Name: Generation of Human CD40-aktivierten B-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-16T23:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 27 s
Description: Lernen Sie die ex vivo-Generierung und Expansion humaner CD40-aktivierter B-Zellen aus peripheren Blutmononukleären Zellen. Diese Methode nutzt CD40-Ligand und Interleukin-4 zur Stimulation.

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Das Protokoll für die Erzeugung von menschlichen CD40-aktivierte B-Zellen aus PBMC ist in zwei Teile gegliedert: Teil A zeigt die Herstellung von CD40-Liganden exprimieren NIH/3T3-Zellen, die als Platten-gebundenen Feeder-Zellen verwendet werden. Teil B beschreibt die eigentliche CD40-B Kultur. A. Herstellung von Feeder-Zellen (tCD40L NIH/3T3) Die tCD40L NIH/3T3 ist ein Anhänger murine Fibroblasten-Zelllinie, die nie sollte vollständig konfluent. Die Zellen sind daher zweimal pro Woche aufgeteilt. Die Kultivierung von mehr als 6 Wochen wird nicht empfohlen. <ol><li> Entfernen Sie alte Medium aus dem Primär-Kultur mit einer sterilen Pipette und waschen Sie die Zellen mit 10 ml 1x PBS. Saugen Sie das PBS nach dem Waschen. </li><li> 4 mL Trypsin / EDTA in einer 75 cm 2-Kolben für 5-10 Minuten bei 37 ° C. Verwenden leichtes Klopfen auf die Zellen zu lösen. </li><li> Fügen Sie 10 ml Wildtyp-mittel-und Schwenk-sanft. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50 ml-Tube mit einer sterilen Pipette und drehen Sie die Zellen nach unten bei 225 xg für 5 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml Wildtyp-Medium. Zählen Sie die Zellzahl eines Aliquots der Zellsuspension und bereiten drei 50 ml-Röhrchen mit der entsprechenden Anzahl von Zellen: <ol><li> 1,5 x 10 6 Zellen zur Subkultivierung </li><li> 0,2 x 10 6 Zellen / well für die Bestrahlung von CD40-B-Zell-Kultur verwendet </li><li> Rest einfrieren (falls erforderlich). </li></ol></li><li> Drehen Sie die Zellen nach unten bei 225 xg für 5 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand. <ol><li> Für Subkultivierung: resuspendieren 1,5 x 10 6 Zellen in 10 mL Wildtyp-Medium in einem 75 cm 2 Zellkulturflasche (Zelldichte 1,5 x 10 5 Zellen / ml), fügen G-418 [0,7 mg / mL] und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2. Split die Zellen zweimal pro Woche. </li><li> Für die CD40-B-Zell-Kultur: Sie müssen 1,2 x 10 6 Zellen für eine 6-Well-Platte. Resuspendieren der Zellen in Wildtyp-Medium mit einer Dichte von 0,1 x 10 6 Zellen / ml und bestrahlen sie bei 78 Gy. Plate 2 mL der Zellsuspension in jede Vertiefung und inkubieren sie bei 37 ° C mit 5% CO 2. Mit diesem vorbereiteten Platten für B-Zell-Stimulation, wenn tCD40L NIH/3T3-Zellen Anhänger sind (mindestens 4 Stunden: check Einhaltung mit dem Mikroskop; warten Sie nicht länger als 24 h auf B-Zell-Stimulation beginnen). (Fahren Sie mit B.) </li></ol></li></ol> B. CD 40-B-Zell-Kultur I. Vorbereitung der PBMCs für CD40-Stimulation (Tag 0): Bitte beachten Sie: Bevor Sie fortfahren vergewissern, dass Feeder-Zellen adhärent sind. Fügen Sie immer frische Lösungen von Interleukin-4 und Cyclosporin A, um das Wachstum mittelfristig unmittelbar vor dem Gebrauch. <ol><li> Nehmen PBMCs, entweder frisch oder in geeigneter Weise aufgetaut. Resuspendieren PBMCs zweimal in 50 ml 1x PBS zu waschen und Spin-down ersten Mal bei 265 xg für 7 min und ein zweites Mal bei 190 xg für 7 min zu anderen Zellen zu entfernen. Überstand verwerfen und die Zellen in 20 ml PBS. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen in einem Aliquot der Zellsuspension. </li><li> Spin down benötigte Menge an Zellen bei 225 xg für 5 min. Für eine 6-Well-Platte 4 x 10 6 Zellen / well benötigt werden, also 24 x 10 6 Zellen pro Platte. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die PBMC mit 1 x 10 6 Zellen / ml in CD40-B Kulturmedium frisch mit 50 U / ml Interleukin-4 ergänzt als Wachstumsfaktor und 0,63 ug / ml Cyclosporin A Auswuchs der T-Zellen zu verhindern (Angesichts Konzentrationen beziehen sich auf ein ml Kulturmedium!). </li><li> Entfernen Sie den Überstand aus 6-Well-Platte vorinkubiert mit tCD40L NIH/3T3-Zellen. </li><li> Waschen Sie die Anhänger tCD40L NIH/3T3-Zellen mit 2 mL PBS pro Vertiefung ersten und in einem zweiten Schritt mit 2 ml CD40-B Waschmedium. </li><li> Vorsichtig 4 ml PBMC Suspension (1 x 10 6 Zellen / ml) in jede Vertiefung der 6-Well-Platte. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Am Tag 7 reculture der Zellen (Fahren Sie mit 3.2.). </li></ol> II. Rekultivierung von CD40-B-Zellen (Tag 7 und dann alle 3-4 Tage): <ol><li> Ernte-Clustern von CD40-B-Zellen aus 6-Well-Platte durch Resuspendieren mit einer 10 mL Pipette und sie gemeinsam in eine 50 ml Tube. </li><li> Spin down bei 225 xg für 7 Minuten und vollständig ersetzen den Überstand mit CD40-B Waschmedium. Während des Zählens der Zelle Betrag eines aliquoten, drehen Sie das Zellen nach unten bei 225 xg für 5 Minuten. Resuspendieren CD40-B-Zellen in CD40-B Kulturmedium in einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Fügen Sie frische Lösungen von Interleukin-4 in einer Konzentration von 50 U / ml und 0,63 pg / mL Cyclosporin A auf das Medium. </li><li> Entfernen Sie den Überstand aus einer 6-well-Platte mit tCD40L NIH/3T3-Zellen vorinkubiert. </li><li> Waschen Sie die adhärenten Zellen mit 2 ml PBS pro Vertiefung ersten und in einem zweiten Schritt mit 2 ml CD40-B Waschmedium. </li><li&gt; vorsichtig 4 ml (1 x 10 6 Zellen / ml) von CD40-B Suspension in jede Vertiefung der 6-Well-Platte. </li><li> Die Platten bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Subculture Zellen wieder alle 3-4 Tage bis zum Ende mit hochreinem humanen CD40-aktivierte B-Zellen nach insgesamt 14 Tagen. </li></ol> C. Trouble-Shooting - Was passiert, wenn CD40-B-Zellen nicht wachsen? <ol><li> Haben Sie überprüft, für die CD40-Ligand Expression von Feeder-Zellen? </li><li> Die Platte gebundene Nährzellen der Stimulation dürfen nicht älter 24 Stunden? </li><li> Ist eine Kontamination mit Mykoplasmen möglich? </li><li> War der Interleukin-4-Lösung zur Ergänzung eingesetzt frisch aufgetaut und hatte die entsprechende biologische Aktivität? </li><li> War Cyclosporin A aufgenommen in der richtigen Konzentration? </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1373/1373fig1tmb.jpg" border="0" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1373/1373fig1.jpg">klicken Sie hier</a> für eine größere Version der Abbildung 1. <img src="/files/ftp_upload/1373/1373fig2tmb.jpg" border="0" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1373/1373fig2.jpg">klicken Sie hier</a> für eine größere Version der Abbildung 2 dargestellt.

