Name: Vorbereitung der Aplysia Sensory-Motor neuronalen Zellkulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 27 s
Description: Lernen Sie die Mikrodissektion sensorischer und motorischer Neuronen aus Aplysia-Ganglien für Synapsenforschung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung synaptischer Plastizität in vitro.

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Die Arbeit im Labor mit der Kultivierung von Aplysia ist nach Liste NIH R01 und NIH R21MH077921 finanziert.

Vorbereitung (siehe Lösungen Abschnitt am Ende des Protokolls für die Zusammensetzung von Lösungen) <ol><li> Bereiten Kulturschalen. Beschichtung von Glas und von Mattek Glasboden-Kulturschale mit Poly-L-Lysin (made in Natriumborat). Add genug, um vollständig zu bedecken das Glas gut und lassen für&gt; 1 Std. (über Nacht bleiben). Gründlich von Poly-L-Lysin durch Spülen in künstlichem Meerwasser (ASW) 4-5 mal. Nach dem Entfernen der letzten Spülgang, fügen Sie 2 ml 50% L15 (ergänzt mit Salzen und mit L-Glutamin in einer Endkonzentration von 2 mM) / 50% Hämolymphe. Das Kulturmedium muss in Schale für mindestens eine Stunde vor dem Beschichten Zellen, so dass die Hämolymphe Schichten der Schale. </li><li> Reinigen Sie die Werkzeuge und Sylgard Gerichte mit Ethanol, spülen Sie sie gründlich mit ddH 2 0 und sie dann für&gt; 1 h unter UV-Licht in die Kultur Kapuze. </li><li> Bereiten scharfen Elektroden für die Mikrodissektion von Neuronen. Mit einer Mikroelektrode Abzieher (z. B. Sutter Flaming Brown P-97), ziehen Glaspipette Elektroden mit 1,5 mm Außendurchmesser, 0,86 bis 1,12 mm Innendurchmesser und 100 mm Länge (z. B. AM-System Katalog # 628000; World Precision Instruments TW150-4, 1,55 / 1,12). Verwenden Sie Parameter, die eine Elektrode herzustellen mit einer langen und wispy feine Spitze eines solchen hohen Widerstand, dass es keine Kapillare Aufnahme von Flüssigkeit, wenn sie in Lösung gebracht. Die Anwesenheit einer Flüssigkeit Meniskus bedeutet, dass die Spitze der Elektrode wird Neuron während der Isolierung beschädigt werden. Die Sutter-Elektrode Kochbuch bietet eine hervorragende Richtlinien zum Einrichten Elektrode Programme. Wir verwenden ein Feld Filament, und in einem Schritt zu ziehen, um Kultur-Elektroden zu erzeugen. </li><li> Bereiten Anästhesie-Lösung (0,35 M MgCl2), Kulturmedium (L15 ergänzt mit Salzen und Hämolymphe) und Protease-Lösung (1% Protease Typ IX, Sigma, 1 Einheit / mg, bis zu einer Endkonzentration von 10 Einheiten / ml). </li><li> Tiere: Nutzung Erwachsenen 80-100 g Aplysia zur Isolierung von sensorischen Neuronen und der LFS Motoneuronen. Verwenden Sie juvenile 1-4 g Aplysia zur Isolierung von L7 Motoneuronen. Entfernen Sie die Tiere vorsichtig aus dem Meerwasserbecken und pflegen in Meerwasser (im Becher, Eimer oder Beutel) für nicht mehr als 30 Minuten vor Beginn der Narkose und Kultur Verfahren. </li></ol> Kultur Verfahren A. Kultivierung Pleural sensorischen Neuronen von 80 bis 100 g Aplysia <ol><li> Anesthetize die Tiere für die Entfernung von Ganglien: Inject 0,35 M MgCl 2 zu erwachsenen Aplysia (80-100 g) mit einer 60 ml Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel 1,5 Zoll. Geben Sie den Fuß des Tieres in einem Winkel von etwa 35 Grad, und nicht zu tief ein. Das Ziel ist, in die hemocoel des Tieres ohne Durchdringung der inneren Organe zu injizieren. Das Tier sollte sich sehr aufgetrieben und entspannt. </li><li> Präparieren Sie die Ganglien: Pin am narkotisierten Tier auf dem Seziertisch Schale, mit einem Stift (18-Gauge-Nadeln eignen sich gut für 80-100 g Tiere) an der Spitze und der Schwanz, und der Fuß nach oben zeigt. Halten Sie den Fuß mit einem gezahnten Pinzette und Durchtrennung der Haut und des darunterliegenden Bindegewebes