5). <ol><li> Dieses Protokoll umfasst die Schritte, um die Zellen entlang der Ebene parallel zur Schnittfläche der Zelle blockieren konzentrieren. </li><li> Es enthält auch ein Leuchtturm-wie dunkle Aufnahme von AV-Markierung (Abbildung 1b), die zwei der folgenden Zwecken dient: <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Zur Visualisierung der Ebene, auf der die Zellen konzentriert. Die Fläche der Zelle blockieren mit den Zellen von Interesse konnte nun durch die histotechnologist visualisiert werden, wenn die dunkle Leuchtturm während des Schneidens ausgesetzt ist. Diese Fähigkeit zur Überwachung würde man beim Schneiden durch die Ebene mit den meisten der Zellen, oder schneidet nicht zu oberflächlich in die Ebene mit der höchsten Konzentration von Probe-Zellen zu verhindern. </li><li> Um als Locator Bezugspunkt in serielle Zellenblock Abschnitt über verschiedene Folien dienen. Dieser Referenzpunkt fungiert als ein Leuchtfeuer zum Auffinden bestimmter Zellen oder Gruppen von Zellen für die Auswertung eines Koordinatensystems Immunreaktivität Muster mit dem SCIP-Ansatz (6,7). </li></ol></li></ol> PROTOKOLL (Abbildung 2) Vorbereitung der Probe. <ol><li> Übertragen Sie die verbleibende LBC Zervixzytologie Probe einen flachen Boden Glasrohr (Durchmesser 15mm x 45mm) (Abb. 2.1 bis 2.4). Legen Sie das Glasrohr in ein größeres Kunststoff Trägerrohr (28 x 85mm) und Zentrifuge. Entfernen Sie den Glasboden Rohr aus dem Trägerrohr und giesst die überstehende. </li><li> Das Glasrohr wird dann verschlossen (um das Auslaufen von Heizungswasser in den nächsten Schritt zu verhindern) und wieder in eine größere Wohnung unteren Träger Kunststoffrohr gelegt </li><li> Der Träger Kunststoffrohr mit dem Glasrohr wird dann verschlossen, platziert in einer Zentrifuge (mit schwenkbarem Tassen und nicht festen Winkel Becher so, dass die Zellen senkrecht fallen auf den flachen Boden der Glasröhre), und drehte sich auf 1805 G (3000 rpm, Rotorradius-17cm) für 5 Minuten (Abbildung 2,5). </li><li> Die Rohre werden dann senkrecht aus der Zentrifuge entfernt und die kleinere Glasröhre ist mit einer Pinzette aus der größeren Träger Kunststoffrohr, ohne die sedimentierte Pellet mit Zellen entfernt. </li><li> Das Glasrohr mit der Probe ist nicht begrenzten und der Überstand wird dabei nicht auf die flache Schicht von Sedimenten Zellen am Boden (Abb. 2.6) stören gegossen. </li></ol> Die Einbeziehung der Bezugskoordinatensystem AV-Marker und die Zugabe von Gel- <ol><li> Ein dunkler Leuchtturm AV-Markierung (ca. 2 mm x 2 mm Größe, die Oberfläche flach, Fragment des dunkel gefärbten, sectionable Material) (Abbildung 3) ist als Wegweiser zu dem Glasrohr (Abbildung 2,7) aufgenommen. </li><li> Verflüssigen ein Aliquot von HG durch Schmelzen in der Mikrowelle für 10 Sekunden bei mittlerer Leistung. </li><li> 0,5 ml des geschmolzenen HG an das Rohr, vermischen sich mit dem Sediment schnell und rekapitulieren sie (Abb. 2.8) (Fahren Sie mit dem nächsten Schritt schnell, ohne dass die HG zu beginnen Verfestigung). </li><li> Fügen Sie ca. 2,5 ml warmem (45 ° C) Wasser an den Frachtführer Kunststoffrohr (Abbildung 2,9). </li><li> Die kleineren capped Glasröhre ist innerhalb der Kunststoffrohr mit warmem Wasser gestellt. (Dieser Schritt ist notwendig, um die HG ein Erstarren in den nächsten Schritten zu halten) (Abbildung 2,9). </li><li> Der Träger Kunststoffschlauch wird in die Zentrifuge eingesetzt (mit schwenkbarem Tassen und nicht festen Winkel Becher so, dass die Zellen senkrecht fallen auf den flachen Boden der Glasröhre), und drehte sich auf 1805 G (3000 rpm, Rotor-Radius-17cm) für