Generation of Human CD40-aktivierten B-Zellen

Hallo, mein Name ist Alexander Shiku Van Hagen. Ich bin Mitglied des Labors für Immunologie und Transplantationsimmunologie am Universitätsklinikum Köln. In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie wir humane CD40-aktivierte B-Zellen aus peripheren mononukleären Blutzellen gewinnen können.

Ein Hauptinteresse unseres Labors ist die Untersuchung der antikörperunabhängigen Funktionen von BB-Zellen. Neben ihrer Rolle als Antikörperproduzenten spielen B-Zellen sowohl unter physiologischen Bedingungen als auch bei Autoimmunerkrankungen eine wichtige Rolle als antigenpräsentierende Zellen. Nach Aktivierung können B-Zellen starke antigenpräsentierende und immunstimulierende Fähigkeiten erwerben, insbesondere wenn sie über CD 40 aktiviert werden.

CD 40. Aktivierte B-Zellen weisen im Vergleich zu dendritischen Zellen mehrere Vorteile auf. Sie können leicht und vergleichsweise kostengünstig aus geringen Mengen peripheren Blutes, sogar von Krebspatienten, vermehrt werden.

Unsere Doktorandin Tanya Leic und unsere Technikerin LER werden Ihnen nun Schritt für Schritt zeigen, wie man humane CD40-aktivierte B-Zellen aus peripherem Blut gewinnt. Hallo, ich heiße Tanya Livi. Ich bin Doktorandin und möchte Ihnen demonstrieren, wie man humane CD40-aktivierte B-Zellen erzeugt.

Dieses Verfahren wurde in unserem Labor optimiert. Die wichtigsten Schritte sind zunächst die Herstellung von Fütterungszellen. Dazu verwenden wir humane CD40-Ligand-transfizierte NIH33-Zellen, die mit 78 Gray bestrahlt und in Sechs-Well-Platten ausgesät werden.

Zweitens beginnen wir die Kultur humaner CD40-aktivierter B-Zellen aus gereinigten PBMCs, die mit humanem Interleukin-4 und Cyclosporin A behandelt werden; diese Zellen werden anschließend auf Feederzellen in 6-Well-Platten ausplattiert. Dieses Verfahren wird am Tag sieben und danach alle drei bis vier Tage bis zum Tag 14 der Zellkultur wiederholt. Um am Ende hochreine, humane CD40-aktivierte B-Zellen zu erhalten, beginnen wir die Generierung der CD40-aktivierten B-Zellen mit frisch gereinigten oder angemessen gelagerten humanen PBMCs.

Zunächst waschen wir die PBMC zweimal, indem wir die Zellen in 50 Milliliter PBS resuspendieren. Zentrifugieren Sie die PBMC sieben Minuten bei 1300 U/min, entsprechend 260 × g. Entsorgen Sie danach das Überstand und resuspendieren Sie die Zellen erneut in 50 Milliliter PBS. Zentrifugieren Sie erneut sieben Minuten bei 1100 U/min, entsprechend 190 × g. Entsorgen Sie anschließend den Überstand erneut zur Bestimmung der Zellzahl.

Suspendieren Sie die PBMC in 20 ml PBS und mischen Sie die Zellen gründlich durch Vortexen. Bestimmen Sie die Zellanzahl. Zentrifugieren Sie die für die CD40-B-Zellkultur benötigte Menge an PBMC fünf Minuten bei 1200 U/min (entspricht 225 × g). Verwenden Sie für eine 6-Well-Platte jeweils 4 × 10⁶ Zellen pro Vertiefung sowie insgesamt 24 × 10⁶ Zellen pro Platte.

Suspenderen Sie die PBMC anschließend in einer Konzentration von einer mal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter in CD40-B-Kulturmedium. Ergänzen Sie die Zellsuspension mit frischem humanem IL-4 in einer Konzentration von 50 Einheiten pro Milliliter zur Stimulation sowie mit Cyclosporin A in einer Konzentration von 0,63 Mikrogramm pro Milliliter, um das Überwachsen durch T-Zellen zu hemmen. Nun ist die PBMC-Suspension zur Stimulation mit CD40-Ligand bereit.

So weit wir wissen, ist derzeit kein funktioneller GMP-qualitativer SOMAL-CD40-Ligand verfügbar. Daher verwenden wir humane CD40-Ligand-transfizierte NIH-3T3-Zellen, um Zellüberleben, Differenzierung und Proliferation zu stimulieren, da die NIH-3T3-Zelllinie mehrere Monate lang in Kultur überleben kann. Ein Verlust der CD40-Ligand-Expression muss regelmäßig durch FACS ausgeschlossen werden.

CD40-Ligand-transfiziertes NIH 3T3 ist eine adhärente Zelllinie, die bei 37 Grad mit 5 % CO2 in Selektionsmedium kultiviert wird, das mit G418 in einer Konzentration von 0,7 Milligramm pro Milliliter ergänzt ist. Diese adhäsive Fibroblasten-Zelllinie sollte niemals vollständig konfluent werden und zweimal pro Woche geteilt werden. Um die adhärenten Zellen zu passagieren, das Medium abziehen, einmal mit 10 Milliliter PBS vorsichtig schwenken, das Medium erneut abziehen und vier Milliliter Trypsin-EDTA in einer 75 Quadratzentimeter-Flasche hinzufügen.