die volle Länge des Fußes (von Kopf bis Schwanz) mit einer chirurgischen Schere. Pin beiden Seiten nach unten. Mit einer Pinzette und Schere, schnitt der Speiseröhre und ziehen Sie zur Seite, um die Ganglien aussetzen. Mit einer feinen Pinzette und einer feinen Schere, schneiden Sie die Pleura Pedalganglien (die sensorischen Neuronen im Pleuralganglien). Lassen Sie eine angemessene Menge Nerven, da dies macht es einfacher, festzunageln die Ganglien nach Protease-Behandlung. </li><li> Proteaseverdau Ganglien: Legen Sie die Ganglien in Protease-Lösung (10 mg / ml von 1 Einheit / mg in L15) in einem Inkubator eingestellt auf 34,5 ° C (34-35 ° C ist okay) für 2 Stunden und 15 Minuten. Mit der feinen Spitze einer Pinzette zu übertragen und waschen Sie die Ganglien in ASW dreimal. Halten Sie die Ganglien in L15. Beachten Sie, dass die Protease Inkubationszeit kann variieren. Der Zweck ist es, das Bindegewebe zu leicht entfernt werden. Wenn es zu schwierig desheath die Ganglien ohne Beschädigung der Neuronen ist, erhöhen Sie die Protease Inkubationszeit. Wenn es extrem einfach zu desheath ist die Ganglien und der Neuronen sind &quot;weiche&quot;, reduzieren die Protease Inkubationszeit. </li><li> Desheathing die Ganglien: Transfer der Protease verdaut Ganglien zu einer 60 mm oder 35 mm Schale mit Sylgard und L15. Profil unter einem Stereomikroskop (mit externen Halogenbeleuchtung), zu entfernen Pedalganglien und Stift auf der Pleuralganglien in der Sylgard Gericht in der richtigen Orientierung mit Insekten Pins und einer feinen Pinzette. Mit dem feinen Pinzette und eine Vanna chirurgische Scheren, heben das Bindegewebe und schneiden Sie es auf die sensorische Cluster aussetzen. Achten Sie darauf, jemals zu berühren oder Schäden der neuronalen Somata. Entfernen Sie überschüssiges Bindegewebe aus der Schüssel und fügen Sie mehr Medium, achten Sie darauf, niemals aussetzen desheathed Ganglion in die Luft. Die sensorische Cluster besteht aus rund 200 Cluster-Neuronen von 40-50 Mikrometer Durchmesser. Setzen Sie einen Stift zu einer &quot;post&quot; in kurzer Entfernung machen aus dem GanglIon (im Blickfeld). </li><li> Isolation von Neuronen: Die Verwendung von langen, scharfen Glas Kultur Elektrode, ziehen Sie die identifizierten Neuronen eins nach dem anderen durch Berühren der Zellkörper nur aus der Mitte (nicht durchbohren) und langsam und stetig zieht die Zelle soma, zusammen mit dem Axon, weg von der Ganglion. Vorsichtig gegen den Stift tippen, um die Neuronen von der Elektrode zu entfernen. </li><li> Plating Neuronen: Verwenden Sie eine Pipetman (P10) zu einzelnen Neuronen aus dem Sylgard Gericht zu übertragen, um eine Kulturschale. Vor der Übertragung der Neuronen, pipet Kulturmedium in die Spitze, so dass die Spitze aus Kunststoff mit Hämolymphe beschichtet ist (dies verhindert, dass die Neuronen Ankleben an der Plastik). Achten Sie vor allem vermeiden, dass die Neuronen, um mögliche Luftblasen oder einen extremen Kräften (dh sehr vorsichtig aufnehmen und entfernen Sie die Neuronen aus dem pipetteman). Verteilen Sie die Neuronen gleichmäßig über die Schüssel. Mit einem scharfen Elektrode vorsichtig und gerade die Prozesse, und tippen Sie sie nach unten. </li><li> Inkubation: Lassen Sie die Gerichte auf Mikroskoptisch bei Raumtemperatur nicht weniger als 3 Stunden. Wir routinemäßig lassen Sie sie über Nacht. Stellen Sie sicher, dass der Mikroskoptisch während dieser Zeit ist unbeirrt. Decken Sie die Bühne mit Aluminiumfolie vor Licht zu schützen. Gently übertragen Sie sie auf einem 18 ° C Inkubator. </li><li> Kulturen sollte das Gericht innerhalb von ca. 3 Stunden halten und neue Neuritenwachstum sollte innerhalb etwa 6-12 Stunden sichtbar. Das Wachstum der isolierten