<ol><li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+human+B+cells%3A+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).</li>
<li>Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+and+CD40-activated+B+cells%3A+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).</li>
<li>Bergwelt-Baildon, M. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis%3A+potential+as+cellular+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107, 2786-2789 (2006).</li>
<li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).</li>
<li>Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+ligand+triggered+interleukin-6+secretion+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma.</a> Blood. 85, 1903-1912 (1995).</li>
<li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).</li>
<li>von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells%3A+potential+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99, 3319-3325 (2002).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients%3A+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15, 955-965 (2008).</li>
</ol>

A. Herstellung der Medien: <table border="1"cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Feeder Zelle Wildtyp-Medium </td><td colspan="2"> Feeder Zelle Selektionsmedium </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Konzentration </td><td> Reagens </td><td> Konzentration </td></tr><tr><td> DMEM-Ham / F12 </td><td></td><td> DMEM-Ham / F12 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> 365 pg / mL </td><td> L-Glutamin </td><td> 365 pg / mL </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> 15 ug / mL </td><td> Gentamycin </td><td> 15 ug / mL </td></tr><tr><td></td><td></td><td> G-418 </td><td> 0,7 mg / mL </td></tr></table><table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> CD40-B Waschmedium </td><td colspan="2"> CD40-B Kulturmedium </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Konzentration </td><td> Reagens </td><td> Konzentration </td></tr><tr></tr></tbody><tbody><tr><td> IMDM </td><td> </td><td> IMDM </td><td> </td></tr></tbody><tbody><tr><td> L-Glutamin </td><td> 584 pg / mL </td><td> L-Glutamin </td><td> 584 pg / mL </td></tr></tbody><tbody><tr><td> HEPES </td><td> 25 mM </td><td> HEPES </td><td> 25 mM </td></tr></tbody><tbody><tr><td> Gentamycin </td><td> 15 ug / mL </td><td> Gentamycin </td><td> 15 ug / mL </td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> rh Transferrin </td><td> 50 ug / mL </td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> rh Insulin </td><td> 5 ug / mL </td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> AB-Humanserum </td><td> 10% </td></tr></tbody></table> B. Sonstige Reagenzien: <table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Bestell-Nr </td></tr><tr></tr><tr><td> DMEM / Ham &#39;s F12 </td><td> PAA </td><td> Cat No: E15-813 </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen Gibco ® </td><td> REF 21980-032 </td></tr><tr><td> Dulbecco PBS (10x) </td><td> PAA </td><td> Cat No H15-011 </td></tr><tr><td> AB-Humanserum </td><td> Invitrogen </td><td> Cat No 34005100 </td></tr><tr><td> Holo-Transferrin menschlichen </td><td> Sigma </td><td> Cat No T0665 </td></tr><tr><td> Insulin human </td><td> Sigma </td><td> Cat No I2643 </td></tr><tr><td> Gencin ® </td><td> Delta Select </td><td> Art.-Nr. 7395800 </td></tr><tr><td> Rekombinanten humanen Interleukin-4 </td><td> Immunotools </td><td> Cat No 11130045 </td></tr><tr><td> Cyclosporin A </td><td> Novartis </td><td> Cat No NDC 0078-0109-01 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> LONZA </td><td> Cat No DE14-802C </td></tr><tr><td> HEPES-Puffer </td><td> PAA </td><td> Cat No S11-001 </td></tr><tr><td> G-418 Sulfat </td><td> PAA </td><td> Cat No P02-012 </td></tr><tr><td> Trypsin / EDTA (10x) </td><td> Invitrogen Gibco ® </td><td> REF 15400-054 </td></tr></tbody></table> C. Sonstiges Zubehör: <table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Bestell-Nr </td></tr><tr></tr><tr><td> Sterile Pipettenspitzen </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6-Well-Platte </td><td> NUNC </td><td> Cat No 140675 </td></tr><tr><td> 50 ml konischen Rohr </td><td> BD Falcon ™ </td><td> Cat No 352070 </td></tr><tr><td> Zellkulturflasche </td><td> SARSTEDT </td><td> Cat No 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

