Name: In vivo Ca 2 + - Imaging von Pilzkörper Neuronen während olfaktorischen Lernen in der Honigbiene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Lernen Sie Calcium-Imaging von Pilzkörper-Neuronen bei der Honigbiene während olfaktorischen Lernens. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Aufnahmen neuronaler Aktivität und veranschaulicht die neuronalen Grundlagen des Lernens.

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Diese Arbeit wird von der DFG gefördert.

Bee Vorbereitung und Zurück-fill <ol><li> Fangen Honigbiene Sammlerinnen bei hive-und Chill auf Eis Immobilisierung. </li><li> Berg in Plexiglas Aufnahme Kammern 3. Fix Augen und Thorax an den Wänden der Aufnahme Kammer mit niedrigem Schmelzpunkt Hartwachs. </li><li> Ziehen von Glaskapillaren als gewöhnlich für Elektrophysiologie und brechen an der Spitze zu einer Spitze Durchmesser von ca. erhalten. 10 um. Abdeckung Spitze der Kapillare mit Farbpaste. Dye Paste besteht aus einem 10:1-Gemisch von Fura-2 Dextran und Lysin feststellbar Tetramethylrhodamin Dextran. </li><li> Für die Färbung immobilisieren Antennen mit Kleinigkeiten oder n-Eicosan. Nehmen Sie ein Stück Epidermis über dem Gehirn und schieben Drüsen und die Luftröhre zur Seite, um Zugang zu den Pilzkörper ermöglichen. </li><li> Inject Kapillaren entweder in die Soma oder axonalen Region Pilzkörper Neuronen. Dies kann frei Hand oder mit einem Mikro-Manipulator. Dann wieder Nagelhaut Stück auf Kopfkapsel und lockern Antennen. </li><li> Feed Bienen mit 30% Saccharose-Lösung vor dem Speichern in einem befeuchteten Fall für mindestens vier Stunden oder über Nacht bei 20 ° C. </li></ol> In-vivo-Imaging <ol><li> Verhindern Bewegungen der Biene z. B. mit einem kleinen Stück Schwamm, der gegen den Bauch gedrückt und fixiert mit einem Clip oder Band, um die Aufnahme Kammer. </li><li> Um zu verhindern, Bewegung des Gehirns, die sich aus Pumpen der Speiseröhre, schneiden einen kleinen Einschnitt in die Kutikula über dem Labrum und ziehen Sie vorsichtig die Speiseröhre und den umliegenden festen Strukturen, um es unter Spannung gesetzt, ohne die Speiseröhre 4. Deckel mit Zwei-Komponenten-Silikon. </li><li> Machen Sie Löcher mit einer Nadel und stecken Drahtelektroden für die Aufnahme von M17. </li><li> Entfernen Nagelhaut Stück, Luftröhre und Drüsen oberhalb des Gehirns. Saugen heamolymph im Kopf Kapsel mit einem Stück Papier. </li><li> Füllen Sie den Kopf Kapsel mit Zwei-Komponenten-Silikon. Es ist wichtig, dass das Gehirn vollständig bedeckt ist. </li><li> Legen Sie Biene auf Mikroskop-Bühne und geben Sie einen Tropfen von Wasser auf der Oberfläche des Silikons zu den Dip Objektiv des Mikroskops in den Tropfen eintauchen. Konzentrieren Sie sich auf gefärbte Neuronen. </li></ol> Odor Stimulation und Aufzeichnung von Signalen Olfaktometer: Wir verwenden einen Computer gesteuert, custom built Stimulationsgerät oder &quot;Olfaktometer&quot;, wie zuvor von Galizia und Vetter 3 beschrieben. Gerüche werden in einen konstanten Luftstrom in Richtung der Antennen gerichtet verdünnt. Jeder Reiz besteht aus einem 3-Fettsäuren Geruch Puls von 0.2ml Geruch gesättigte Luft. Die Stimulation Protokoll kann in der Aufnahme-Software TILLVision eingestellt werden. Mikroskop-und Imaging-Set-up: Wir verwenden ein Zeiss Fluoreszenzmikroskop. Die Bilder werden bei 25 ° C mit einer Sampling-Rate von 5 Hz mit einer TILL-Photonics Imaging-Gerät auf dem Mikroskop montiert aufgezeichnet. Calcium-Signale werden durch eine X60, 0,9 W Olympus dip Ziel mit einem Imago CCD-Kamera (640x480 Pixel, 4fach-on-Chip auf 160x120 Pixel Binning) aufgezeichnet. Fura-2 ist mit monochromatischem Licht von 340 und 380nm Wellenlänge für ratiometrische Messungen aufgeregt. Die Fluoreszenz wird durch einen 410 nm dichroitischen Spiegel und einem 440nm Langpassfilter erkannt. Die Parameter für die Aufnahme in die Aufnahme-Software eingestellt. Jede Messung dauert 10s und Belichtungszeit für die beiden Wellenlängen, die Intensität der Färbung in jedem Präparat eingestellt werden kann. M17-Aufnahme: Die Winkelmesser Muskel des Labium (M17) extrazellulär ist es, die Verhaltensreaktionen in Bezug auf das Lernen Monitor aufgezeichnet, dh die PRO 5, 6. Inject einen Kupferdraht in den Muskel in der Nähe der