fünf Minuten. Der Zweck dieser Zentrifugation wird der AV-Markierung zu schieben und die Zellen in einer Schicht näher an der Schnittfläche der endgültigen Paraffin eingebetteten Zellen blockieren (Abbildung 1d) zu konzentrieren. </li><li> Die Rohre werden dann sanft und vertikal aus der Zentrifuge dabei nicht um die sedimentierten dünne Schicht mit der Probe Zellen am Boden stören entfernt. </li><li> Je größer Kunststoffrohr ist unverschlossen und die kleineren Glasröhre ist vertikal mit einer Pinzette, ohne die Sedimentschicht der Probe Zellen entfernt. </li><li> Das Glasröhrchen wird gekühlt in vertikaler Position für 15 Minuten zu kühlen und zu verfestigen sich die HG (Abbildung 2.11). </li></ol> Entfernung von der Zelle blockieren, wie eine Taste des Gels mit Proben für die Endbearbeitung <ol><li> Die verfestigte HG Festplatte, mit der Schicht aus konzentrierten / Sediment Probe an der Unterseite ist aus dem flachen Boden Glasröhre durch spritzende 10% Formalin durch eine 23-Gauge-Nadel mit der Spritze (Abb. 2,12) verdrängt. </li><li> Die Nadel wird an der Seite des Rohres an der Peripherie des erstarrten HG Scheibe mit Probe (Abbildung 2.12) eingesetzt. </li><li> Die needle ist an der Seite der Röhre gedreht, während Formalin wird langsam durch die Spritze geschoben. Daraus ergibt sich die Trennung der HG-Taste zusammen mit dunkel gefärbten Beacon AV-Marker und die konzentrierte Probe in sie aus dem flachen Boden des Glasrohres (Abbildung 2.12). </li><li> Der Zellenblock (Gel-Taste mit Probe-Zellen) wird dann in eine markierte Kassette gelegt und legte für die Gewebe-Verarbeitung in Paraffin eingebetteten Zellen blockiert (Abbildung 2.13) vorzubereiten. </li></ol> Einbetten und Schneiden der Probe <ol><li> Die Scheibe ist in Paraffin mit dem dunklen Leuchtturm Marker nach unten als Schnittfläche (Abb. 1) eingebettet. </li><li> Der Block wird bis zum dunklen AV-Markierung geschnitten wie ein Leuchtfeuer ausgesetzt ist und deutlich sichtbar sein. </li><li> Drei bis vier Mikrometer Abschnitte sind von dieser Ebene die meisten der einzeln verstreuten Zellen aus der Probe enthalten sollte geschnitten. </li><li> Die Abschnitte werden auf dem Objektträger zur weiteren Färbung, immunhistochemische Färbung oder andere Tests wie angegeben gesammelt. Die Protokolle für diese Tests einschließlich der Art der Folien für die Montage der Teile verwenden können variieren. Generell gilt für Immunfärbung werden beschichtete Folien verwendet werden, um Schwimm-und Verlust von Abschnitten aus den Folien während der Immunfärbung Schritte zu verhindern. </li></ol> Abkürzungen verwendet werden (in alphabetischer Reihenfolge): CISH, chromogene in situ Hybridisierung Tests; FISH, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung Tests; FFPE, Formalin-fixierten Paraffin eingebetteten, FNA, Feinnadelpunktion; HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, flüssige Zytologie, PCR Polymerase-Kettenreaktion; <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Die Struktur der Zelle blockieren, indem Shidham-Protokoll vorbereitet. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Die Zusammenfassung der verschiedenen Schritte zur Vorbereitung Zellenblock von LBC Probe durch Shidham-Protokoll. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Erstellung von AV-Marker aus Bananenschalen. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Vergleich der Zell-Blöcke und Sektionen mit und ohne AV-Marker. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Vergleich der Zellstruktur von Teilen der Zelle blockieren mit und ohne AV-Marker.

