Name: Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part II: Reinigung und Kultur der Menschenrechte Islets (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Lernen Sie die modifizierte automatisierte Methode zur Reinigung und Kultur menschlicher Pankreasinseln. Dieses Verfahren liefert hochwertige Inselzellen für die klinische Transplantation bei Diabetes.

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Unterstützt von der Gründung an der University of Illinois at Chicago sowie Inselzell Resource Center NIH (RFA-RR 05 bis 003), der Christopher-Stiftung, die Efroymson Foundation, und die Tellabs-Stiftung.

1. Reinigung von kleinen Inseln <ol><li> So starten Sie die Insel Reinigungsverfahren, laden Sie die COBE Tasche, klemmen alle Rohre mit Ausnahme der grünen Röhre, und die Geschwindigkeit auf 1.500 und der Super-out auf 0 gesetzt. </li><li> In der Haube Einrichten der Pumpe und Gradienten Bechern und verbinden Sie die Sammlung Schlauch an die grüne Röhre. </li><li> Nun ist die Belastung des Ficoll 1,100 kann beginnen: push &quot;spin&quot; fügen Sie dann 110 ml Ficoll 1,100 bis vorne Becher, und starten Sie die Pumpe, um die COBE Tasche zu laden. Da die Ficoll eingelegt ist, drücken Super Out, stoppen Sie die Pumpe, ausspannen Pumpenkopf und stellen Sie die Super-out Geschwindigkeit auf 100. </li><li> Wenn die Ficoll das Becherglas erreicht und alle Luft aus dem Schlauch, re-Klemme am Pumpenkopf vertrieben. Stellen Sie die Schleuderdrehzahl bis 3.000, und der Super-out zu 0 aus. </li><li> Nun bereiten die Gradienten durch Eingießen der schweren Steigung in den vorderen Becher zu laden. Leicht Release der Klemme zwischen den beiden Bechern, um die Luft zu entfernen. Dann gießen Sie den leichten Steigung in den Rücken Becher. </li><li> Schalten Sie den Magnetrührer, drücken Sie auf &quot;Spin&quot; auf dem COBE-Maschine, entnehmen Sie die Klemme den Schlauch zwischen den beiden Bechern und visuell überprüfen, ob die schweren und leichten Steigungen mischen. </li><li> Sobald die Gradienten begonnen Mischen, auf der Zentrifuge drehen. Warten Sie eine Minute, und dann an der Pumpe drehen, um die Vermischung Gradienten zu laden. </li><li> So laden Sie das Gewebe lassen die Steigung gering laufen in den vorderen Becher, aber nicht niedrig genug, damit die Luft, um das Laden Rohr geben, dann umzuspannen das Verbindungsrohr die Becher und laden das Gewebe. </li><li> Weiter Hinzufügen der Rest des Gewebes. Dann waschen die Röhre, die das Gewebe mit 50 ml Waschlösung gehalten, und es verwenden, um den vorderen Becher zu waschen. </li><li> Als letzter des Gewebes in die Tasche, stop gleichzeitig die Pumpe, Ausspannen am Pumpenkopf, und klemmen Schlauch über der Tasche. Weiterhin für 5 Minuten zentrifugiert. </li><li> Während der Zentrifugation weiter, bringen den 12-Röhrchen auf der Motorhaube und lockern ihre Mützen. Bringen Sie die Sammlung Schlauch an den gelben Schlauch, und legen Sie die sterile Sammlung Spitze in konischen Rohr 1. Dann Ausspannen den gelben Schlauch, und klemmen Sie die grüne Röhre. </li><li> Am Ende der Spin, langsam erhöhen Superout bis 100 auf. Sammeln Sie 150 ml in Röhrchen 1. Dann sammeln 30 ml in Röhrchen 2-12 (von 200 bis 230 ml). </li><li> Nach der vollständigen Erfassung abgeschlossen ist, drücken Sie &quot;STOP&quot; auf dem COBE. Jetzt, Reinigung beendet ist, können die kleinen Inseln beurteilt und kultiviert werden. </li></ol> 2. Sampling und Kultur <ol><li> Nach dem Sammeln der gereinigten Inseln Fraktionen, entfernen Sie eine Probe aus jedem der 12 Sammelröhrchen und Fleck mit Dithizon. Die Färbung wird zeigen, welche Schichten enthalten hochreine Inseln vs Schichten mit geringer Reinheit Inselchen. </li><li> Sammeln Sie die hohen und niedrigen Reinheit Gewebe und Pool jeweils zusammen. </li><li> Spin und waschen zweimal. Nach dem zweiten Waschen, bringen die Lautstärke der einzelnen zu 250 ml mit Final Wash Medien. </li><li> Zur Beurteilung der gepoolten Fraktionen beginnen, indem sie zwei 1 ml-Proben aus dem hohen der vereinigten Fraktionen und einer 1 ml Probe aus dem niedrig. Übertragen Sie jede 1ml Probe in einem konischen Rohr mit 9 ml Waschlösung. </li><li> Dann je 1 ml von je 15 ml Tube zu einem Zählschale. Untersuchen und zählen Sie die Zellen unter dem Mikroskop. </li><li> Nach Auszählung der Zellen zu berechnen die Anzahl der Flaschen benötigt, um Kultur der Inseln mit folgender Formel: (insgesamt EIN / Reinheit der Inseln in dezimal) / (30.000 EIN pro Flasche). Zum Beispiel sind 100.000 Inseln mit 90% Reinheit in 4-Kolben kultiviert. </li><li> Übertragen Sie die Inseln zu T175 Flaschen und Kultur in einem 37 ˚ C und 5% CO 2-Inkubator. </li></ol>