Mundwerkzeuge. Inject Masseelektrode ins Auge. Der Muskel Potentiale werden mit einem benutzerdefinierten Build-Vorverstärker verstärkt, digitalisiert und gespeichert auf einem Computer. Beginn des Stimulus wird durch das Olfaktometer ausgelöst. Data Analysis <ol><li> Während des Experiments: Die Aufnahmen der Calcium-Signal in einen Computer eingespeist und gespeichert werden. Die Aufnahme-Software ermöglicht TILLVision einer Erstprüfung der Signale, wie die Berechnung des Verhältnisses zwischen den Wellenlängen (340nm/380nm) und Berechnung von deltaf (Subtraktion des Ausgangswertes). </li><li> Bildverarbeitung mit eigens geschriebenen Programmen in IDL durchgeführt. Berechnen Verhältnis von Ca 2 +-Signale von 340nm und 380nm Messungen für jedes Pixel. Bestimmen Sie Hintergrundfluoreszenz (F) durch Mittelung über Frames vor dem Reiz und subtrahieren von der ratiometrische Signal (deltaf). </li><li> Um Region of Interest (ROI) zu definieren: Berechnen Sie Mittelwert von Frames während der Reiz und wenden Sie einen Tiefpassfilter (3X3px). Convert Graustufen auf false Farbskala. Bestimmen Aktivität in neuronalen Strukturen als Aktivität Spots in falsche Farbbilder und definieren als ROI. </li><li> Berechnen Sie die zeitliche Dynamik der aktiven Bereiche durch Mittelung der Pixel in der ROI über alle Frames ohne Filterung oder Korrektur. </li></ol> Zusammen mit der Fura-2 Dextran füllen wir die Neuronen mit den fixierbaren Farbstoff Rhodamin Dextran (&quot;Mini-ruby&quot;). Beide Farbstoffe haben das gleiche Molekulargewicht, sie sollten in den Neuronen co-lokalisiert werden. Weitwinkel-Bildgebung ermöglicht nur eine sehr begrenzte räumliche Auflösung, daher ist es empfehlenswert, die gefärbten Strukturen nach dem Experiment mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie zu untersuchen. <ol><li> Nach physiologische Messungen, sezieren Gehirn und zu fixieren. </li><li> Spülen in PBS und schrittweise entwässern in Ethanol und klar in Methyl Salycilat. </li><li> Für die konfokale Mikroskopie einbetten Gehirn in Methyl Salycilat. </li><li> Wir verwenden ein Leica TCS SP2-Mikroskop. Anregungswellenlänge 543nm. </li><li> Wir scannen das Gehirn mit einem Luft-oder Ölimmersionsobjektiv und vergleichen Sie die gefärbten Strukturen mit den Bilddaten. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Wenn die Färbung und die Vorbereitung erfolgreich war, wird das Signal in falsche Farbskala, zum Beispiel in Pilzkörper alpha lobe extrinsischen Neuronen, könnte wie in Abbildung 1 aussehen. Die Verhaltensreaktion (PER) als Spike-Frequenz während der Reiz minus Spikefrequenz vor dem Reiz (Abbildung 2) berechnet werden. Die gefärbten Strukturen können in größerem Detail mit einem konfokalen Mikroskop (Abbildung 3) untersucht werden. <img src="/files/ftp_upload/1353/figure1_new.png" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Repräsentative Calcium Imaging-Signale (Stimulation mit Heptanal). A: abgebildeten Bereich der Biene Gehirn. B: Raw Fluoreszenzbild wie durch ein X20 dip Ziel bei 380nm Anregungswellenlänge gesehen, ist die alpha-Lappen der Pilzkörper in lila dargestellt. Dye wurde in den ventro-lateralen Rand des alpha-Lappen injiziert, um extrinsische Neurone Fleck. C: Falschfarben-Bild aus dem durchschnittlichen Signal, deltaf (340/380), während die drei zweiten Reiz gewonnen; alpha-Lappen in lila dargestellt, erläutert ausgewählten ROI in schwarz. D: Zeitliche Dynamik der Kalzium-Signal in Reaktion auf Duftpuls, durchschnittliche Signal aus der Region von Interesse, da in C. E angegeben: Zeitliche Dynamik der Kalzium-Signal in Reaktion auf Saccharose Stimulation der ipsi-und kontralateralen Antenne bzw. der ROI angegeben in C. <img src="/files/ftp_upload/1353/figure2_new.png" alt="" /> Abbildung 2: Repräsentative M17 Reaktion. Nach olfaktorischen Konditionierung der Biene erweitert den Rüssel, wenn der Geruch ohne Belohnung wird vorgestellt. Rote Linie zeigt Geruch Reiz. Inset: PER der Honigbiene. <img src="/files/ftp_upload/1353/figure3_new.png" alt="" /> Abbildung 3: Repräsentative Bildstapel. Nach dem Imaging-Experiment wurde das Gehirn seziert. Das Neuron aus Abbildung 1 wird gescannt mit einem konfokalen Mikroskop mit einem X20 Ölimmersionsobjektiv, alpha-Lappen in lila dargestellt.