generation of human cd40-aktivierten b-zellen

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-aktivierte B-Zellen (CD40-B-Zellen) wurden als eine alternative Quelle für immunstimulierende Antigen-präsentierende Zellen (APC) für die Immuntherapie von Krebs 3.1 identifiziert worden. Im Vergleich zu Dendritische Zellen (DCs), den am besten charakterisierten APC, CD40-B-Zellen haben mehrere verschiedene biologische und technische Eigenschaften. Ähnlich wie DCs, B-Zellen eine erhöhte Expression von MHC-und kostimulatorischen Molekülen (Abb. 1b) zeigen, weisen eine starke Wanderungsbewegungen Kapazität und präsentieren Antigen-Präsentation effizient auf T-Zellen nach Stimulation mit Interleukin-4 und CD40-Ligand (CD40L). Doch im Gegensatz zu unreifen oder reifen DCs, Express-CD40-B-Zellen die volle Lymphknoten Homing Triade bestehend aus CD62L, CCR7/CXCR4 und Leukozyten-Antigen-Funktion-1 (LFA1, CD11a/CD18), die für Homing zu sekundären lymphatischen Organen (Abb. 1a) 3. CD40-B-Zellen können ohne Schwierigkeiten aus sehr geringen Mengen im peripheren Blut, die weiter in vitro werden, um sehr große Mengen an hochreinen CD40-B-Zellen (&gt; 10 9 Zellen pro Patient) von gesunden Spendern sowie Krebs kann erweitert erzeugt werden Patienten (Fig.1c, d) 1,4. In diesem Protokoll haben wir demonstrieren, wie voll aktiviert CD40-B-Zellen aus humanen PBMC erhalten. Key-Moleküle für die Zellkultur sind CD40-Ligand, Interleukin-4 (IL-4) und Cyclosporin A (CsA), die in einer 3-4 Tage alten Kultur-Zyklus wieder aufgefüllt werden. Für Laborzwecke CD40-Stimulation wird durch NIH/3T3-Zellen exprimierenden rekombinanten humanen CD40-Liganden (tCD40L NIH/3T3) 5 zur Verfügung gestellt. Zur Vermeidung von Kontaminationen mit nicht-transfizierten Zellen ist die Expression des humanen CD40-Liganden auf die Transfektanten regelmäßig überprüft werden (Abb.2). Nach 14 Tagen CD40-B-Zell-Kulturen bestehen aus mehr als 95% reinen B-Zellen sowie eine Ausweitung des CD40-B-Zellen über 65 Tage ist oft möglich, ohne Verlust der Funktion 1, 4. CD40-B-Zellen effizient aufnehmen, verarbeiten und präsentieren Antigene an T Zellen 6. Sie haben nicht nur prime naϊve, sondern auch zu erweitern Memory T-Zellen 7,8. CD40-aktivierte B-Zellen können verwendet werden, um B-Zell-Aktivierung, Differenzierung und Funktion zu untersuchen. Darüber hinaus stellen sie ein vielversprechendes Werkzeug für therapeutische oder präventive Impfung gegen Tumoren 9.

In diesem Video stellen wir Ihnen die<em&gt; Ex vivo</em&gt; Erzeugung und Erweiterung des menschlichen CD40-aktivierten B-Zellen (CD40-B) aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) durch Stimulation mit CD40-Ligand und Interleukin-4.

Generation of Human CD40-aktivierten B-Zellen

CD40-aktivierte B-Zellen (CD40-B-Zellen) wurden als alternative Quelle immunstimulatorischer antigenpräsentierender Zellen (APC) für Krebserkrankungen identifiziert ...

