Name: Mit den Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, In Vision Research (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-03T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 28 s
Description: Erfahren Sie elektrophysiologische Methoden zur Erforschung neuronaler Grundlagen des Sehens bei Limulus polyphemus. Diese Techniken ermöglichen Einblicke in visuelle Informationsverarbeitung und sind für Forschung und Lehre geeignet.

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Die Autoren bedanken sich bei Dr. Birgit Werner für ihre Hilfe bestätigen Sie mit der Erstellung dieses Video Artikel. Diese Arbeit wurde durch einen NSF Career Award finanziert.

Teil 1: Experimentelle Vorbereitung Experimentelle Verfahren auf Pfeilschwanzkrebse durchgeführt wurden vom Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der Boston University genehmigt worden. Die Tiere sind von der Marine Biological Labs (Woods Hole, MA) oder ein anderer Verkäufer erworben und befindet sich in einem belüfteten Salzwassertank in einem Raum ausgesetzt zu einem geregelten Hell-Dunkel-Zyklus. Die Beleuchtung Regime ist zum Mitführen der Krabbe circadianen Uhr und Radfahren das Auge täglich zwischen seiner Tages-und Nachtzeit Staaten wichtig. Unmittelbar vor Beginn einer invasiven Verfahren wird das Tier in einem Eiskübel für 10-15 Minuten gekühlt, bis seine Bewegung verlangsamt und dann auf einer hölzernen Plattform gesichert mit zwei Schrauben aus Edelstahl in der Prosoma eingesetzt und zwei in den Hinterleib. Die Plattform ist unter mit Granit gewichtet, so dass es im Wasser versinkt. Nach Anschluss Experimenten wird das Tier durch Eintauchen in Eis Gülle wieder und Rückenmarkzerstörung des Gehirns, die oberhalb der Mündung liegt, mit einem Skalpell eingeschläfert. Teil 2: Lösungen Limulus Ringer-Lösung ist von 430 mM NaCl, 9,56 mM KCl, 9.52 mM CaCl2, 9,97 mM MgCl2, 21.05 mM MgSO4, 50 &amp;mgr; TES, 50 &amp;mgr; HEPES und 10 ml / L Pen-Strep-Mix (Penicillin-Streptomycin, 10000 Einheiten / ml) zusammen . Teil 3: Elektroretinogramm Recording Die Werkzeuge für diese Prozedur benötigt eine Schraubenzieher, Vaseline, Ringer-Lösung, einer Transferpipette, eine grüne LED, eine Aufnahme Kammer, Schrauben aus Edelstahl und einem Wattestäbchen. <ol><li> Eine handgefertigte Kammer wird die ERG (Abbildung 1A) aufnehmen. Die Kammer Körper ist entworfen, um eine Kochsalzlösung Reservoir in Kontakt mit dem Auge zu halten. Der Deckel enthält eine Silberchlorid Draht zur Kopplung der leitende Lösung mit einem Verstärker und einem kleinen Loch so bemessen, dass eine LED aufnehmen. Eine ultrahelle mit Peak Emission um 520nm LED am besten funktioniert. </li><li> Um zu beginnen, ist die Unterseite der Kammer mit Vaseline beschichtet und gesichert über das Auge mit zwei Schrauben. </li><li> Die Kammer wird dann mit Kochsalzlösung gefüllt und verschlossen mit dem Deckel. </li><li> Nach Kammer Befestigung der Krebs ist in einem lichtdichten Käfig in einem Tank mit Meerwasser über die Kiemen gefüllt ist. </li><li> Die LED-Kabel wird in die Kammer Deckel eingefügt. </li><li> Das Signal führen ist, die Chlorid-Draht abgeschnitten, und der Verweis führt zu einer der implantierten Schrauben abgeschnitten. </li><li> Beide Leitungen sind auf den Kopf Stufe eines hochohmigen Differenzverstärker (X-cell 3x4, FHC Inc.) zur Signalverstärkung und der Verstärker-Filter gesetzt, um Frequenzen unterhalb 10Hz pass verbunden. </li><li> Der Verstärkerausgang ist an ein Oszilloskop für