sensorischen Neuronen ein Plateau erreicht, von DIV 3 oder 4. Beachten Sie, dass isolierte sensorischen Neuronen doe nicht bilden autapses oder chemische Synapsen miteinander, obwohl sie bilden elektrische Gap Junctions zu tun. </li></ol> B. Herstellung von sensorischen Neuronen-Motoneuronen Kokulturen Sensorische Neuronen bilden Synapsen mit Ziel-Motoneuronen in der Kultur. Die am häufigsten verwendeten motorischen Neuronen sind die LFS Motoneuronen und die L7-Motor Neuron, von der Abdominalganglion. Die LFS Motoneuronen sind von Erwachsenen (80-100 g) Aplysia isoliert, und es gibt ca. 20 LFS Motoneuronen pro Abdominalganglion. Der L7-Motor Neuron ist aus juvenile (1-4 g) Tieren isoliert, und es gibt nur eine L7 pro Bauchganglien. LFS Motoneuronen sind 40-50 Mikrometer im Durchmesser, gehören zu den LE sensorischen Neuronen in der Nähe der Wurzel des Siphons Nerven auf der ventralen Oberfläche des Bauchganglien durchsetzt, und zeichnen sich durch eine subtile dunkles Pigment vor Ort in jedem Soma aus. Das L7 Motoneuronen: 100-150 Mikrometer im Durchmesser und ist auf der dorsalen Oberfläche des Ganglion, auf der mittleren Rand der linken Seite des Ganglion. Zwar ist es wirtschaftlicher, LFS Motoneuronen verwendet wird, ist die Größe des L7 Motoneuronen vorteilhaft für einige Experimente. Die L11 Motoneuronen, auch auf der dorsalen linken Oberfläche des Abdominalganglion, kaudal L7, ist ein Nichtziel Motoneuronen und kann effektiv als Kontrolle, mit der die sensorischen Neuronen fasciculates bildet aber keine chemische Synapsen verwendet werden. <ol><li> Anesthetize die Tiere für die Entfernung von Ganglien. Für LFS Motoneuronen, tun, was für pleurale sensorischen Neuronen beschrieben. Für L7 Motoneuronen, injizieren 0,35 M MgCl 2 in juvenile Aplysia (1-4 g) mit einer 10 ml Spritze mit einer 21-Gauge-Nadel. </li><li> Präparieren Sie die Bauchganglien: Pin am narkotisierten Tier auf dem Seziertisch Gericht wie oben (mit 21-Gauge-Nadeln für Jungtiere) beschrieben. Mit einer feinen Pinzette und einer feinen Schere, schneiden Sie die Bauchganglien. </li><li> Proteaseverdau Ganglien: Dies geschieht, wie bei Pleura-sensorischen Neuronen beschrieben, außer dass die Verdauung Zeit zu 1 Std. 45 Min. für Ganglien aus juvenile (1-4 g) Tiere reduziert wird. </li><li> Desheathing die Ganglien: Transfer der Protease verdaut Ganglien zu einer 35 oder 60 mm Schale mit Sylgard und L15. Profil unter einem Stereomikroskop (mit externen Halogenbeleuchtung), in den Ganglien, die in der Sylgard Gericht in der richtigen Orientierung mit Insekten Pins und einer feinen Pinzette. Mit dem feinen Pinzette und eine Vanna chirurgische Scheren, heben das Bindegewebe und schneiden Sie es auf die neuronalen Zellkörpern aussetzen. Zur Isolierung der LFS Motoneuronen, pin das Ganglion, so dass die Bauchseite nach oben zeigt, und mit einer Zange ziehen Sie die Bindegewebe zurück auf die gesamte Hälfte des Ganglion mit dem LFS Motoneuronen (rechts), desheath das Expose übrigen Teile des Ganglion entfernen Bindegewebe aus der Schüssel und fügen Sie mehr L15. Zur Isolierung des L7 oder L11 Motor Neuron, pin das Ganglion, so dass die dorsale Oberfläche nach oben zeigt, und mit einer Zange ziehen Sie die Bindegewebe zurück auf die Hälfte des Ganglion, die sowohl L7 und L11 (links) aussetzen. Achten Sie darauf, jemals zu berühren oder Schäden der neuronalen Somata. Legen Sie einen Stift zu einer &quot;post&quot; in kurzer Entfernung vom Ganglion (innerhalb des field of view) zu machen. </li><li> Isolation von Neuronen: Entfernen Neuronen mit einem scharfen Elektrode für die sensorischen Neuronen beschrieben. Die LFS Neuronen differentiated aus dem benachbarten LE sensorischen Neuronen auf der Grundlage eines kleinen