<ol><li>Shidham, V. B., Epple, J. Chapter 14, Appendix I: Collection and processing of effusion fluids for cytopathologic evaluation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShidham%2C+VB+%22Cytopathologic+Diagnosis+of+Serous+Fluids%22">Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids</a>. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. Forthcoming.</li>
<li>Varsegi, G., D'Amore, K., Shidham, V. p16INK4a Immunocytochemistry as an Adjunct to Cervical Cytology - Potential Reflex Testing on Specially Prepared Cellblocks from Residual Liquid Based Cytology (LBC) Specimens. Modern Pathology 22: 98th Annual Meeting of United States and Canadian Academy of Pathology. 2009 Mar 7-13, Boston, Ma, , Abstract 424 97a-97a (2009).</li>
<li>Nigro, K., Tynski, Z., Wasman, J., Abdul-Karim, F., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cell+block+preparation+methods+for+nongynecologic+ThinPrep+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Cytopathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of cell block preparation methods for nongynecologic ThinPrep specimens.</a> Diagn Cytopathol. 35, 640-643 (2007).</li>
<li>Saleh, H. A., Hammoud, J., Zakaria, R., Khan, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Thin-Prep+and+cell+block+preparation+for+the+evaluation+of+Thyroid+epithelial+lesions+on+fine+needle+aspiration+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22CytoJournal%22%5BJournal%5D)">Comparison of Thin-Prep and cell block preparation for the evaluation of Thyroid epithelial lesions on fine needle aspiration biopsy.</a> CytoJournal. 5, 3-3 (2008).</li>
<li>Kyroudi, A., Paefthimiou, M., Symiakaki, H., Mentzelopoulou, P., Voulgaris, Z., Karakitsos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+diagnostic+accuracy+with+a+cell+block+preparation+from+thin-layer+endometrial+cytology%3A+a+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cytol%22%5BJournal%5D)">Increasing diagnostic accuracy with a cell block preparation from thin-layer endometrial cytology: a feasibility study.</a> Acta Cytol. 50, 63-69 (2006).</li>
<li>Atkinson, B. F. Chapter 5: Immunocytochemistry of effusion fluids: introduction to SCIP approach (Chapter 5. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAtkinson%2C+BF+%22Cytopathologic+Diagnosis+of+Serous+Fluids%22">Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids</a>. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. (2007).</li>
<li>Shidham, V. B. Chapter 15, Appendix II: Immunocytochemistry of effusions processing and commonly used immunomarkers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShidham%2C+VB+%22Cytopathologic+Diagnosis+of+Serous+Fluids%22">Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids</a>. Shidham, V. B., Atkinson, B. F. , Elsevier. (2007).</li>
</ol>

