In vivo Ca ^{2 +} - Imaging von Pilzkörper Neuronen während olfaktorischen Lernen in der Honigbiene

Bienen können in einer appetitive olfaktorischen Lernparadigma (PER-Konditionierung) konditioniert werden. Mit Gerüche als Stimuli, haben wir ein Verfahren, bei welchem ​​Verhalten aufgezeichnet, während gleichzeitig Calcium Imaging wird verwendet, um Geruchs-evozierte Aktivität im Pilzkörper Neuronen zu messen ist

Dieser Vorgang beginnt mit der Fixierung der Biene in einer Aufzeichnungskammer. Aus der Kopfkapsel wird ein Stück Nagelhaut entnommen, um ausgewählte Strukturen im Gehirn zu färben. Die Kalziumsignale in den gefärbten Neuronen werden in vivo mit Hilfe eines Weitfeld-Bildgebungsaufbaus aufgezeichnet.

Während der Bildgebung kann die Biene mit Gerüchen stimuliert oder Saccharose an die Antenne abgegeben werden. Auf diese Weise kann die Biene darauf konditioniert werden, den Rüssel als Reaktion auf einen Geruch auszufahren. Die Reaktion auf die Nasenstreckung wird mit Hilfe von Elektromyogrammaufnahmen des M. 17-Muskels überwacht.

Nach dem bildgebenden Experiment wird das Gehirn präpariert, um die gefärbten Strukturen mit einem konfokalen Mikroskop genauer zu untersuchen. Hallo, ich bin Melanie aus dem Lab von rdo Mansel. Hallo, ich bin Anya, auch vom Mansel Lab.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur in vivo Calcium-Bildgebung und den Körper des Honigbienenpilzes. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die olfaktorische Kodierung und lernbezogene Plastizität im Gehirn von Honigbienen zu untersuchen. Also lasst uns loslegen.

Beginnen Sie damit, eine Honigbiene am Eingang des Bienenstocks zu fangen und sie dann bewegungsunfähig zu machen, indem Sie sie auf Eis kühlen. Montieren Sie als Nächstes die Biene auf eine Plexiglas-Aufnahmekammer. Verwenden Sie Hartwachs mit niedrigem Schmelzpunkt, um die Augen und den Thorax an der Wand zu befestigen.

Alle brechen an der Spitze eine Glaskapillare, um einen Durchmesser von 10 Mikrometern zu erhalten. Bedecken Sie die Spitze der Kapillare mit einer Paste d, die aus einer Mischung von 10 zu 1 URA, zwei Dextrin und fixierbarem Rodindextrin besteht. Die vorbereitete Kapillare wird für die Färbung verwendet.

Um mit dem Färbevorgang zu beginnen, immobilisieren Sie zunächst die Antennen mit einer Koane. Öffne die Kopfkapsel über dem Gehirn, indem du ein Stück Nagelhaut entfernst und die Drüsen und die Luftröhre zur Seite schiebst, um den Zugang zum Pilzkörper zu ermöglichen. Verwende ein Blatt Papier, um die Hämolymphe in der Kopfkapsel aufzusaugen.

Um Pilzkörperneuronen zu färben, injizieren Sie die Kapillare entweder in das Soma oder in die dendritische Region der Neuronen. Stellen Sie dann das Nagelhautstück auf der Kopfkapsel wieder her und lösen Sie die Antenne. Zum Schluss füttern Sie die Biene mit 30%iger Saccharoselösung und lagern Sie sie in einer mit einem nassen Küchentuch abgedeckten Styroporbox für mindestens vier Stunden oder über Nacht bei 20 Grad Celsius.

Wenn die B-Präparation abgeschlossen ist, können wir mit der In-vivo-Bildgebung beginnen. Verwenden Sie zunächst einen Schwamm, der an der Aufnahmekammer befestigt ist, um zu verhindern, dass sich die Biene bewegt, und drücken Sie ihn gegen den Bauch. Befestigen Sie nun die Antennen der Biene mit einem Ioan, um zu verhindern, dass sich das Gehirn durch das Pumpen der Speiseröhre bewegt.

Schneiden Sie einen kleinen Schnitt in die Nagelhaut oberhalb des Labrums und ziehen Sie vorsichtig die Speiseröhre und die sie umgebenden festen Strukturen heraus und bedecken Sie sie mit zwei Komponenten Silikon. Als nächstes bohren Sie mit einer Nadel Löcher für das Einführen von Drahtelektroden, die zur Aufzeichnung von Elektrogrammen aus dem Winkelmesser des Labiums verwendet werden. Entfernen Sie das Nagelhautstück, die Luftröhre und die Drüsen über dem Gehirn.