<ol><li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Nano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+for+allotransplantation%3A+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li>
<li>Barbaro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li>
<li>Fridell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li>
<li>Potdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li>
<li>Salehi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+islet+isolation+from+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).</li>
<li>Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+assessment+in+man+and+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetol+Lat%22%5BJournal%5D)">Islet isolation assessment in man and large animals.</a> Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).</li>
</ol>

Trotz erheblicher Fortschritte in der Technik der menschlichen Inselzellen isoliert bleiben Insel Ertrag sehr variabel und unvorhersehbar. Die Reinigung der verdauten Pankreasgewebe ist entscheidend, um eine ausreichende Insel Masse nach erfolgreicher enzymatische Verdauung für die Transplantation zu erholen. Die UIC Reinigungsverfahren wird empfohlen, da eine höhere Gewinnung von hochreiner menschlichen Inselchen mit dieser Methode nachgewiesen wurde. Darüber hinaus können bis zu 50 ml verdaute Gewebe in einem einzigen...

<table><tbody><tr><td>Zentrifuge</td><td>Ausstattung</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>424803</td><td></td></tr><tr><td>Cobe 2991 Cell Processor</td><td>Ausstattung</td><td>Gambro. BCT</td><td>2556</td><td>Reinigung von Inseln</td></tr><tr><td>MZ6 Invertiertes Mikroskop TLBD4.1</td><td>Ausstattung</td><td>Leica Microsystems</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschale mit 2-mm-Raster</td><td>Ausstattung</td><td>Nalge Nunc international</td><td>174926</td><td>Zählung von Inseln</td></tr><tr><td>Digital Sight DS L1</td><td>Ausstattung</td><td>Nikon Instruments</td><td>217267</td><td></td></tr><tr><td>COBE-Beutel</td><td>Einwegausrüstung</td><td>O.R. Solution</td><td>66707003</td><td></td></tr><tr><td>T175-Kulturkolben</td><td>Einwegausrüstung</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>83.1812.500</td><td></td></tr><tr><td>University of Wisconsin (UW)-Lösung</td><td>Reagenz</td><td>DURAMED</td><td>1000-46-06</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s gepufferte Salzlösung (HBSS)</td><td>Reagenz</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-597-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 1.100</td><td>Reagenz</td><td>Bichrom AG</td><td>L6155</td><td></td></tr><tr><td>M199-Medien (Spüllösung)</td><td>Reagenz</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-784-CM</td><td></td></tr><tr><td>Endspülung/Kulturmedium</td><td>Reagenz</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-785-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dithizon</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr></tbody></table>

menschliche inselzellen der bauchspeicheldrüse isolation: part ii: reinigung und kultur der menschenrechte islets