Hallo, mein Name ist Alexander Shiku Van Hagen. Ich bin Mitglied des Labors für Immunologie und Transplantationsimmunologie am Universitätsklinikum Köln. In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie wir humane CD40-aktivierte B-Zellen aus peripheren mononukleären Blutzellen gewinnen können.Ein Hauptinteresse unseres Labors ist die Untersuchung der antikörperunabhängigen Funktionen von BB-Zellen. Neben ihrer Rolle als Antikörperproduzenten spielen B-Zellen sowohl unter physiologischen Bedingungen als auch bei Autoimmunerkrankungen eine wichtige Rolle als antigenpräsentierende Zellen. Nach Aktivierung können B-Zellen starke antigenpräsentierende und immunstimulierende Fähigkeiten erwerben, insbesondere wenn sie über CD 40 aktiviert werden.CD 40. Aktivierte B-Zellen weisen im Vergleich zu dendritischen Zellen mehrere Vorteile auf. Sie können leicht und vergleichsweise kostengünstig aus geringen Mengen peripheren Blutes, sogar von Krebspatienten, vermehrt werden.Unsere Doktorandin Tanya Leic und unsere Technikerin LER werden Ihnen nun Schritt für Schritt zeigen, wie man humane CD40-aktivierte B-Zellen aus peripherem Blut gewinnt. Hallo, ich heiße Tanya Livi. Ich bin Doktorandin und möchte Ihnen demonstrieren, wie man humane CD40-aktivierte B-Zellen erzeugt.Dieses Verfahren wurde in unserem Labor optimiert. Die wichtigsten Schritte sind zunächst die Herstellung von Fütterungszellen. Dazu verwenden wir humane CD40-Ligand-transfizierte NIH33-Zellen, die mit 78 Gray bestrahlt und in Sechs-Well-Platten ausgesät werden.Zweitens beginnen wir die Kultur humaner CD40-aktivierter B-Zellen aus gereinigten PBMCs, die mit humanem Interleukin-4 und Cyclosporin A behandelt werden; diese Zellen werden anschließend auf Feederzellen in 6-Well-Platten ausplattiert. Dieses Verfahren wird am Tag sieben und danach alle drei bis vier Tage bis zum Tag 14 der Zellkultur wiederholt. Um am Ende hochreine, humane CD40-aktivierte B-Zellen zu erhalten, beginnen wir die Generierung der CD40-aktivierten B-Zellen mit frisch gereinigten oder angemessen gelagerten humanen PBMCs.Zunächst waschen wir die PBMC zweimal, indem wir die Zellen in 50 Milliliter PBS resuspendieren. Zentrifugieren Sie die PBMC sieben Minuten bei 1300 U/min, entsprechend 260 × g. Entsorgen Sie danach das Überstand und resuspendieren Sie die Zellen erneut in 50 Milliliter PBS. Zentrifugieren Sie erneut sieben Minuten bei 1100 U/min, entsprechend 190 × g. Entsorgen Sie anschließend den Überstand erneut zur Bestimmung der Zellzahl.Suspendieren Sie die PBMC in 20 ml PBS und mischen Sie die Zellen gründlich durch Vortexen. Bestimmen Sie die Zellanzahl. Zentrifugieren Sie die für die CD40-B-Zellkultur benötigte Menge an PBMC fünf Minuten bei 1200 U/min (entspricht 225 × g). Verwenden Sie für eine 6-Well-Platte jeweils 4 × 10⁶ Zellen pro Vertiefung sowie insgesamt 24 × 10⁶ Zellen pro Platte.Suspenderen Sie die PBMC anschließend in einer Konzentration von einer mal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter in CD40-B-Kulturmedium. Ergänzen Sie die Zellsuspension mit frischem humanem IL-4 in einer Konzentration von 50 Einheiten pro Milliliter zur Stimulation sowie mit Cyclosporin A in einer Konzentration von 0,63 Mikrogramm pro Milliliter, um das Überwachsen durch T-Zellen zu hemmen. Nun ist die PBMC-Suspension zur Stimulation mit CD40-Ligand bereit.So weit wir wissen, ist derzeit kein funktioneller GMP-qualitativer SOMAL-CD40-Ligand verfügbar. Daher verwenden wir humane CD40-Ligand-transfizierte NIH-3T3-Zellen, um Zellüberleben, Differenzierung und Proliferation zu stimulieren, da die NIH-3T3-Zelllinie mehrere Monate lang in Kultur überleben kann. Ein Verlust der CD40-Ligand-Expression muss regelmäßig durch FACS ausgeschlossen werden.CD40-Ligand-transfiziertes NIH 3T3 ist eine adhärente Zelllinie, die bei 37 Grad mit 5 % CO2 in Selektionsmedium kultiviert wird, das mit G418 in einer Konzentration von 0,7 Milligramm pro Milliliter ergänzt ist. Diese adhäsive Fibroblasten-Zelllinie sollte niemals vollständig konfluent werden und zweimal pro Woche geteilt werden. Um die adhärenten Zellen zu passagieren, das Medium abziehen, einmal mit 10 Milliliter PBS vorsichtig schwenken, das Medium erneut abziehen und vier Milliliter Trypsin-EDTA in einer 75 Quadratzentimeter-Flasche hinzufügen.Brüten Sie den Kolben fünf bis 10 Minuten bei 37 Grad im Brutschrank aus. Nehmen Sie den Kolben