dunklen Pigmentflecken in ihrer Somata. Das L7 Neuron kann von der L11 Neuron ersten differenzierten werden, da die L11 ist kaudal L7, weil die L11 Zellkörper ist mehr länglicher Form, während die L7 Zellkörper ist runder und weil die L11 Axon neigt dazu, verzweigen sich in zwei nahe an die Zelle Körper. </li><li> Plating Neuronen: Verwenden Sie eine Pipetman (P10) zu einzelnen Neuronen aus dem Sylgard Gericht zu übertragen, um eine Kulturschale für die sensorischen Neuronen beschrieben. </li><li> Pairing mit sensorischen Neuronen: Lassen Sie die Motoneuronen der Kulturschale haften für mindestens 1 Stunde. Dann fügen Sie die isolierten sensorischen Neuronen mit einem Pipetman, liefert jeder sensorischen Neuronen benachbart zu einem plated motorischen Neurons. Mit einem scharfen Glaselektrode vorsichtig strecken die sensorischen Neuron Axon, und Koax die sensorischen Zellkörper in eine Position neben dem Motor Neuron, in einem Abstand gleich oder etwas kleiner als die Länge der sensorischen Zelle Axon. Mit der Glaselektrode, Koax die sensorischen Axon in Kontakt mit den Motoneuronen kommen, sehr vorsichtig mit der Seite des konischen Elektrode, endlich die sensorischen Axon physisch an das Axon des motorischen Neurons. Heben Sie nicht der Kulturschale, sondern sanft gleiten die Schüssel auf dem Mikroskoptisch. </li><li> Lassen Sie die Gerichte auf Mikroskoptisch bei Raumtemperatur nicht weniger als 3 Stunden und Überweisung auf ein 18 ° C Inkubator für die sensorische Neuronen beschrieben. </li><li> Kulturen sollte das Gericht innerhalb von ca. 3 Stunden halten und neue Neuritenwachstum sollte innerhalb etwa 6-12 Stunden sichtbar. Sensorische Neuronen bilden glutamatergen Synapsen mit Motoneuronen sehr schnell - so schnell wie die Zelle anhaftenden genug, um scharfe Elektrode Aufnahme (3-5 Stunden), eine exzitatorische postsynaptische Potential aufgezeichnet werden durchführen können. Synaptischer Verbindungen weiter, bis DIV 3 zu erhöhen, und ist dann bis DIV7 stabil. Die Neuronen sollten aufwendige Neuritenwachstum in den ersten 1-3 Tagen in Kultur zu zeigen. </li></ol> C. Herstellung der Hämolymphe Hämolymphe ist als Wachstumsfaktor in Aplysia Kultur (analog zu der Verwendung von fötalem Kälberserum in Säugetier-Zellkultur) verwendet. Es ist von großen (500 g-1 kg) Tiere gesammelt und die beste Zeit, um Hämolymphe zu sammeln (anekdotisch) ist im Frühjahr (Mitte März bis Juni). Wickeln Sie das Tier in einem Einweg-underpad, so dass nur ein kleiner Teil des Tieres ausgesetzt ist, sauber, dass Teil der Haut mit Ethanol und dann halten, während eine andere Person verwendet eine sterile Rasierklinge einen Schnitt in der exponierten Bereich zu machen. Squeeze das Tier so, dass die Hämolymphe spritzt in ein sauberes Becherglas, um sicherzustellen, dass es nicht in Kontakt mit den schmutzigen Haut des Tieres. Die Hämolymphe füllt die hemocoel des Tieres (dh, das Tier ist im Grunde ein sac von Hämolymphe). Rewrap das Tier ein-oder zweimal, um einen neuen Schnitt und drücken schwer, so viel Hämolymphe wie möglich zu sammeln (sammeln in einem neuen Becher so, dass, wenn es verschmutzt ist, ist die erste Kollektion noch brauchbar). Hämolymphe von jedem Tier sollten getrennt gehalten werden (dh nicht-Pool Hämolymphe von verschiedenen Tieren). Spin der Hämolymphe bei 2000 xg für 10 min bis Blutkörperchen zu entfernen. Aliquot des Überstandes in 10 ml Aliquots Label von Tier-und bei -80 ° C. Beachten Sie, dass Hämolymphe bei -20 ° C gelagert bildet sich ein Niederschlag in Medium. Ein neues Aliquot Hämolymphe verwendet jedes Mal Kulturmedium hergestellt wird, und die aliquoten sind unmittelbar vor der Herstellung des Mediums aufgetaut werden. Nicht wieder einfrieren nach dem Auftauen.