<ol><li>Joerges, J., Küttner, A., Galizia, C. G., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representations+of+odors+and+odor+mixtures+visualized+in+the+honeybee+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Representations of odors and odor mixtures visualized in the honeybee brain.</a> Nature. 387 (6630), 285-288 (1997).</li>
<li>Rehder, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+honeybee%27s+proboscis+reflex+by+electromyiographic+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of the honeybee's proboscis reflex by electromyiographic recordings.</a> J. Insect Physiol. 33, 501-507 (1987).</li>
<li>Galizia, C. G., Vetter, R. S. Optical Methods for Analyzing Odor-Evoked Activity in the Insect Brain. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGalizia%2C+CG+%22Methods+in+Insect+Sensory+Neuroscience%22">Methods in Insect Sensory Neuroscience</a>. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 345-388 (2004).</li>
<li>Mauelshagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+correlates+of+olfactory+learning+paradigms+in+an+identified+neuron+in+the+honeybee+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Neural correlates of olfactory learning paradigms in an identified neuron in the honeybee brain.</a> J Neurophysiol. 69 (2), 609-625 (1993).</li>
<li>Kuwabara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bildung+des+bedingten+Reflexes+von+Pavlovs+Typus+bei+der+Honigbiene+Apis+mellifica%2C+Hokaido+Univ%5BTitle%5D)+AND+%22Zool.+J.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bildung des bedingten Reflexes von Pavlovs Typus bei der Honigbiene Apis mellifica, Hokaido Univ.</a> Zool. J. Sci. 13, 458-464 (1957).</li>
<li>Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+conditioning+of+proboscis+extension+in+honeybees+%28Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Psychology%22%5BJournal%5D)">Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera.</a> Journal of Comparative Psychology. 97 (2), 107-119 (1983).</li>
</ol>