erneut heraus. Lösen Sie die Zellen durch vorsichtiges Klopfen vom Kunststoff ab.Dann vorsichtig 10 Milliliter des Wildtyp-Mediums hinzufügen, leicht schwenken und die Zellen in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführen. Die NA83T3-Zellen fünf Minuten bei 1200 U/min, entsprechend 125 × g, abzentrifugieren. Die abgesetzten Zellen vorsichtig in 10 Milliliter Wildtyp-Medium resuspendieren.Bestimmen Sie die Zellanzahl für die NIH 3T3-Subkultur und resuspendieren Sie 1,5 × 10⁶ Feeder-Zellen in 10 ml Wildtyp-Medium. Überführen Sie diese in einen 75 cm²-Flasche und geben Sie G418 in einer Konzentration von 0,7 mg/ml hinzu, um die transfizierten Zellen, die gegen Neomycin resistent sind, auszuwählen. Inkubieren Sie die Feeder-Zellen abschließend bei 37 °C in 5 % CO₂ für die CD40-B-Stimulation.Nehmen Sie den Rest der NI 8 3 3-Zellen und töten Sie sie durch Bestrahlung mit 78 Gray, um ihre Proliferation zu stoppen. Verdünnen Sie die bestrahlten Fütterungszellen in Wire-Typ-Medium auf eine Zelldichte von 0,1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter und geben Sie 2 Milliliter pro Vertiefung in eine 6-Loch-Platte. Lassen Sie die Zellen in der 6-Loch-Platte 24 Stunden bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren, damit sie wieder adhärent werden, bevor sie als Fütterungszellen zur Stimulation von B-Lymphozyten mit CD40-Ligand verwendet werden.Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die einen Tag zuvor platzierten Futterzellen angeheftet sind. Wenn die Futterzellen angeheftet sind, entfernen Sie SUP Natin aus jedem Well und waschen Sie sie schnell zwei Mal. Waschen Sie zuerst jeden Well mit zwei Milliliter PBS und anschließend mit zwei Milliliter.CD 40 B Waschmedium zur Stimulation der PBMC-Suspension. Kurz zuvor mit einer Zelldichte von 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter zu den Fütterungszellen hergestellt. Dazu vorsichtig vier Milliliter der Zellsuspension zu jeder Probe geben.Die Platte am siebten Tag bei 37 Grad in 5 % CO2 gut inkubieren. CD40-B-Zellen können für die erste Subkultur von CD40 subkultiviert werden. Aktivierte B-Zellen am siebten Tag und anschließende Subkulturen alle drei bis vier Tage.Heben Sie die angesammelten Zellen vorsichtig von den sechs 12er-Platten ab, indem Sie sie mit einer 10-Milliliter-Pipette resuspendieren. Überführen Sie die CD40-B-Zellen in einen 50-Milliliter-Probengefäß. Zentrifugieren Sie die CD40-B-Zellen sieben Minuten lang bei 1200 U/min (entspricht vollständig 220 ×g).Ersetzen Sie das Medium durch das CD40-B-Waschmedium und bestimmen Sie die Zellanzahl der CD40-aktivierten B-Zellen. Resuspendieren Sie die CD40-B-Zellen bei einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter in CD40-B-Kulturmedium.Dann ergänzen Sie die Zellsuspension erneut mit frischem humanem IL-4 in einer Konzentration von 50 Einheiten pro Milliliter und Cyclosporin A in einer Konzentration von 0,63 Mikrogramm pro Milliliter zur Stimulation. Uc, am Tag zuvor vorbereitete bestrahlte Fütterungszellen. Natürlich müssen die bestrahlten Fütterungszellen unmittelbar vor Gebrauch erneut mikroskopisch auf Adhärenz überprüft werden.Falls anhaftend, die Fütterungszellen schnell zwei Mal wie zuvor einmal mit PBS und ein anderes Mal mit CD40-B-Waschmedium waschen, dann vorsichtig vier Milliliter der CD40-B-Suspension, eingestellt auf eine Zellkonzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter, in jedes Brunnen einer 6-Loch-Platte geben. Die Subkultur wird nach drei bis vier Tagen zweimal wöchentlich identisch wiederholt, um am Tag 14 der Kultur Zellverbände hochreiner humaner, durch CD40 aktiverter B-Zellen zu erhalten.Zu diesem Zeitpunkt exprimieren CD40-aktivierten B-Zellen kostimulatorische Moleküle wie CD80, CD86, CD83 und MHC-Moleküle sowie die sogenannte Lymphknoten-Homing-Triade aus CD62-Ligand, CCR7 und LFA-1, die während der Generierung zur Fehlersuche von Fox überprüft werden können. Bitte beachten Sie die Textversion dieses Protokolls. Wir hoffen, dass CD40-aktivierte B-Zellen in Zukunft als wichtiges Instrument für die Krebsimmuntherapie dienen werden.Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video zeigen wir, das Verfahren der CD40-Aktivierung und Expansion von murinen B-Zellen aus Splenozyten von C57BL / 6 Mäusen, die als Modell-Antigen-präsentierende Zellen (APC) zur Induktion der Immunität Studie verwendet werden können.