die Anzeige und einer Messkarte für Computer-Analyse und Speicherung zugeführt. </li><li> Nach der Einrichtung des Käfigs Tür geschlossen ist, um Platz Licht vom Erreichen des Tieres zu blockieren. </li><li> Die Daten werden mit einem benutzerdefinierten Programm in LabView geschrieben gesammelt. Das Programm blinkt die LED, Aufzeichnungen der evozierten ERG-Signal, und misst die peak-to-Peak-Ansprechen Amplitude. Die Wahl des Flash-Paradigma ist abhängig von der experimentellen Ziel. Zum Beispiel angewendet einer kurzen (100ms) Puls von 5V alle 10 Minuten, um die LED verhindert Wirkung von Licht Anpassung bei der Überwachung von circadianen Veränderungen in Augenempfindlichkeit. </li></ol> Teil 4: Sehnerv Aufnahme Die Werkzeuge für diese Prozedur benötigt eine Schraubendreher, Faden, ein Trepan, Ringer-Lösung, Rongeure, Vannas Schere, eine Aufnahme Kammer, gebogene Pinzette, feinen Nadel-Sonden, ein stumpfes Skalpell, chirurgische Scheren, und eine Saug-Elektrode. <ol><li> Eine handgefertigte Kammer wird benutzt, um Sehnerv Reaktionen (Abbildung 1B) aufnehmen. Das Innere der Kammer ist 2cm Durchmesser offene gut, dass eine dünne halbrunden Schlitzöffnung in der unteren Wand, um den Nerv unterzubringen und zu isolieren, sie aus den umliegenden Gewebe. </li><li> Bevor Kammer Befestigung einer 16-Gauge-Nadel wird zwischen dem Scharnier Muskeln in das Herz eingeführt und ~ 20ml Blut aus dem Tier abgelassen. Blutleere ist nicht notwendig, sondern macht Sehnerv Dissektion leichter. </li><li> Die Lage des Sehnervs ist, indem sie auf den Panzer einer leicht gebogenen Linie zwischen den seitlichen und mittleren Augen geschätzt. </li><li> Ein kreisrundes Loch wird dann in den Panzer mit einem Trepan geschnitten. Das Loch ist den gleichen Durchmesser wie die Kammer gut. Die Mitte des Loches ist 2-3 cm vor dem lateralen Auge und etwas dorsal der Linie, so dass der Nerv entlang der ventralen Teil der gut verläuft. </li><li> Das Bindegewebe wird gelöscht, bis der Nerv vollständig sichtbar und frei von umgebenden und darunter liegende Gewebe. </li><li> Ein Strang der Thread um den Nerv geschlungen und zog in die Kammer durch den Schlitz an der Unterseite. Durch diese gleiche Öffnung der Nerv vorsichtig in die Kammer durch Ziehen an der Schnur geführt. Zur gleichen Zeit der Kammer ist gut in das Loch gesteckt. Die Kammer wird dann auf dem Panzer angebrachtmit Schrauben und der Brunnen ist mit Ringer-Lösung gefüllt. </li><li> Nach Kammer Befestigung des Tieres wird in einem lichtdichten Käfig in einem Tank mit Meerwasser über die Kiemen gefüllt ist. </li><li> Der Brunnen ist unter einem Stereoskop (SMZ-168, Jed Pella Inc.) und Baumwolle ist rund um die Öffnung im Boden gepolstert, um das Auslaufen von Blut in und Kochsalzlösung aus der Kammer zu verhindern visualisiert. </li><li> Residual Bindegewebe um die Nerven mit einer feinen Schere und Pinzette entfernt und die Kammer wird mit frischem Ringer-Lösung aufgefüllt. </li><li> Ein nick ist in das Blutgefäß, dass der Nerv kapselt und durch diese Öffnung der Nerv sorgfältig entlang seiner Länge mit einer feinen Schere, Pinzette und Nadel-Sonden desheathed gemacht. </li><li> Ein winziges Faserbündel vom Nerv mit der Sonde und Schnitt am Ende am weitesten vom Auge für afferente Faser Aufnahme und am Ende am nächsten an das Auge für efferente Faser Aufnahme getrennt. In dem Video das Ende für afferente Faser-Aufnahmen geschnitten wird. </li><li> Ein microsuction Elektrode (AM Systems Inc) mit Ringer-Lösung