In dieser Präsentation haben wir alle Schritte gegangen, um in vivo Calcium-Signale in der Honigbiene zu untersuchen. Wir wandten diese Technik auf Pilzkörper Neuronen, sondern Bildgebung kann auf alle Neurone, für die eine Maltechnik hergestellt werden kann getan werden. Wir haben auf Neuronen im olfaktorischen Weg der Honigbiene konzentriert. Die Experimente sind in einer Dunkelkammer durchgeführt. Die Einrichtung ist mit einem langwelligen Licht, das aus Lügen der optischen Wahrnehmung Bereich der Biene und ...

<table><tbody><tr><td>harte Wachssorte mit niedrigem Schmelzpunkt Deiberit 502</td><td>Dr. B&amp;#246;hme Sch&amp;#246;ps Dental GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FURA-2 Dextran-Kaliumsalz, 10 000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>F-3029</td><td>Vor Licht schützen.</td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamin-Dextran, 10 000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D-3312</td><td>Vor Licht schützen.</td></tr><tr><td>n-Eicosan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21, 927-4</td><td></td></tr><tr><td>Kwik Sil Haftmittel</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>KWIK SIL</td><td></td></tr><tr><td>Bildgebungsaufbau</td><td>TILL Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD-Kamera</td><td>Imago</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CED</td><td>Texas Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo ca 2 + - imaging von pilzkörper neuronen während olfaktorischen lernen in der honigbiene

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Die in-vivo-und semi-in vivo Vorbereitung für Calcium Imaging hat in unserem Labor durch Joerges, Küttner und Galizia entwickelte vor über zehn Jahren, um Gerüche zu evozierte Aktivität im Antennallobus 1 zu messen. Von da an wurde kontinuierlich weiterentwickelt und an verschiedenen neuropiles in der Biene Gehirn. Hier beschreiben wir die Vorbereitungen derzeit im Labor verwendet werden, um Aktivität in Pilzkörper Neuronen mit einem Dextran gekoppelt Calcium-sensitiven Farbstoff (Fura-2) zu messen. Wir retrograd Fleck Pilzkörper Neuronen durch die Injektion von Farbstoff in ihre Axone oder soma Region. Wir konzentrieren uns auf die Verringerung der Invasivität zu konzentrieren, eine Vorbereitung, in denen es immer noch möglich, die Biene mit PER Klimaanlage Zug zu erreichen. Wir sind in der Lage zu überwachen und zu quantifizieren, die Verhaltensreaktion durch die Aufnahme elektro-myograms aus dem Muskel, die die PRO (M17) 2 steuert. Nach dem physiologischen Experiment die abgebildeten Strukturen sind in größerem Detail mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie, die Identität der Neuronen-Adresse untersucht.

Bienen können in einer appetitive olfaktorischen Lernparadigma (PER-Konditionierung) konditioniert werden. Mit Gerüche als Stimuli, haben wir ein Verfahren, bei welchem ​​Verhalten aufgezeichnet, während gleichzeitig Calcium Imaging wird verwendet, um Geruchs-evozierte Aktivität im Pilzkörper Neuronen zu messen ist<em&gt; In vivo</em&gt;.

In vivo Ca 2 + - Imaging von Pilzkörper Neuronen während olfaktorischen Lernen in der Honigbiene

Die in vivo- und semi-in vivo-Präparation für das Calcium-Imaging wurde vor über zehn Jahren in unserem Labor von Joerges, Küttner und Galizia entwickelt, um ...