Brüten Sie den Kolben fünf bis 10 Minuten bei 37 Grad im Brutschrank aus. Nehmen Sie den Kolben erneut heraus. Lösen Sie die Zellen durch vorsichtiges Klopfen vom Kunststoff ab.

Dann vorsichtig 10 Milliliter des Wildtyp-Mediums hinzufügen, leicht schwenken und die Zellen in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführen. Die NA83T3-Zellen fünf Minuten bei 1200 U/min, entsprechend 125 × g, abzentrifugieren. Die abgesetzten Zellen vorsichtig in 10 Milliliter Wildtyp-Medium resuspendieren.

Bestimmen Sie die Zellanzahl für die NIH 3T3-Subkultur und resuspendieren Sie 1,5 × 10⁶ Feeder-Zellen in 10 ml Wildtyp-Medium. Überführen Sie diese in einen 75 cm²-Flasche und geben Sie G418 in einer Konzentration von 0,7 mg/ml hinzu, um die transfizierten Zellen, die gegen Neomycin resistent sind, auszuwählen. Inkubieren Sie die Feeder-Zellen abschließend bei 37 °C in 5 % CO₂ für die CD40-B-Stimulation.

Nehmen Sie den Rest der NI 8 3 3-Zellen und töten Sie sie durch Bestrahlung mit 78 Gray, um ihre Proliferation zu stoppen. Verdünnen Sie die bestrahlten Fütterungszellen in Wire-Typ-Medium auf eine Zelldichte von 0,1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter und geben Sie 2 Milliliter pro Vertiefung in eine 6-Loch-Platte. Lassen Sie die Zellen in der 6-Loch-Platte 24 Stunden bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren, damit sie wieder adhärent werden, bevor sie als Fütterungszellen zur Stimulation von B-Lymphozyten mit CD40-Ligand verwendet werden.

Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die einen Tag zuvor platzierten Futterzellen angeheftet sind. Wenn die Futterzellen angeheftet sind, entfernen Sie SUP Natin aus jedem Well und waschen Sie sie schnell zwei Mal. Waschen Sie zuerst jeden Well mit zwei Milliliter PBS und anschließend mit zwei Milliliter.

CD 40 B Waschmedium zur Stimulation der PBMC-Suspension. Kurz zuvor mit einer Zelldichte von 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter zu den Fütterungszellen hergestellt. Dazu vorsichtig vier Milliliter der Zellsuspension zu jeder Probe geben.

Die Platte am siebten Tag bei 37 Grad in 5 % CO2 gut inkubieren. CD40-B-Zellen können für die erste Subkultur von CD40 subkultiviert werden. Aktivierte B-Zellen am siebten Tag und anschließende Subkulturen alle drei bis vier Tage.

Heben Sie die angesammelten Zellen vorsichtig von den sechs 12er-Platten ab, indem Sie sie mit einer 10-Milliliter-Pipette resuspendieren. Überführen Sie die CD40-B-Zellen in einen 50-Milliliter-Probengefäß. Zentrifugieren Sie die CD40-B-Zellen sieben Minuten lang bei 1200 U/min (entspricht vollständig 220 ×g).

Ersetzen Sie das Medium durch das CD40-B-Waschmedium und bestimmen Sie die Zellanzahl der CD40-aktivierten B-Zellen. Resuspendieren Sie die CD40-B-Zellen bei einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter in CD40-B-Kulturmedium.

Dann ergänzen Sie die Zellsuspension erneut mit frischem humanem IL-4 in einer Konzentration von 50 Einheiten pro Milliliter und Cyclosporin A in einer Konzentration von 0,63 Mikrogramm pro Milliliter zur Stimulation. Uc, am Tag zuvor vorbereitete bestrahlte Fütterungszellen. Natürlich müssen die bestrahlten Fütterungszellen unmittelbar vor Gebrauch erneut mikroskopisch auf Adhärenz überprüft werden.

Falls anhaftend, die Fütterungszellen schnell zwei Mal wie zuvor einmal mit PBS und ein anderes Mal mit CD40-B-Waschmedium waschen, dann vorsichtig vier Milliliter der CD40-B-Suspension, eingestellt auf eine Zellkonzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter, in jedes Brunnen einer 6-Loch-Platte geben. Die Subkultur wird nach drei bis vier Tagen zweimal wöchentlich identisch wiederholt, um am Tag 14 der Kultur Zellverbände hochreiner humaner, durch CD40 aktiverter B-Zellen zu erhalten.

Zu diesem Zeitpunkt exprimieren CD40-aktivierten B-Zellen kostimulatorische Moleküle wie CD80, CD86, CD83 und MHC-Moleküle sowie die sogenannte Lymphknoten-Homing-Triade aus CD62-Ligand, CCR7 und LFA-1, die während der Generierung zur Fehlersuche von Fox überprüft werden können. Bitte beachten Sie die Textversion dieses Protokolls. Wir hoffen, dass CD40-aktivierte B-Zellen in Zukunft als wichtiges Instrument für die Krebsimmuntherapie dienen werden.

Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.