gefüllt ist für Sehnerv Aufnahme verwendet. Die Elektrodenspitze ist es, die Nerven-Bündel von Feuerpolitur Ende einer 1mm Durchmesser Borosilikatglas Kapillare ausgestattet. </li><li> Die Elektrodenspitze wird in die Kammer auch mit einem manuellen Manipulator (WPI Inc) gesenkt, und der Schnitt Faserbündel in die Spitze gesaugt. Saug wird durch eine Gilmont Spritze verbunden mit der Elektrode über Schläuche zur Verfügung gestellt. </li><li> Ein BNC-Anschluss bietet die Signalleitung und eine Silberchlorid Draht um die Elektrode herum gewickelt, um Lärm zu reduzieren bietet die Referenz führen. Die beiden Leitungen sind an den Kopf der Bühne eines Differenzverstärkers zur Signalverstärkung und Rauschfilter (X-cell 3x4, FHC Inc.) verbunden. Der Verstärkerausgang ist an ein Oszilloskop für die Anzeige und eine Messkarte für Computer-Analyse und Speicherung an. </li><li> Die Daten werden mit einem benutzerdefinierten Programm in LabView geschrieben gesammelt. Das Programm steuert Lichtreize über einen digitalen Video-Prozessor (Bits + +, Cambridge Research Systems Inc) und Schnittstellen mit einer digitalen spike Diskriminator (APM, FHC Inc.), die Spike-Datensätze. Das Licht kann auf einzelne Zellen in das Auge über ein Glasfaserkabel Lichtleiter oder das gesamte Auge geliefert über einen Computer-gesteuerten Video-Display. </li></ol> Teil 5: intraretinale Aufnahme Die Werkzeuge für diese Prozedur benötigt gehören ein Schraubenzieher, ein L-förmiges Lucite-Plattform mit Gewindebohrungen, einer Mikroelektrode Halter mit einer Glaspipette, Schrauben aus Edelstahl, eine Pinzette und eine feine Skalpell. <ol><li> Eine handgefertigte Lucite-Platte mit voreingestellten Schraubenlöcher wird verwendet, um intrazelluläre Reaktionen aufzuzeichnen. Die Löcher sind für die Montage eines motorisierten Mikromanipulator (PPM5000, WPI Inc) angeordnet. Die Platte wird das Tier mit zwei Schrauben an der Seite und einer auf der Oberseite angebracht. </li><li> Nach Plattenbefestigung das Tier ist in einem lichtdichten Käfig in einem Tank mit Meerwasser über die Kiemen gefüllt ist. </li><li> Die micropositioner ist in der Platte verschraubt, mit seinem beweglichen Arm über dem Auge ausgerichtet. </li><li> Eine Charge von Glasmikropipetten sind aus 1-mm OD Borosilikatglas gezogen und die Spitzen sind durch Kapillarwirkung, indem Sie die Mikropipetten in einem kleinen Fläschchen mit 3M KCl-Lösung aufgefüllt. </li><li> Der Rest der Pipetten werden dann manuell mit der Salzlösung gefüllt und in einen Elektrodenhalter. </li><li> Der Elektrodenhalter ist auf den Kopf Stufe eines intrazellulären Verstärker (IR-283, Cygnus Technology Inc) angebracht, die micropositioner Arm verbunden. </li><li> Ein winziger Teil der Netzhaut (~ 1mm2) wird durch Wegschneiden der Hornhaut-Schnittstelle mit einer Rasierklinge ausgesetzt. </li><li> Ein Tropfen Ringer-Lösung basiert auf der Netzhaut platziert ausgesetzt Trocknung zu verhindern und die Mikropipette Spitze ist durch die Öffnung in Netzhautgewebe fortgeschritten. </li><li> Wenn die Spitze der Lösung eintritt, wird die Stromeinspeisung Modus des intrazellulären Verstärker engagiert und Elektrodenimpedanz gemessen. Mikropipetten mit einer Impedanz außerhalb des Bereichs von 20-70 MW werden verworfen. Wer in diesem Bereich sind in Mikron Schritte fortschrittliche und spießte in Zellen durch Vibrieren der Pipettenspitze elektronisch oder mechanisch. </li><li> Drei Arten von Zellen im Auge auftreten. Retinular Zellen zeigen nur eine