Dieses Verfahren beginnt mit der Fixierung der Biene in einer Ableitungskammer. Ein Stück Cuticula wird aus der Kopfkapsel entfernt, um ausgewählte Strukturen im Gehirn zu färben. Kalziumsignale in den gefärbten Neuronen werden in vivo mithilfe einer Weitfeld-Abbildungsanordnung aufgezeichnet.Während der Bildgebung kann die Biene mit Gerüchen oder einer Zuckeraufgabe an der Antenne stimuliert werden. Auf diese Weise kann die Biene konditioniert werden, den Rüssel als Reaktion auf einen Geruch auszustrecken. Die Rüsselausstreckreaktion wird mittels Elektromyogrammaufnahmen vom Muskel M 17 überwacht.Nach dem Abbildungsexperiment wird das Gehirn zur genaueren Untersuchung der gefärbten Strukturen mittels konfokalem Mikroskop disseziert. Hallo, ich bin Melanie vom Labor von rdo Mansel. Hallo, ich bin Anya, ebenfalls vom Mansel-Labor.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für die in-vivo-Kalziumbildgebung im Pilzkörper der Honigbiene. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Geruchscodierung und lernbezogene Plastizität im Gehirn der Honigbiene zu untersuchen. Beginnen wir also.Fangen Sie zunächst eine Honigbienen-Sammlerin am Flugloch und immobilisieren Sie sie, indem Sie

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Wir beschreiben eine etablierte Technik zur Messung und Analyse Gerüche hervorgerufene Kalzium-Reaktionen im Antennallobus...

Calcium Imaging von geruchs-evozierte Potentiale in der Drosophila Antennallobus

Dieses Video beschreibt die In-vivo-Calcium-Bildgebung in Drosophila-Neuronen mit GCaMP. Der vorgestellte Protokollclip zeigt, wie Veränderungen der GCaMP-Fluoreszenz von Pilzkörperneuronen während eines olfaktorischen Konditionierungsexperiments aufgezeichnet werden können.

Drosophila In Vivo Calcium Imaging: Eine Methode zur funktionellen Bildgebung neuronaler Aktivität

Dieses Video demonstriert eine Methode zur in vivo Kalziumbildgebung mit synaptisch lokalisierten Kalziumsensoren in Fliegen. Es beschreibt die Schritte zur Vorbereitung der Fliegen für die Mikroskopie, zur Durchführung der olfaktorischen Konditionierung und zur Visualisierung des geruchsinduzierten Kalziumeinstroms.

im lebenden Organismus Calcium-Imaging mit synaptisch lokalisierten Calciumsensoren in Drosophila melanogaster

Dieses Video zeigt ein detailliertes Immunfärbeprotokoll zur Visualisierung phänotypischer Defekte in den Pilzkörpern mutierter Drosophila-Gehirne. Das Protokoll beinhaltet die Verwendung von Antikörpern gegen Fas2, ein Protein, das an der axonalen Führung beteiligt ist und die richtige morphologische und funktionelle Entwicklung des Pilzkörpers erleichtert.

Visualisierung von Pilzkörperneuronen in Drosophila-Gehirnen durch Immunfärbung

Gleichzeitige extrazellulären langfristige Aufnahmen von zwei verschiedenen Hirn Neuropile oder zwei unterschiedliche anatomische Bahnen wurden in Honigbienen etabliert. Diese Aufnahmen ermöglichen die Untersuchung der zeitlichen Aspekte der neuronalen Verarbeitung zwischen verschiedenen Hirnregionen an der einzelnen Neurons als auch auf Ebene des Ensembles in einem Tier verhalten.