Zell-Blöcke sind ein wertvolles Instrument zur Bewertung der verschiedenen zytologischen Proben (1). Am wichtigsten ist, zusätzlich zu den architektonischen Details der Probe erlauben Zellblöcke für die Auswertung der ergänzenden Studien wie Immunzytochemie, fluoreszierend / chromogene in situ Hybridisierung Tests (FISH / CISH) und in-situ PCR. Eine Vielzahl von Methoden für die Herstellung von Zell-Block beschrieben. Allerdings sind die meisten dieser für Nicht-gynäkologischen Zytologie Proben, die relativ viele Zellen enthalten und mit dem Gewebe Mikrofragmente wie in FNA saugt und einige seröse Flüssigkeiten wie Ergüsse (1,3,4,5). Da Zellblöcke vor allem die Möglichkeit für immunzytochemische Auswertung zu gewährleisten, sollte die Verarbeitung vorzugsweise ähnlich zu sein, dass der Formalin-fixierten Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebe. Letztlich sind die Ergebnisse nach immunzytochemische Auswertung der Zelle blockieren Abschnitte gewonnen werden, die mit der veröffentlichten Literatur überwiegend auf FFPE Gewebeschnitten durchgeführt verglichen. Etwaige Änderungen im Protokoll potenziell beeinträchtigen und bewirken die Gültigkeit der Ergebnisse auf Zellblöcke durch verschiedene Fixiermittel und Reagenz-Sequenzen eine andere als die Routine FFPE verwendet verarbeitet wird. Einige kommerzielle Techniken haben den Nachteil, der Verarbeitung durch ein Protokoll der Exposition gegenüber anderen Fixateur-Reagenz Exposition. Verschiedene Methoden der Zell Satzaufbereitung sind für Proben mit einer signifikanten Menge an Sediment-und Gewebeteile zur Verfügung. Grundsätzlich sind die konzentrierte Ablagerungen von einigen Gel oder Koagulation grundsätzlich unterstützt. Das wendige Taste wird dann in Paraffin nach der Verarbeitung wie der chirurgischen Pathologie Proben / Biopsien eingebettet. Die Gele verwendet werden, umfassen Gelatine, Agar, Fibrinogen / Plasma-Thrombin und andere kommerzielle Gele, wie HG. Die Methoden der Konzentration variieren von einfachen Pelletierung des Sediments durch Zentrifugation zur Konzentration der Zellen auf verschiedenen Arten von Membranen. Beispiele hierfür sind: Milipore, Collodin (Celloidin) Taschen oder Abschaben der Zellen von der zytologische Abstriche auf Glasplättchen (1). Wir haben auch eine Vielzahl von Gelen, indem Sie versuchen verschiedene Kombinationen von Agar und Gelatine ausgewertet. Keine der Kombinationen erzielten die eine feste Konsistenz genug, um eine leicht manövrierbar Scheibe aus erstarrten Gel mit eingebetteten Zellen aus der Probe in einem Stück zu erhalten. HG zeigten entsprechende Konsistenz und nach unserer Erfahrung die Immunfärbung Ergebnisse auf HG Zellenblock Abschnitte wurden ausgezeichnet. Flüssige Zytologie (LBC) Proben für zervikovaginalen Zytologie sind im Allgemeinen weniger zelluläre als nicht-gynäkologische Proben wie oben erwähnt. Neben der gynäkologischen LBC Proben enthalten überwiegend einzelne verstreute exfoliated oberflächlichen Zellen aus zervikovaginalen Schleimhaut. Aus diesem Grund können geeignete Zellstruktur innerhalb der Zelle blockieren Abschnitte nicht ohne einen besonderen Ansatz erreicht werden. Da diese einzeln zellulären Komponenten in der den Block verstreut kann nicht durch den histotechnologist während Abschnitt Schneiden gesehen werden kann, auf welchem ​​Niveau die Zellen beginnen, die in der Abschnitte nicht geschätzt und können übersehen werden, entweder durch Schneiden über das Niveau bei den meisten Zellen oder nicht Schneiden tief genug in die Höhe mit der höchsten Konzentration von Probe-Zellen (Abbildung 4). Shidham-Protokoll-Adressen diese beiden Fragen mit HG als Einbettmedium und konventioneller Laborausstattung (2) (Abbildung 2). Dieses Protokoll umfasst die folgenden zwei wichtigen Funktionen (Abbildung 1): <ol><li> Konzentration und Ausrichtung der einzeln verstreuten Zellen in einem engen Flugzeug benachbart und parallel zu der Schnittfläche der Zelle blockieren (Abbildung 5). </li><li> Aufnahme eines Beacon-wie dunkle AV-Marker als Wegweiser. Dies ist entscheidend für das Erreichen folgenden Features: <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Identifizierung und Überwachung der Ebene, auf der die Zellen in der Zelle blockieren konzentriert sind. Die Belichtung der dunklen Wegweiser zeigt die Ebene, auf der die meisten der einzeln verstreuten Zellen in der Zelle blockieren erwartet, dass sich (Abbildung 4) werden sollen. Damit wird verhindert, der Überschneidung (Schneiden über das Niveau bei den meisten Zellen) oder unterboten (nicht schneiden tief genug in die Höhe mit der höchsten Konzentration von Probe-Zellen) in der Zelle blockieren und ermöglichen die Auswahl der Abschnitte aus der Ebene in der Zelle blockieren Korrespondenz mit höchster Konzentration von Zellen. </li><li> Die dunkel gefärbten Wegweiser in den Abschnitten dient auch als Bezugspunkt zu überblicken und zu identifizieren genau die gleichen Zellen in verschiedenen Schnittserien der Zelle blockieren auf verschiedenen Folien (Abbildung 4). Dies ist kritisch, während die Interpretation und Bewertung des Koordinatensystems Eigenschaften wie immunoprofile von bestimmten Zellen der SCIP-Ansatz auf die gleichen Zellen in verschiedenen Abschnitten (6,7) folgen. </li></ol></li></ol> Obwohl our-Protokoll standardisiert ist und berichtet für flüssige Zervixzytologie Proben, es kann auch verwendet werden, um diagnostische Ausbeute von vielen anderen nicht-gynäkologische Proben wie Erguss Flüssigkeiten, FNA, Bürsten, Zysteninhalts etc. Darüber hinaus verbessern die AV-Marker erleichtern würde verbessert Anwendung der SCIP-Ansatz bei der immunhistochemischen Auswertung der Zelle blockieren Abschnitten dieser Proben. Die Einbettung Medium kann durch andere Reagenzien mit entsprechenden Modifikationen an relevanten Schritte ersetzt werden. HG kann durch Plasma (Fibrinogen), die von Thrombin bei Raumtemperatur (1) geliert werden ersetzt werden.