depolarisierende Reaktion auf Licht, zeigen exzentrischen Zellen ein Zug der Aktionspotentiale reitet auf einem depolarisierenden Antwort, und Pigmentzellen zeigen keine leichte Reaktion. </li><li> Die Daten werden mit einem benutzerdefinierten Programm in LabVIEW geschrieben gesammelt. Das Programm steuert Lichtreize über einen digitalen Video-Prozessor (Bits + +, Cambridge Research Systems). Die Reize werden aufgespießt Zellen mit einem Glasfaser-Rohr-oder Video-Display ausgeliefert. Spannung Antworten sind auf dem Oszilloskop beobachtet und digitalisiert das Programm auf den Computer. </li></ol> Teil 6: Repräsentative Ergebnisse Ein Vertreter ERG ist in Abbildung 2a dargestellt. Die Wellenform stellt die summierten elektrischenReaktion auf Licht in erster Linie die photorezeptorischen retinular Zellen sind, wie sie wesentlich mehr Männer als die exzentrische Zellen und diesen elektrisch gekoppelt. Es gibt nicht mehrere Wellenform Komponenten aus verschiedenen retinalen Zelltypen wie bei den Säugetieren ERG. Circadian Feedback von einer Uhr in der Limulus Gehirn moduliert die physiologischen Eigenschaften der Zellen der Netzhaut auf einer täglichen Basis, wodurch die Amplitude und Zeitverlauf der ERG im Laufe der Zeit (1) variieren. Wie in Abbildung 2B gezeigt, ist ERG Amplitude am höchsten während des Tieres subjektiven Nacht und am niedrigsten bei der subjektiven Tag. Ein Vertreter Spur von einer einzigen optischen Nervenfasern Reaktion auf Licht ist in Abbildung 3 dargestellt. Exzentrische alle Zellen verhalten sich in etwa die gleichen, die eine vorübergehende Erhöhung der Spike-Fördermenge durch einen Zerfall zu einer nachhaltigen Niveau folgte. Die Rate Zerfall spiegelt die kombinierte Wirkung von Licht Anpassung und Spike-abhängige Selbst-Hemmung auf exzentrischen Zellen (2). Andere Spike-Muster, wie Licht-abhängige Abnahme der Geschwindigkeit, in der Limulus Gehirn gesehen, aber nicht das Auge (3). Vertreter Spuren der Spannung Reaktion eines Pigments Zelle, retinular Zelle und exzentrischen Zelle Licht sind in Abbildung 4 dargestellt. Nur die beiden letztgenannten retinalen Zelltypen sind visuell. Die Amplitude und Zeitverlauf der Reaktion hängt von der Qualität der Aufnahme und die Lage der Elektrode in der Zelle. Normalerweise dringt die Elektrode Pigmentzellen oder retinular Zellen aufgrund ihrer großen Anzahl und Größe. Wenn das letztere, eine vorübergehende Depolarisation, die zu einem nachhaltigen Niveau abfällt wird aufgezeichnet. Der Zerfall wird durch Helladaptation durch retinular Zellen (2). Wenn die Elektrode tritt eine exzentrische Zelle, sind groß Aktionspotentiale im Axon (40-70mV) und kleine Aktionspotentiale reitet auf einem depolarisierenden Wellenform (&lt;25mV) in der Nähe des Soma aufgezeichnet. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellungen der Kammern für Elektroretinogramm Aufnahme (A) und Sehnerv-Aufnahme (B) verwendet. Bar gleich 7mm in A und 5mm in B. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Beispiel Spur eines Limulus ERG durch ein 100ms evozierte LED-Puls von 5V im Dunkeln (A) und der Peak-to-peak Fluktuation in ERG Amplitude über die Zeit in konstanter Dunkelheit (B). Dunkel war die damals von den weißen Dreieck angezeigt eingeleitet. Das Wachstum in ERG Amplitude über die Zeit von der schwarzen Dreieck gekennzeichnet ist durch geringes Anpassung, die Augenempfindlichkeit steigt in der Dunkelheit. Die zyklischen Schwankungen in ERG Amplitude danach ist aufgrund des Tieres internen zirkadianen Uhr. Zeitpunkten in B sind alle 5min. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Beispiel Spur eines Sehnervs Faser Antwort auf eine einzige ommatidial Rezeptor blitzte Licht. Waveform oberhalb der Kurve zeigt Reiz Timing. Exzentrische Zellen, deren Axone führen zu Nervenfasern, die alle zeigen ein ähnliches Muster von Feuern, wie dies unter den Lichtverhältnissen des Experiments (5sec Blitz in völliger Dunkelheit). Retinal-Codierung mit Spikes ist eine Eigenschaft Limulus hat gemeinsam mit Säugetieren, im Gegensatz zu anderen Wirbellosen. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4 Beispiel Spuren von der Spannung als Reaktion auf die drei Zelltypen im Limulus lateral Auge Licht:. Pigment-Zelle (A), retinular Zelle (B), und exzentrische Zelle (C). Die erste Zelle ist nicht-visuelle. Die beiden letzteren auf einen Lichtblitz depolarisieren. Die Depolarisation ist das größte für retinular Zellen, weil sie das Licht transduzieren und senden das Signal über Gap Junctions, um den exzentrischen Zelle, mit einem gewissen Verlust auf dem Weg. In der exzentrischen Zelle werden Aktionspotentiale durch das Axon abgefeuert gesehen Reiten auf die Depolarisation durch spike Backpropagation in den Soma. Die Amplitude der Aktionspotentiale wurde in der Abbildung gedämpft für eine bessere Anzeige des depolarisierenden Potential. Das Ruhepotential der Zellen-50mV.

<ol><li>Barlow, R. B. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+in+the+Limulus+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms in the Limulus visual system.</a> J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).</li>
<li>Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+based+model+of+the+Limulus+lateral+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Cell based model of the Limulus lateral eye.</a> J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).</li>
<li>Snodderly, D. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+visual+inputs+by+the+brain+of+Limulus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Processing of visual inputs by the brain of Limulus.</a> J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).</li>
<li>Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+a+neural+code+for+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Deciphering a neural code for vision.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).</li>
<li>Barlow, R. B., Kaplan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limulus+lateral+eye%3A+properties+of+receptor+units+in+the+unexcised+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye.</a> Science. 174, 1027-1029 (1971).</li>
<li>Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Bellows+Cup+Electrode+Demonstrates+Low-frequency+Properties+of+Long-term+Electroretinographic+Recordings+in+the+Limulus+Lateral+Eye%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye.</a> J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).</li>
</ol>

Wir haben gezeigt, wie man ERG-Aufnahmen, Sehnerv-Aufnahmen und intraretinale Aufnahmen auf Pfeilschwanzkrebse in vivo durchzuführen. Die Aufnahme-Techniken bieten jeweils unterschiedliche Einblicke in die neuronalen Grundlagen des Sehens, und sie können alle verwendet werden, um die Funktion der Retina in lebenden Tieren durch die Krabbe große Augen und harten Panzer zu studieren. Sehnerv Aktivität kann auch von frei lebenden Tier in den Ozean mit der richtigen Konstruktion der Elektroden (4) aufgenommen werden. Diese ...