Gleichzeitige Langzeit-Aufnahmen auf zwei neuronale Verarbeitungsstufen in Behaving Honigbienen

Hier präsentieren wir eine neuartige Ca 2+ -Imaging Ansatz unter Verwendung eines Biolumineszenz Reporter. Dieser Ansatz verwendet einen fusionierten Konstrukts GFP-Aequorin, das Ca 2+ bindet und emittiert Licht, wodurch die Notwendigkeit für Lichtanregung. Deutlich Dieses Verfahren ermöglicht lange kontinuierliche Bildgebung, Zugang zu tiefen Hirnstrukturen und hoher zeitlicher Auflösung.

In Vivo Functional Brain Imaging Ansatz, der auf Bioluminescent Calciumindikator GFP-Aequorin

Um die hemmende Wirkung von pharmakologische Agenten auf Phospholipase C (PLC) in verschiedenen Regionen des Gehirns Honigbiene zu testen, stellen wir einen biochemischen Assays um PLC-Aktivität in diesen Regionen zu messen. Dieser Test könnte nützlich für den Vergleich von PLC-Aktivität bei Geweben, sowie bei den Bienen, die unterschiedliche Verhalten ausstellen.

Erkennung von Phospholipase C Aktivität im Gehirn Homogenat von der Honigbiene

Hier stellen wir ein Protokoll vor, mit dem vor- und/oder postsynaptisches Kalzium im Kontext des Drosophila-Lernens und -Gedächtnisses visualisiert werden kann. In vivo Kalzium-Bildgebung mit synaptisch lokalisierten Kalziumsensoren wird mit einem klassischen olfaktorischen Konditionierungsparadigma kombiniert, so dass die synaptische Plastizität, die dieser Art des assoziativen Lernens zugrunde liegt, bestimmt werden kann.

In Vivo Optische Calcium-Bildgebung der lerninduzierten synaptischen Plastizität bei Drosophila melanogaster

Wir beschreiben hier Methoden zur Induktion und Analyse des olfaktorischen erfahrungsabhängigen Umbaus von synaptischen Glomeruli des Antennenlappens im juvenilen Gehirn von Drosophila .

Erfahrungsabhängiger Umbau der synaptischen Konnektivität von olfaktorischen sensorischen Neuronen im juvenilen Gehirn in einer kritischen Phase im frühen Leben

Ein wesentliches Hindernis für die Untersuchung der zellulären Aktivität während kognitiver Prozesse wie Lernen und Gedächtnis ist die Verwendung von Anästhetika für die Vorbereitung von In-vivo-Bildgebung . Die Anästhesie beeinträchtigt das Kurzzeitgedächtnis und die Kognition in mehreren Modellen, einschließlich Drosophila. Diese Studie stellt eine einzigartige Methode zur Vorbereitung adulter Drosophila für die In-vivo-Bildgebung ohne Anästhesie vor.

Im lebenden Organismus Bildgebung der neuronalen Aktivität in nicht anästhesierten erwachsenen Drosophila-Fliegen

Wir stellen Calcium-Bildgebungsprotokolle  für ein Drosophila-Larven-Geruchsneuron vor, bei denen ein topischer Gewebekleber zur Immobilisierung verwendet wird. Diese Methode erhöht die Stabilität und ermöglicht zuverlässige in-vivo- und ex-vivo-Experimente. Benutzerdefinierte R-Skripte analysieren Kalziumsignale und bieten eine effiziente Plattform für detaillierte neurophysiologische Forschung.

In-vivo- und ex-vivo-Calcium-Bildgebung eines Neurons des olfaktorischen Schaltkreises in der dritten Larve von Drosophila melanogaster im dritten Stadium

Lernen Sie Calcium-Imaging von Pilzkörper-Neuronen bei der Honigbiene während olfaktorischen Lernens. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Aufnahmen neuronaler Aktivität und veranschaulicht die neuronalen Grundlagen des Lernens.

In vivo Ca ^{2 +} - Imaging von Pilzkörper Neuronen während olfaktorischen Lernen in der Honigbiene

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