cell block vorbereitung von zytologie probe mit vorherrschaft von individuell verstreuten zellen

Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

Dieses Video zeigt Shidham die Verfahren zur Herstellung von Zell-Blocks von Flüssigkeit basiert zervikovaginalen Zytologie Proben, die einzeln verstreuten Zellen und kleine Zellgruppen. Diese Technik verwendet HistoGel (Thermo Scientific) mit konventionellen Laborgeräten. Die Verwendung von Zellen blockieren Abschnitten ist ein wertvolles Hilfswerkzeug für die Bewertung von nicht-gynäkologischen Zytologie. Sie ermöglichen die Zytopathologen zusätzliche morphologische Muster Detail, einschließlich der Architektur der Läsion zu studieren. Vor allem sorgen sie für die Auswertung der ergänzenden Studien wie Immunzytochemie, in-situ-Hybridisierung Tests (FISH / CISH) und in-situ-Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Traditionelle Zellenblock Vorbereitung Techniken meist nicht-gynäkologischen Zytologie Proben angewendet wurde, in der Regel für Körperflüssigkeit Ergüssen und Feinnadelpunktion Biopsie. Flüssiges Basis zervikovaginalen Exemplare sind relativ weniger zelluläre als ihre nicht-gynäkologischen Kollegen mit vielen einzelnen verstreuten Zellen. Aus diesem Grund ist eine ausreichende Zelldichte innerhalb der Zelle blockieren Abschnitte schwer zu erreichen. Darüber hinaus können die histotechnologist Schneiden des Blocks nicht vorstellen, auf welcher Ebene werden die Zellen bei der höchsten Konzentration. Daher ist es schwierig, die geeignete Ebene, welche Abschnitte ausgewählt, um den Glasträger für die Prüfung übertragen werden können, werden überwacht. Als Ergebnis kann die Fläche der Zelle Block mit den Zellen von Interesse verpasst haben, entweder durch Schneiden Vergangenheit oder schneidet nicht tief genug sein. Aktuelle Protokoll für Shidham Methode behebt diese Probleme. Obwohl dieses Protokoll standardisiert ist und berichtet für gynäkologische flüssige Zytologie Proben kann es auch zu nicht-gynäkologische Proben wie Erguss Flüssigkeiten, FNA, Bürsten, Zysteninhalts etc für eine verbesserte Diagnose-Material in der Zelle blockieren Abschnitte angewendet werden.

Shidham das Verfahren zur Herstellung von Zell-Blöcke mit AV-Markierung von Zellproben, die einzeln verstreuten Zellen und kleine Zellgruppen.

Cell Block Vorbereitung von Zytologie Probe mit Vorherrschaft von Individuell verstreuten Zellen

In diesem Video wird die Methode nach Shidham zur Herstellung von Zellblöcken aus flüssigkeitsbasierten zervikovaginalen Zytologieproben demonstriert, die einzeln ...