<table><tbody><tr><td>LED</td><td>Lichtquelle</td><td>Newark Inc</td><td>33C1292</td><td></td></tr><tr><td>Saug-Elektrode</td><td>Elektrode</td><td>A-M Systems</td><td>573000</td><td></td></tr><tr><td>XCell 3*4-Kanal-Außenzellverstärker</td><td>Verstärker</td><td>FHC, Inc.</td><td>40-40-8B</td><td></td></tr><tr><td>Intrazelluläre Aufzeichnung</td><td>Verstärker</td><td>Cygnus</td><td>IR-283A</td><td></td></tr><tr><td>APM</td><td>Neuronaler Spikendiskriminator</td><td>FHC, Inc.</td><td>APM</td><td></td></tr><tr><td>Bits++</td><td>Videokarte</td><td>Cambridge Research Systems</td><td>Bits++</td><td></td></tr><tr><td>Piezopatch-Manipulator</td><td>Mikropositionierer</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PPM5000</td><td></td></tr><tr><td>Rechteckpuls-Stimulator</td><td>Nervenstimulator</td><td>Grass Technologies</td><td>Modell S48</td><td></td></tr><tr><td>P-97</td><td>Mikropipettenzieher</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modell P-97</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat-Glaskapillare</td><td>Elektroden-Glas</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>Hufeisen&amp;#8211;krebs (&lt;em&gt;Limulus polyphemus&lt;/em&gt;)</td><td>Tier</td><td>Marine Biological Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenzieher</td><td>Glasziehgerät</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Zoom-Stereomikroskop</td><td>Mikroskop</td><td>Jed Pella Inc.</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr></tbody></table>

mit den horseshoe crab, limulus polyphemus, in vision research

Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

Der amerikanische Pfeilschwanzkrebs Limulus Polyphemus ist eines der ältesten Lebewesen auf der Erde, und das Tier weiterhin eine unverzichtbare Rolle in der biomedizinischen Forschung spielen. Nicht nur, dass ihr Blut enthält spezielle Zellen, die Wissenschaftler nutzen, um bacteriotoxins in unserer Medikamente zu erkennen, aber ihre Augen auch ein neuronales Netz, das viele Einblicke in Ihre physiologische Prozesse, die in unser visuelles System, wie Licht Anpassung und laterale Inhibition zur Verfügung gestellt hat. Die Pfeilschwanzkrebses bleibt ein attraktives Modell für Vision Forschung, weil das Tier ist groß und robust für ein Wirbellosen, seine Netzhautneuronen groß und leicht zugänglich sind, ist seine visuelle System kompakt und umfassend untersucht, und seine visuelle Verhalten ist gut definiert. Darüber hinaus sind die Struktur und Funktion der Augen moduliert auf einer täglichen Basis von einem circadianen Uhr in der Tier-s Gehirn. Kurz gesagt, ist das visuelle System des Pfeilschwanzkrebse einfach genug, um noch verstanden werden komplex genug, um interessant sein. In diesem Video stellen wir Ihnen drei elektrophysiologischen Paradigmen zur Untersuchung der neuronalen Grundlagen der Vision, die in vivo mit Limulus durchgeführt werden kann. Sie sind Elektroretinogramm Aufnahme, Sehnerv Aufnahme und intra-Aufnahme. Elektroretinogramm (ERG) Aufnahmen Maßnahme mit einer Fläche Elektrode der summierten elektrischen Reaktion aller Zellen im Auge, um einen Lichtblitz. Sie können verwendet werden, um die allgemeine Empfindlichkeit des Auges für verlängern Zeiträume zu überwachen. Sehnerv Aufnahmen messen spiking Aktivität einzelner Nervenfasern mit einer extrazellulären microsuction Elektrode. Sie können zur visuellen Botschaften vermittelt vom Auge an das Gehirn sowie circadiane Uhr Nachrichten zurück aus dem Gehirn zum Auge geführt zu studieren. Intraretinale Aufnahmen Maßnahme mit einer intrazellulären Mikroelektrode die Spannungsschwankungen durch Licht in einzelne Zellen des Auges ausgelöst. Sie können verwendet werden, um zelluläre Mechanismen der retinalen Verarbeitung aufzuklären.