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management von Typ 1 Diabetes ist belastend, sowohl für den Einzelnen und die Gesellschaft, im Wert von über 100 Milliarden Dollar jährlich. Trotz der weit verbreiteten Verwendung von Glukose-Monitoring und neue Insulin-Formulierungen, viele Menschen immer noch zu entwickeln verheerenden Folgekomplikationen. Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Transplantation kann bei normalen Blutzuckerspiegels bei Diabetes-Patienten wiederherstellen<sup&gt; 1</sup&gt;, Ohne das Risiko schwerer Hypoglykämien, die mit einer intensivierten Insulintherapie assoziiert sind. Die ausreichende Insel Masse ist für eine erfolgreiche Inseltransplantation wichtig. Allerdings wirken sich Spender Eigenschaften, Orgel Beschaffung und Erhaltung der Isolation Ergebnis<sup&gt; 2</sup&gt;. An der University of Illinois at Chicago (UIC) entwickelten wir eine erfolgreiche Isolierung Protokoll mit einer verbesserten Reinigung Gradienten<sup&gt; 3</sup&gt;. Das Programm startete im Januar 2004 und mehr als 300 Isolierungen wurden bis November 2008 durchgeführt. Der Bauchspeicheldrüsen wurden in kaltem Konservierungslösungen geschickt (UW, University of Wisconsin-oder HTK, Histidin-Tryptophan Ketoglutarat)<sup&gt; 4-7</sup&gt; Zu den Cell Isolation Laboratory an UIC für Inselzellen isoliert. Langerhans-Inseln wurden isoliert mit der UIC-Methode, die eine modifizierte Version der Methode ursprünglich von Ricordi beschrieben wird<em&gt; Et al</em&gt;<sup&gt; 8</sup&gt;. Wie in Teil I: Die Verdauung und Sammlung von Pankreasgewebe wurde menschlichen Pankreas getrimmt, durchbohrt, perfundierten und verdaut. Nach dem Sammeln und mindestens 30 Minuten Inkubation in UW-Lösung wurde das Gewebe in der Feldtrenner geladen (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) für die Reinigung<sup&gt; 3</sup&gt;. Nach der Reinigung, Inselchen Ausbeute (ausgedrückt als Insel-Äquivalenten, IEQ), Gewebe Volumen und Reinheit wurde nach Standard-Methoden ermittelt<sup&gt; 9</sup&gt;. Isolierte Inseln wurden in CMRL-1066 Medien (Mediatech, Herndon, VA), mit 1,5% Humanalbumin, 0,1% Insulin-Transferrin-Selen (ITS), 1 ml Ciprofloxacin, 5 ml 1M HEPES ergänzt, und 14,5 ml von kultivierten 7,5% Natriumbicarbonat in T175-Kolben bei 37 ° C über Nacht Kultur vor Inselchen transplantiert wurden oder für Forschungszwecke verwendet.

Das Erreichen hoher Qualität und ausreichender Menge menschlicher Inselchen ist einer der führenden Voraussetzungen für eine erfolgreiche Inseltransplantation. In diesem Video, beschreiben wir Schritt für Schritt die Verfahren für die menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation (Teil II: Reinigung und Kultur der menschlichen Inseln) mit einer modifizierten automatisierte Methode.

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part II: Reinigung und Kultur der Menschenrechte Islets

Die Behandlung von Typ-1-Diabetes ist sowohl für den Einzelnen als auch für die Gesellschaft belastend und verursacht jährlich Kosten von über 100 Milliarden Dollar. Trotz der weitverbreiteten Anwendung von ...

In diesem Video wird zuvor isoliertes und verdauten Pankreasgewebe einer Dichtegradientenreinigung unterzogen, wodurch eine gereinigte Fraktion von Pankreasinseln erhalten wird, die letztendlich bis zur Transplantation in Zellkulturgefäßen kultiviert werden können. Hallo, ich bin American Chief aus dem Labor des Humanen Inselprogramms der Abteilung für Chirurgie an der University of Illinois in Chicago. Hallo, mein Name ist Barbara Barbero und ich bin ebenfalls für das Human Insel-Programm tätig.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Isolation menschlicher Pankreasinseln. Wir verwenden dieses Verfahren in unserer Einrichtung, um hochwertige menschliche Inseln für klinische Anwendungen zu gewinnen. Beginnen wir.Um mit der Ösen-Reinigungsprozedur zu beginnen, klemmen Sie alle Schläuche des COBE-Beutels außer dem grünen ab und stellen Sie die Drehzahl auf 1500 sowie die Super-Aus-Position auf null in der Abzugshaube ein. Richten Sie die Pumpe und die Gradientenbecher ein und verbinden Sie das Sammelrohr mit dem grünen Schlauch. Nun kann das Beladen der FI-Säule beginnen – Zentrifugation starten.Dann 110 Milliliter fi. hinzufügen. Rufen Sie den vorderen Becher an und starten Sie die

human-pancreatic-islet-isolation-part-ii-purification-culture-human

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das Erreichen hoher Qualität und ausreichender Menge menschlicher Inselchen ist einer der führenden Voraussetzungen für eine erfolgreiche Inseltransplantation. In diesem Video, beschreiben wir Schritt für Schritt die Verfahren für die menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation (Teil I: Verdauung und Sammlung von Pankreasgewebe) mit einem modifizierten automatisierte Methode.