Die Zellblockpräparation beginnt mit der Übertragung der konzentrierten Zellen der Probe in ein flachbodiges Glasröhrchen, das in einem größeren Röhrchen gehalten wird. Die Zellen werden dann durch Zentrifugation am Boden abgelagert, bevor der AV-Marker und geschmolzenes HistoGel hinzugefügt werden. Das Hinzufügen von warmem Wasser zum Trägerglasröhrchen stellt sicher, dass das HistoGel flüssig bleibt.Eine anschließende Zentrifugation befördert die AV-Markierung durch das Gel und konzentriert die Zellen in einer Schicht nahe der Schnittfläche des Zellblocks. Nach dem Erstarren kann der Gelpfropfen entfernt und für die Paraffineinbettung aufbereitet werden. Hallo, ich bin Dr. George Varszegi aus dem Bereich Zytologie der Abteilung für Pathologie am Medical College of Wisconsin in Milwaukee, Wisconsin.Und ich bin Dr. Vsam, ebenfalls aus dem Bereich Zytologie der Abteilung für Pathologie am Medical College of Wisconsin in Milwaukee. Heute möchten wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung von Zellblöcken aus zytologischen Präparationen mit überwiegender Anzahl einzeln streuender Zellen zeigen. Wir verwenden dieses Verfahren, um das Immunprofil der Zellen in diesen einzeln streuenden Zellen in den Schnitten des Zellblocks zu untersuchen, sowie zur Beurteilung spezieller Färbungen an diesen Schnitten.Beginnen wir also. Überführen Sie zu Beginn des Verfahrens etwa 0,5 Milliliter der vorzugsweise konzentrierten Probe in ein 45 Millimeter langes, flachbodiges Glasröhrchen mit einem Durchmesser von 15 Millimetern. Stellen Sie anschließend das Glasröhrchen in ein großes, flachbodiges Kunststofftrageröhrchen und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 1800 ×g.Nach der Zentrifugation den Glasrohr mit flachem Boden aus dem Kunststoffträgerrohr nehmen und das Überstand entfernen, wobei darauf geachtet werden muss, die flache Schicht des Zellpräzipitats am Boden nicht aufzuwirbeln. Ein dunkles Signal auf dem Johnny Vena- oder AV-Marker wird den Zellen als Wegweiser hinzugefügt.Nachdem die Zellen eingebettet sind, dient ein AV-Marker dazu, die Ebene zu identifizieren, in der sich die Zellen innerhalb des Paraffinblocks konzentrieren. Geben Sie mit einer speziellen Pipette einen zuvor hergestellten AV-Marker in Form eines flachflächigen Würfels zu den Zellen im Röhrchen. Beginnen Sie nun mit dem Prozess des Gelzuführens, indem Sie ein Aliquot an Histogel oder HG auflösen, indem Sie es für 10 Sekunden bei mittlerer Leistung in einer Mikrowelle schmelzen, oder folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.Fügen Sie 0,5 Milliliter des geschmolzenen HG zu dem Gefäß mit den sedimentierten Zellen hinzu. Mischen Sie schnell und verschließen Sie das Gefäß erneut. Fahren Sie unmittelbar danach damit fort, etwa zweieinhalb Milliliter warmes Wasser bei 45 Grad Celsius zu dem Kunststoffträgergefäß hinzuzufügen.Danach die CAPA-R&ouml;hre mit den Zellen, der AV-Markierung und dem HistoGel einf&uuml;gen. Schnelles Arbeiten und die Verwendung von warmem Wasser verhindern, dass das Gel w&auml;hrend der anschlie&szlig;enden Schritte gerinnt. Anschlie&szlig;end zentrifugieren, um die AV-Markierung durch das Gel zu dr&uuml;cken und die Zellen in einer Schicht zu konzentrieren, die n&auml;her an der Schnittfl&auml;che des endg&uuml;ltigen paraffin-eingebetteten Zellpr&auml;parats liegen wird.Verwenden Sie Schwenkbecher und keine Festwinkelbecher, damit sich die Zellen senkrecht zum flachen Boden des Glasrohrs anreichern, und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 1800 Gs. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, nehmen Sie die Röhrchen vorsichtig und senkrecht aus der Zentrifuge, wobei Sie darauf achten, die dünne Zellsedimentschicht am Boden nicht aufzuwirbeln. Entfernen Sie mithilfe einer Pinzette das kleinere Glasröhrchen senkrecht, ohne die Sedimentschicht der Probenzellen zu stören.Kühlen Sie das kleine Glasröhrchen abschließend 15 Minuten lang in senkrechter Position, um das Gel abkühlen und erstarren zu lassen. Nach Ablauf der 15 Minuten entfernen Sie das Gel mit den darin enthaltenen Zellen aus dem Glasröhrchen, um die erstarrte HG-Scheibe zu lösen, die am Boden eine Schicht konzentrierten Probenmaterials zusammen mit dem dunkelfarbenen AV-Marker enthält. Verwenden Sie eine 23-Gauge-Nadel, die an eine Spritze mit 10 % Formalin angebracht ist.Beginnen Sie damit, die Nadel entlang der Seite des Rohrs am Rand der erstarrten HG-Scheibe einzuführen. Setzen Sie fort, indem Sie die Nadel entlang der Seitenwand des Rohrs drehen, während Sie gleichzeitig langsam die Formin-Lösung durch die Spritze drücken. Beobachten Sie die Ablösung des HG-Knopfs vom flachen Boden des Glasrohrs.Der getrennte Gelknopf, der die dunkelfarbene Leuchtfarbe-AV-Markierung und die konzentrierte Probe enthält, wird als Zellblock-Finish bezeichnet, indem der Zellblock in eine beschriftete Kassette gegeben und zur Gewebeverarbeitung zur Herstellung paraffineingebetteter Zellblöcke eingereicht wird. Sobald der Zellblock eingebettet ist, fahren Sie mit dem Schneiden der Probe fort, indem Sie die Scheibe des in Paraffin eingebetteten Zellblocks schneiden; montieren Sie den paraffineingebetteten Zellblock am Mikrotom und schneiden Sie grob, um die Oberfläche des Paraffinblocks zu ebnen und die Scheibe des Zellblocks freizulegen, bis die dunkelfarbene AV-Markierung freigelegt und deutlich sichtbar ist. Sobald die dunkelfarbene AV-Markierung sichtbar ist, schneiden Sie drei bis vier Mikrometer dicke Schnitte.Diese Abschnitte enthalten konzentrierte Zellen aus der ursprünglichen Probe. Sammeln Sie jeden Abschnitt auf einem Objektträger für eine weitere Färbung, gefolgt von der Mikroskopie. Hier bei geringer Vergrößerung sehen wir die Auswirkung der Einbeziehung eines mit AV-Tinte markierten Bananenschalenmarkierungsmaterials in die Probe auf die Zellkonzentration in diesen mit H und E gefärbten Schnitten.Man kann auf dem Bild links sehen, dass dieser Marker die Überwachung der Schnitttiefe ermöglicht, um die Ebene mit guter Zellulärität zu erreichen. Der AV-Marker erlaubt zudem die Orientierung verschiedener Zellen, insbesondere von Schnitten, die in verschiedenen seriellen Schnitten auf anderen Objektträgern anhand des Markers verfolgt werden können. Ohne ihn könnte die Schnitttiefe nicht überwacht werden.Gewebeproben wurden an einer Schnittebene mit geringer Zellzahl entnommen. Der Grad der Zellzahl in den Proben ist bei hoher Vergr&ouml;&szlig;erung noch deutlicher erkennbar; bei Anwesenheit des AV-Markers kann die Schnitttiefe leicht &uuml;berwacht werden, und man kann problemlos Proben mit schlechter Zellzahl vermeiden. Wir haben Ihnen eine Methode zur Herstellung des Zellblockes aus der Probe mit locker verstreuten Fragmenten und Zellen gezeigt.Die dunkle AV-Markierung, die wir während der Verarbeitung des Zellpräparats hinzugefügt haben, hilft uns dabei, die Abschnitte mit der höchsten Zellkonzentration auszuwählen. Sie ermöglicht es uns außerdem, diese Abschnitte korrekt auf Objektträgern auszurichten. Es ist wichtig, dass das HistoGel sich in einem geschmolzenen Zustand befindet, während sich die Zellen entlang des unteren Glasrohrs der Flutplatte – der Schneidefläche – ausrichten. Dieses Verfahren könnte jedoch für andere Methoden, einschließlich kalter Methoden wie Thrombin, Fibrinogen, durch entsprechende Modifikationen angepasst werden. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Verfahren.Vielen Dank.