In diesem Video führen wir Elektroretinogramm Aufnahme, Sehnerv Aufnahme und intra-Aufnahme mit dem amerikanischen Pfeilschwanzkrebs<em&gt; Limulus Polyphemus</em&gt;. Diese elektrophysiologischen Paradigmen können für die Untersuchung der neuronalen Grundlagen des Sehens in der Forschung oder Lehre Labor verwendet werden.

Mit den Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, In Vision Research

Der Amerikanische Hufeisenkrabbe, Limulus polyphemus, ist eines der ältesten Lebewesen auf der Erde, und das Tier spielt weiterhin eine unverzichtbare Rolle bei ...

Hallo, ich bin Chris Paglia, Leiter des Labors für visuelle Informationsverarbeitung am Department für Biomedizinische Technik an der Boston University. Hallo, ich bin Jacque Liu, Doktorandin in Dr. Paglias Labor. Die Forschungsaktivitäten unseres Labors zielen darauf ab, die neuronalen Berechnungen zu verstehen, die es Tieren ermöglichen, zu sehen.Für diese Forschung nutzen wir eines der ältesten Lebewesen der Erde, den amerikanischen Pfeilgräten. Diese Tiere könnten lebende Fossilien sein. Sie spielen weiterhin eine unverzichtbare Rolle in der biomedizinischen Forschung.Nicht nur enthalten ihre Blutkörperchen spezielle Zellen, die Wissenschaftler zur Detektion von Bakteriengiften in unseren Arzneimitteln nutzen, sondern auch ihr Auge besitzt ein neuronales Netzwerk, das tiefgreifende Einblicke in die Funktionsweise unseres Sehsystems ermöglicht hat. Die zelluläre Grundlage von Prozessen wie Lichtanpassung und lateraler Hemmung wurde erstmals in Studien an den zusammengesetzten Seitenaugen dieses Tieres aufgeklärt, und für diese bahnbrechende Arbeit erhielt Dr. Keffer Hartline 1967 den Nobelpreis. Der Atlantische Pfeilgiftkrebs bleibt ein attraktives Modell für die Sehforschung, da das Tier für ein Wirbelloses groß und robust ist und seine Netzhautneuronen groß und leicht zugänglich sind.Sein Sehsystem ist kompakt und umfassend erforscht, und sein visuelles Verhalten ist gut charakterisiert. Darüber hinaus werden Struktur und Funktion der Augen täglich durch eine circadiane Uhr im Gehirn des Tieres moduliert. Kurz gesagt, ist das Sehsystem der Pfeilschwanzkrebse einfach genug, um verstanden zu werden, und gleichzeitig komplex genug, um interessant zu sein.In diesem Video stellen wir drei experimentelle Paradigmen zur Untersuchung der neurobiologischen Grundlagen der Sehfunktion vor, die in vivo an diesem klassischen Tiermodell durchgeführt werden können. Für die Sehforschung sind dies die Elektroretinogrammableitung, die Ableitung am Sehnerv und die intraretinale Ableitung. Die Hufeisenkrebs werden in einem belüfteten Salzwassertank in einem Raum gehalten, der einem regulierten Hell-Dunkel-Wechsel ausgesetzt ist.Bevor mit einer der Aufnahmetechniken begonnen wird, werden die Tiere etwa 10 Minuten lang in einem Eimer mit Eis abgekühlt und anschließend durch zwei Edelstahlschrauben im Pro-Soma und zwei weiteren im EPI-Soma auf einer Holzplattform fixiert. Unterhalb ist die Plattform mit Granit beschwert, sodass sie im Wasser versinkt. Das Elektroretinogramm oder ERG dient zur Überwachung der Empfindlichkeit des Auges im Zeitverlauf.Es misst die grobe elektrische Antwort aller Zellen im Auge. Für diesen Vorgang benötigte Lichtblitz-Werkzeuge umfassen einen