Mausmodell der CD40-Aktivierung von B-Zellen

Ein effizientes System der Struktur-und Funktionsanalyse eines Gens in...

Rekombinanten retroviralen Produktion und Infektion von B-Zellen

Dieses Video zeigt einen In-vitro-Assay zur Erzeugung plasmazytoider dendritischer Zellen (pDCs) aus gängigen lymphoiden Vorläuferzellen (CLPs). Bei der Co-Kultivierung von gereinigten CLPs mit γ-bestrahlten Feeder-Zellen in Gegenwart von Fms-ähnlichen Tyrosinkinase-3-Liganden (FL) differenzieren sich die CLPs in nicht-adhärente pDCs, deren Vorhandensein mittels Durchflusszytometrie bestätigt wird.

In vitro Erzeugung von plasmozytoiden dendritischen Zellen aus gemeinsamen lymphatischen Vorläuferzellen

Dieses Video zeigt einen Assay zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC)-abgeleiteten CD8αβ+-T-Zellen. Tumorantigen-spezifische iPSCs werden auf einer Stromazell-Monoschicht gezüchtet und zu hämatopoetischen Vorläuferzellen (HPCs) differenziert. Die HPCs werden unter Verwendung eines Differenzierungsmediums in CD4+ CD8+ doppelt-positive T-Zellen differenziert. Diese Zellen werden dann stimuliert, um einfach-positive T-Zellen zu erzeugen, die CD8...

Generierung einzelner positiver CD8-T-Zellen aus induzierten pluripotenten Stammzellen

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Erzeugung und Vermehrung von menschlichen T-Zell-Klonen, die spezifisch auf ein definiertes Alloantigen reagieren. Dieses Protokoll kann für die Klonierung menschlicher T-Zellen angepasst werden, die für eine Vielzahl von Peptid-MHC-Liganden spezifisch sind.

Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

Wir beschreiben hier ein neues Verfahren antigen-spezifische T-Zell-Rezeptoren (TCRs) durch Paarung der TCR &amp; agr; oder TCR &amp; bgr; TCR eines bestehenden, besitzen die Antigen-Spezifität von Interesse, mit komplementären hemichain der peripheren T-Zell-Rezeptor-Repertoire zu erzeugen. Die de novo erzeugt TZR behalten Antigen-Spezifität mit Affinität zu variieren.

Generieren<em&gt; De Novo</em&gt; Antigen-spezifische Zellrezeptoren humanen T von Retrovirale Transduktion von Centric Hemichain

Hier zeigen wir, wie Monozyten durch magnetische Kügelchentrennung aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes nach Dichtegradientenzentrifugation von humanem antikoaguliertem Blut isoliert werden. Nach einer 5-tägigen Inkubation werden die menschlichen Monozyten in unreife dendritische Zellen differenziert und sind bereit für experimentelle Verfahren in einer nicht-klinischen Umgebung.

Herstellung von menschlichen Monozyten abgeleiteten Dendritischen Zellen aus Vollblut

Wir beschreiben eine Methode zur Herstellung von menschlichen Antikörpern, die spezifisch für ein Antigen des Interesses, ausgehend von seltenen B-Zellen im menschlichen Blut zirkulieren. Generation dieser natürliche Antikörper ist rasch und effizient, und die Antikörper erhalten können sehr ähnliche Antigene unterscheiden.

Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden

Mit mehrstufigen Kultur-Systeme, berichten wir eine in-vitro-B-Zelle zur Plasmazelle Differenzierung Modell.

In Vitro Differenzierung Modell der normalen Gedächtnis B Zellen zu langlebigen Plasmazellen

Dieses Protokoll bietet einen optimierten Arbeitsablauf zur Generierung und zum Testen von humanen chimären Antigenrezeptor-regulatorischen T-Zellen (CAR-Tregs).

Erzeugung humaner chimärer Antigenrezeptor-regulatorischer T-Zellen

Lernen Sie die ex vivo-Generierung und Expansion humaner CD40-aktivierter B-Zellen aus peripheren Blutmononukleären Zellen. Diese Methode nutzt CD40-Ligand und Interleukin-4 zur Stimulation.

Generation of Human CD40-aktivierten B-Zellen

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