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<li>Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+formation+and+mRNA+localization+in+cultured+Aplysia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons.</a> Neuron. 49 (3), 349-356 (2006).</li>
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</ol>

Die erfolgreiche Herstellung von Aplysia sensomotorische Kulturen hat eine etwas langsame Lernkurve, da es die Entwicklung der Feinmotorik mit Mikrodissektion und Manipulation einzelner Nervenzellen über ein Stereo-Mikroskop betrachtet verbundenen beinhaltet. Nach unserer Erfahrung dauert es ca. 1-3 Wochen Praxis zu gesunden isolierten sensorischen Neuronen in Kultur und eine zusätzliche 1-3 Wochen erhalten zu lernen, wie sensorische Neuronen mit motorischen Neuronen Paar. Wir routinemäßig vorzubereiten Kulture...

Lösungen benötigt für die Kultur <ol><li> 0,35 M MgCl 2, bei Raumtemperatur gelagert, verwendet für die Anästhesie. </li><li> Poly-L-Lysin-Lösung, Sigma: P-1524, MW&gt; 300.000, in 0,1 M Natrium-Borat pH8.2 bis 0,5-Promillegrenze Lösung gemacht. Vortex gut und filtriert durch ein 0,22 um Filter zu sterilisieren, lagern Sie es bei 4C °. Nicht Frost-Tau. </li><li> L-15 Medium-Pulver (Leibovitz) (Sigma: L4386) mit den Salzen, wie unten zu 1 Liter ergänzt <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> L-15-Pulver </td><td> 13.8g </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 15,4 g </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> 6,24 g </td></tr><tr><td> MgSO 4 7H 2 0 </td><td> 6.45g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 350 mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 170 mg </td></tr><tr><td> MgCl 2 6H 2 O </td><td> 5,49 g </td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> 1.43g </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 3.53g </td></tr></table> Add ddH20 auf 1 Liter. Der pH-Wert sollte ca. 7,4-7,5 werden, fügen Sie 10 ml 100X Pen / Strep-Lösung und durch einen 0,22 m Filter Filter-sterilisiert. Lagerung bei 4C0 nicht länger als 1 Monat. </li><li> Proteaseverdau Lösung: 1% Protease IX (1unit/mg) ist in L15 gemacht (ergänzt mit Salzen wie oben) oder in ASW unmittelbar vor dem Gebrauch, durch einen 0,22 m Millipore-Filter-sterilisiert. 5mls sollte genug für den Ganglien von zwei Tieren (sicherstellen, dass die Ganglien vollständig in Protease-Lösung getaucht). Sigma hat berichtet, dass sie einzustellen Verkauf Protease IX. Ein Ersatz-Protease ist: Dispase II (Roche Applied Science Katalog # 04942078001). </li><li> Kulturmedium. Unmittelbar vor der Vorbereitung Kulturen, Tauwetter ein 10 ml Aliquot Hämolymphe und mischen Sie es mit 10 ml L15 (ergänzt mit Salzen wie oben), um 20mls Kulturmedium zu machen. Add 200 ul 200 mM L-Glutamin, gut mischen und Verwendung zur Herstellung von Kulturen. Dieses Medium sollte frisch zubereitet jedes Mal Kulturen gemacht werden. </li><li> Künstlichem Meerwasser kann von Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) oder wie folgt vorgenommen werden: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl 2 (6H 2 O), 20 mM MgSO 4, 10 mM CaCl 2 (2H 2 O), 10 mM HEPES, mit pH-Wert eingestellt auf 7,4. </li></ol>