cell-block-preparation-from-cytology-specimen-with-predominance

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt die Aufbereitung von formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Tumorproben, die zur Konservierung von Gewebe- und Zytologieproben von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) verwendet...

Präparation von formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Tumorproben: Ein Protokoll zur Konservierung von Gewebe- und Zytologieproben von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC)

Dieses Video beschreibt die Herstellung von subzellulären Fraktionen aus leukämischen Zellen, was eine Methode zur Erzeugung von zellulären und nukleären Fraktionen aus leukämischen Zellen ist. Die nukleare und zytoplasmatische Fraktion können für weitere nachgelagerte Analysen verwendet werden.

Präparation subzellulärer Fraktionen aus leukämischen Zellen: Eine Methode zur Erzeugung zellulärer und nukleärer Fraktionen aus leukämischen Zellen

Chromosomen von lebenden Zellen, wie Lymphozyten oder Fibroblasten der Haut isoliert werden und aus Organismen, einschließlich Menschen oder Mäusen. Diese Chromosomen-Präparate können weitere für die Routine G-Banding und molekulare zytogenetischen Verfahren wie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), komparative genomische Hybridisierung (CGH), und spektrale Karyotypisierung (SKY) genutzt werden.

Chromosomenpräparation aus kultivierten Zellen

Die Verwendung von Zytobürstenproben zur Entnahme von Lymphozyten und Monozyten aus dem Endozervix ist eine minimalinvasive Technik, die Proben für die Analyse der Immunität des weiblichen Genitaltrakts liefert. In diesem Protokoll beschreiben wir die Entnahme von Zytobürstenproben und die Isolierung von Immunzellen für Durchflusszytometrie-Assays.

Sammlung, Isolierung, und Durchflusszytometrische Analyse der Menschen Endozervikale Proben

Das Verständnis der Rolle von Krebsstammzellen beim Wiederauftreten von Tumoren und der Resistenz gegen Therapien ist in den letzten zehn Jahren zu einem Thema von großem Interesse geworden. Dieser Artikel beschreibt die Isolierung und Charakterisierung der Subpopulation von Krebsstammzellen aus Plattenepithelzelllinien des Kopf- und Halses (HNSCC).

Isolierung und Charakterisierung eines Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom Subpopulation nach Stammzelleigenschaften

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Vorbereitung von Proben mit geringer Zellzahl für die Analyse der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM).

Ein alternativer Ansatz für die Probenvorbereitung mit geringer Zellzahl für die TEM-Analyse

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von zentrifugalen Sammelnetzwerk primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen aufteilen.

Vorbereitung der primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen durch zentrifugale Sammelnetzwerk

Derzeit ist immunofluorescent Flecken auf festen Zellen die Methode der Wahl zur Bestimmung der Ausdruck proteingehalte wenn morphologische Informationen auch notwendig ist. Dieses Protokoll enthaltenen bietet für ein alternatives Verfahren zur Immunocytochemistry auf Paraffin-eingebetteten Zellenblöcken.

Bestimmung der Proteinexpressionsgrad in kultivierten Zellen von Immunocytochemistry auf Paraffin-eingebetteten Zellenblöcken

Hier stellen wir einen integrierten Workflow vor, um phänotypische und molekulare Merkmale zu identifizieren, die zirkulierende Tumorzellen (CTCs) charakterisieren. Wir kombinieren Live-Immunfärmonierung und robotische Mikromanipulation einzelner und gruppierter CTCs mit einzelnen zellbasierten Techniken zur nachgelagerten Analyse und Bewertung der Metastasisis-Sägefähigkeit.

Mikromanipulation von zirkulierenden Tumorzellen für die nachgelagerte Molekulare Analyse und die metastasierende Potenzialbewertung

Dieses Fraktionierungsprotokoll wird es Forschern ermöglichen, zytoplasmatische, nukleare, mitochondriale und Membranproteine aus Säugetierzellen zu isolieren. Die beiden letztgenannten subzellulären Fraktionen werden über einen isopyknischen Dichtegradienten weiter gereinigt.

Zellfraktionierung von U937-Zellen durch isopyknische Dichtegradientenreinigung

Das Protokoll bietet einen zuverlässigen und optimierten Ansatz für die Isolierung von Zellkernen aus soliden Tumorproben für die Multiom-Sequenzierung mit der 10x Genomics-Plattform, einschließlich Empfehlungen für Gewebedissoziationsbedingungen, Kryokonservierung von Einzelzellsuspensionen und Bewertung isolierter Zellkerne.

Optimierte Zellkernisolierung aus frischen und gefrorenen soliden Tumorproben für die Multiom-Sequenzierung

Lernen Sie die Zellblockpräparation nach Shidham für zytologische Proben mit verstreuten Einzelzellen. Diese Methode mit AV-Marker und HistoGel verbessert die Immundurchfärbung und Spezialfärbung signifikant.

Cell Block Vorbereitung von Zytologie Probe mit Vorherrschaft von Individuell verstreuten Zellen

Weitere Videos entdecken