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part I: Verdauung und Sammlung von Pankreasgewebe

Die Versorgung von Typ-2-Diabetes Inseln für die Forschung ist nicht ausreichend. Hier teilen wir unser Protokoll zur Isolierung von Inseln aus Patienten partielle Pankreatektomie. Dieser Ansatz stellt einen einzigartigen Ort für den Erhalt von kleinen Inseln von Typ 2 Diabetes und klinisch abgestimmt nicht-diabetischen Patienten in ausreichender Zahl für die Grundlagenforschung und klinische Studien.

Isolierung humaner Inselzellen aus teilweise Pankreatektomierten

Pankreasinseln, auch Langerhans-Inseln genannt, sind eine Ansammlung von endokrinen Zellen, die Hormone für die Glukoseregulierung und andere wichtige biologische Funktionen produzieren. Dieses Protokoll erklärt eine Methode zur Isolierung von Pankreasinseln, indem zuerst Kollagenase über Ampulla von Vater perfundiert wird, um das exokrine Pankreasgewebe zu verdauen, und eine vereinfachte Dichtegradientenzentrifugation, um die Inselzellen von Mäusen zu reinigen.

Isolierung von Pankreasinseln durch Kollagenase-Perfusion: Eine enzymatische Methode zur Isolierung von Pankreas-Inselzellen

Kritische Herausforderungen für die Diabetesforschung Bereich sind die molekularen Mechanismen zu verstehen, die Insel β-Zellreplikation regulieren und β-Zellregeneration zur Stimulierung der Methoden zu entwickeln. Hierin ist ein High-Content-Screening-Verfahren zur Identifizierung und der β-Zellreplikation fördernden Aktivität von kleinen Molekülen bewerten dargestellt.

Ein hoher Gehalt<em&gt; In Vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-Zell-Replikation-Discovery-Plattform

Hier beschreiben wir Einstellungen, um die zirkadiane Biolumineszenz und die sekretorische Aktivität von menschlichen Inselzellen und primären Myotuben parallel zu überwachen. Zu diesem Zweck verwendeten wir die lentivirale Genverabreichung eines Luciferase-Kernuhrreporters, gefolgt von einer in vitro Synchronisation und Sammlung des Ausflussmediums durch kontinuierliche Zellperifusion.

Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

Wir beschreiben ein Protokoll hier für intakte Inseln von neugeborenen Mäusen zu isolieren. Bauchspeicheldrüsen wurden teilweise mit Kollagenase, gefolgt von Waschen und Hand picking verdaut. 20-80 islet Cluster können pro Bauchspeicheldrüse von neugeborenen Mäusen erhalten werden, die für mehrere islet Studien geeignet sind.

Effektive Isolation von funktionellen Inselchen von Neonatal Maus Pancreas

Dieses Inselisolierungsprotokoll beschrieb einen neuartigen Weg der Kollagenase-Injektion zur Verdauung des Exokringewebes und ein vereinfachtes Gradientenverfahren, um die Inseln von Mäusen zu reinigen. Es beinhaltet enzymatische Verdauung, Gradiententrennung/Reinigung und Islet-Handpicking. Eine erfolgreiche Isolierung kann 250–350 hochwertige und voll funktionsfähige Inselchen pro Maus ergeben.

Ein einfaches Hocheffizienzprotokoll für die Isolierung von Pankreas-Isleten von Mäusen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Generierung hochwertiger, großflächiger Transkriptomdaten einzelner Zellen aus isolierten menschlichen Pankreasinseln unter Verwendung einer tropfenbasierten mikrofluidischen einzelligen RNA-Sequenzierungstechnologie vor.

Einzellige RNA-Sequenzierung und Analyse menschlicher Pankreas-Inseln

Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Entnahme einer Bauchspeicheldrüse des Schweins für die Isolierung und Reinigung von Inselzellen.

Chirurgische Perfusion und Isolierung der Bauchspeicheldrüse des Schweins zur Inselisolierung

Dieses Protokoll beschreibt eine standardisierte Methode zur chirurgischen Entnahme, enzymatischen Verdauung und Dichtegradientenreinigung von Lewis-Rattenpankreasinseln, die ertragreiche, hochreine Präparate für den direkten Einsatz bei Transplantationen oder in vitro-Studien ermöglicht.

Isolierung und Reinigung von Pankreasinseln bei Lewis-Ratten mittels enzymatischer Verdauung und Dichtegradiententrennung

Lernen Sie die modifizierte automatisierte Methode zur Reinigung und Kultur menschlicher Pankreasinseln. Dieses Verfahren liefert hochwertige Inselzellen für die klinische Transplantation bei Diabetes.

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part II: Reinigung und Kultur der Menschenrechte Islets

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