vorbereitung der aplysia sensory-motor neuronalen zellkulturen

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Das Nervensystem der Meeresschnecke Aplysia californica ist relativ einfach, bestehend aus etwa 20.000 Neuronen. Die Neuronen sind groß (bis zu 1 mm im Durchmesser) und identifizierbar sind, mit unterschiedlichen Größen, Formen, Positionen und Pigmentierungen, und die Zellkörper nach außen in fünf gepaart Ganglien im ganzen Körper des Tieres verteilt ausgesetzt. Diese Eigenschaften haben die Forscher um die Schaltung zugrunde liegenden spezifischen Verhaltensweisen in der Tier 1 abzugrenzen erlaubt. Die monosynaptische Verbindung zwischen sensorischen und motorischen Neuronen ist ein zentraler Bestandteil der Kiemenrückziehreflex in das Tier, eine einfache Abwehrreflex in dem das Tier zieht ihren Kiemen in Reaktion auf taktile Stimulation des Siphons. Dieser Reflex erfährt Formen des nicht-assoziativen und assoziativen Lernens, einschließlich der Sensibilisierung, Gewöhnung und klassische Konditionierung. Von besonderem Nutzen für das Studium der synaptischen Plastizität kann der sensorisch-motorischen Synapse in der Kultur wieder hergestellt werden, wo gut charakterisierten Reize zu entlocken Formen der Plastizität, die direkt korreliert in das Verhalten des Tieres 2,3 haben. Speziell erzeugt Anwendung von Serotonin eine synaptische Verstärkung, dass, abhängig von der Anwendung Protokoll, dauert Minuten (kurzfristige Erleichterung), Stunden (mittelfristige Erleichterung) oder Tagen (langfristige Erleichterung). Im Gegensatz dazu erzeugt die Anwendung der Peptid-Sender FMRFamid eine synaptische Schwächung oder Depression, die, abhängig von der Anwendung Protokoll von Minuten bis Tage (long-term depression) dauern kann. Die Größe der Neuronen ermöglicht wiederholte scharfe Elektrode Aufnahme der synaptischen Erregung über Zeiträume von Tagen zusammen mit Mikroinjektion von Expressionsvektoren, siRNAs und andere Verbindungen auf spezifische Signalwege und Moleküle Ziel und damit die molekularen und zellbiologischen Schritte, die Änderungen unterliegen in der synaptischen Effizienz. Ein weiterer Vorteil der Aplysia Kultur-System kommt von der Tatsache, dass die Neuronen Synapsen-Spezifität zeigen, in der Kultur 4,5. So müssen sensorischen Neuronen nicht bilden Synapsen mit sich selbst (autapses) oder mit anderen sensorischen Neuronen, noch bilden sie Synapsen mit Nicht-Zielorganismen identifiziert Motoneuronen in der Kultur. Die Krampfadern, Stätten der synaptischen Kontakte zwischen sensorischen und motorischen Neuronen, sind groß genug (2-7 Mikrometer im Durchmesser), damit Synapsenbildung (sowie Veränderungen der synaptischen Morphologie) mit Ziel-Motoneuronen auf das Licht mikroskopischer Ebene untersucht werden. In diesem Video zeigen wir jeden Schritt der Herstellung sensorisch-motorischen Neurons Kulturen, einschließlich Anästhesie erwachsenen und jugendlichen Aplysia, sezieren ihre Ganglien, Proteaseverdau der Ganglien, die Entfernung des Bindegewebes durch Mikrodissektion, Identifizierung der beiden sensorischen und motorischen Neuronen und Entfernung jeder Zelltyp durch Mikrodissektion, dem Plattieren der Motoneuronen, neben der sensorischen Neuronen und Manipulation der sensorischen Neuriten Kontakt mit dem kultivierten Motoneuronen bilden.