Verwenden Sie ein Blatt Papier, um das Blut in der Kopfkapsel aufzusaugen, um Elektrogramme von M 17 aufzuzeichnen. Injiziere einen Kupferdraht in den Muskel in der Nähe der Mundwerkzeuge. Injizieren Sie eine Masseelektrode in das Auge.

Füllen Sie nun die Kopfkapsel mit Zweikomponenten-Silikon. Achten Sie darauf, dass das Gehirn vollständig bedeckt ist. Legen Sie die Biene auf den Mikroskoptisch und geben Sie einen Tropfen Wasser auf die Oberfläche des Silikons.

Tauchen Sie das Tauchobjektiv des Mikroskops in das Tröpfchen und fokussieren Sie dann auf die Neuronen der Bühne. Nachdem die Vorbereitung für die In-vivo-Bildgebung abgeschlossen ist, können wir nun die Geruchsstimulation und Signalaufzeichnung beschreiben. Um der Biene Geruchsreize zukommen zu lassen, verwenden wir ein computergesteuertes, speziell angefertigtes Olfaktometer, um Geruchsstoffe zu einem konstanten Luftstrom zu verdünnen.

Die auf die Antenne gerichtete Geruchsstimulation besteht aus einem dreisekündigen Impuls aus geruchsgesättigter Luft. Für die Kalziumbildgebung verwenden wir einen Til-Photonik-Bildgebungsaufbau, der an einem zes-Fluoreszenzmikroskop montiert ist, um Bilder bei Raumtemperatur mit einer Abtastrate von fünf Hertz aufzunehmen. Die Kalziumsignale werden über ein X 60 0,9 W Olympus Dip-Objektiv mit Ango CCD-Kamera aufgezeichnet, jede Messung dauert 10 Sekunden.

Die Muskelpotentiale werden mit einem Grasverstärker verstärkt und mit einem analogen Digitalwandler aufgezeichnet und digitalisiert. Aufzeichnungen von M 17 werden verwendet, um Verhaltensreaktionen im Zusammenhang mit dem Lernen zu überwachen, nachdem die Signalaufzeichnung abgeschlossen ist, können wir nun zur morphologischen Analyse und Rekonstruktion übergehen. Denn beide Farbstoffe, die bei der Verfüllung verwendet werden, haben das gleiche Molekulargewicht.

Sie befinden sich in den Neuronen. Die Weitfeld-Bildgebung hat eine begrenzte räumliche Auflösung, daher verwenden wir die konfokale Rastermikroskopie, um die gefärbten Strukturen zu untersuchen. Nach dem Experiment sezieren Sie zuerst das Gehirn und fixieren es am nächsten Tag über Nacht in 4%Formaldehyd bei vier Grad Celsius, spülen Sie es in PBS ab und dehydrieren Sie es dann in Ethanolschritten 10 Minuten in 50%70%90%99%und zweimal 10 Minuten in 100%Legen Sie das Gehirn auf einen gerillten Objektträger mit einem Tropfen Methylsalicylat-Abdeckung. Schieben Sie es hinein und legen Sie es dann auf den Mikroskoptisch eines konfokalen Rastermikroskops.

Scannen Sie das Gehirn mit einem Luftobjektiv und einem 1,1- bis 1,2-Zoll-Digitalzoom in optischen Schnitten von vier Mikrometern. Hier sehen wir die Reaktion der extrinsischen Neuronen des Pilzkörpers auf die Geruchsstimulation der Antennen, die durch ein 60-faches Objektiv aufgezeichnet und in Falschfarben visualisiert wurde. Das rote Quadrat links stellt die Persistenz des Geruchsreizes dar.

Nach dem Experiment wird das Gehirn präpariert und die Färbestrukturen werden mit einem Konfokalmikroskop bei 20-facher Vergrößerung genauer untersucht. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Pilzkörperneuronen in der Honigbiene während des olfaktorischen Lernens abbilden können. Bei diesem Verfahren ist zu beachten, dass Experimente mit lichtempfindlichen Farbstoffen im Dunkeln durchgeführt werden müssen.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihren Experimenten. Auf Wiedersehen.