Primäre Kulturen von<em&gt; Aplysia</em&gt; Senso-motorischen Neuronen ein Modell Vorbereitung auf das Studium Synapsenbildung und synaptische Plastizität<em&gt; In-vitro-</em&gt;. Dieses Video zeigt die Identifikation und Mikrodissektion der sensorischen und motorischen Neuronen aus<em&gt; Aplysia</em&gt; Ganglien sowie die Methoden zur Festlegung und Aufrechterhaltung senso-motorischen Neuronen in Kultur.

Vorbereitung der Aplysia Sensory-Motor neuronalen Zellkulturen

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Primärkulturen von sensorischen Motoneuronen der AIA bieten eine Modellvorbereitung für die Untersuchung der Synapsenbildung und der synaptischen Plastizität in vitro. Dieses Video zeigt die Identifizierung und Mikrodissektion von sensorischen und motorischen Neuronen aus OIA-Ganglien sowie die Methoden zur Etablierung und Erhaltung sensorischer Motoneuronen in Kultur. Hallo, ich bin Aliza vom Labor von Kelsey Martin an der Abteilung für Psychiatrie und der Abteilung für Biologische Chemie an der University California Los Angeles.Hallo, ich bin Wan auch aus dem Marketing-Labor. Heute zeige ich Ihnen das Verfahren des Karrens und der sensorischen Motoneuronen von Clac Apia Konica. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Zelle und die Molekularbiologie der Synapenbildung und der synaptischen Plastizität zu untersuchen.Also lasst uns loslegen. Um mit der Kultivierung eines Pleio-Neurons zu beginnen, bereiten sie zunächst Kulturschalen vor, indem sie die Glasmulde einer Kulturschale mit mattem Tech-Glasboden mit Poly-L-Lysin beschichten, das in Natriumbor hergestellt wird. Fügen Sie so viel hinzu, dass das Glas vollständig bedeckt ist, und inkubieren Sie es über Nacht b

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Aplysia californica Neuronen entwickeln große Wachstum Kegel in Kultur, die sich hervorragend für hochauflösende Bildgebung des Wachstums Kegel Motilität und Führung sind. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Präparation und Beschichtung von Aplysia Tasche Zelle Neuronen sowie für die Einrichtung einer Kammer für Live Cell Imaging.

Neuronalen Zellkulturen von Aplysia für High-Resolution Imaging of Growth Cones

Ausgerichtet elektroversponnenen Fasern direkt das Wachstum von Neuronen in vitro und stellen eine potentielle Komponente der Nervenregeneration Gerüsten. Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung elektrogesponnenen Fasersubstrate und das Serum-freie Kultur von primären Ratten-E15 sensorischen (DRG) und motorischen Neuronen. Visualisierung von Neuronen durch Immunzytochemie ist ebenfalls enthalten.

The Culture of Primary Motor und sensorischen Neuronen in definierten Medien auf Elektrogesponnene Poly-L-Lactid Nanofiber Gerüste

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Neuronale Prozesse zur ultrastrukturellen Analyse zu erhalten, beschreiben wir ein Protokoll für die Beschichtung von primären Neuronen auf Elektronenmikroskopie Gitter gefolgt von einem Blitzgefrieren, wodurch Proben in einer Schicht von glasartigem Eis suspendiert. Diese Proben können mit einer Kryo-Elektronenmikroskop auf Strukturen im Nanometerbereich sichtbar zu prüfen.

Herstellung von primären Neuronen für die Visualisierung von Neuriten in einem tiefgefrorenen Zustand unter Verwendung von Kryo-Elektronentomographie

Meeresschnecke Aplysia californica wurde weithin als neurobiologisches Modell für die Studien auf zellulärer und molekularer Basis des Verhaltens verwendet. Hier wird eine Methodik zur Erforschung des Nervensystems von Aplysia für die elektrophysiologischen und molekularen Analysen einzelner Neuronen identifizierter neuronischer Schaltkreise beschrieben.

Aplysia Ganglien-Vorbereitung für elektrophysiologische und molekulare Analysen einzelner Neuronen

Es werden zwei verwandte Methoden beschrieben, um subzelluläre Ereignisse zu visualisieren, die für die synaptische Übertragung erforderlich sind. Diese Protokolle ermöglichen die Echtzeitüberwachung der Dynamik des präsynaptischen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelmembranfusion mittels Lebendzellbildgebung von in vitro kultivierten Neuronen.

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