Schraubendreher, Vaseline, Ringer-Lösung, eine Pipette, eine LED, eine Ableitkammer, Edelstahlschrauben und einen Wattestäbchen. Wir verwenden eine selbstgebaute Ableitkammer, um die ERG zu messen.Der Körper ist so konstruiert, dass er ein Reservoir mit Kochsalzlösung enthält, das mit dem Auge in Kontakt steht. Der Deckel enthält einen Silberchlorid-Draht, um die leitfähige Lösung mit einem Verstärker zu koppeln, sowie ein kleines Loch, das für eine LED ausgelegt ist, bevor diese angebracht wird. Die Unterseite der Kammer ist mit Vaseline beschichtet.Die Kammern wurden anschließend mit zwei mit Salzlösung gefüllten und verschlossenen Schrauben über dem Hufeisenkrebsauge befestigt. Das Tier wird in einen lichtdichten Käfig in einem Becken mit Meerwasser über den Kiemen platziert. Das LED-Kabel wird in den Kammerndeckel eingeführt.Die Signalleitung wird an den Kammern Draht und die Referenzleitung an eine der implantierten Schrauben geklemmt, und beide Leitungen werden an die Kopfstufe eines Differenzverstärkers mit hohem Eingangswiderstand zur Signalverstärkung und Rauschfilterung angeschlossen. Der Käfig wird dann so geschlossen, dass kein Raumlicht das Tier erreicht. Die ad-Stufe ist mit dem Verstärker verbunden, und die Verstärkerfilter sind so eingestellt, dass Frequenzen unter etwa 10 Hertz durchgelassen werden.Von dort gelangt das Signal zum Oszilloskop zur Ansicht und zu einer Datenerfassungskarte für die Computeranalyse und -speicherung. Wir verwenden ein benutzerdefiniertes Programm, das in LabVIEW geschrieben wurde, um Lichtreize von der LED zu liefern und das ERG-Signal aufzuzeichnen. Die LED wird alle 10 Minuten mit einem 100 Millisekunden langen Puls von fünf Volt ausgelöst. Links ist die ERG-Wellenform auf jeden Lichtblitz dargestellt, und rechts ist die Spitze-zu-Spitze-Amplitude aufeinanderfolgender Blitzwellenformen aufgetragen, um Änderungen der Empfindlichkeit des Auges im Zeitverlauf zu verfolgen.Mit ERG-Aufnahmen können die Effekte der Lichtanpassung und der zirkadianen neuronalen Modulation untersucht werden. Das Auge leitet visuelle Signale an das Gehirn weiter und die Aktionspotenzialantworten seiner Nervenfasern des Sehnervs. Die codierten Signale können durch extrazelluläre Ableitung von einzelnen Nervenfasern untersucht werden.Methoden, bei denen circadiane Uhrsignale an das Auge zurückgeleitet werden, können ebenfalls mit dieser Methode untersucht werden. Für dieses Verfahren benötigte Werkzeuge sind ein Schraubendreher, eine Schere, eine Ringer-Lösung, gekrümmte Pinzetten, eine feine Nadelsonde, ein stumpfes Skalpell, chirurgische Scheren und eine Schneidelektrode. Die Aufzeichnungskammern sind mit einer Zunge ausgestattet, um den Nerv aufzunehmen. 20 Milliliter Blut können aus dem Herzen der Krabbe entnommen werden, indem eine 16-Gauge-Nadel zwischen die Scharniermuskulatur und das Herz eingeführt wird.Die Exsanguination ist nicht notwendig, erleichtert jedoch die Sehnerv-Dissektion, wenn das Tier auf der Plattform fixiert ist. Die Lage des Sehnervs wird geschätzt, indem eine leicht gekrümmte Linie am Karpus zwischen den lateralen und medianen Augen eingezeichnet wird. Anschließend wird mit einem Refin ein kreisförmiges Loch in den Karpus gebohrt.Das Loch hat den gleichen Durchmesser wie der Boden der Kammer. Das Zentrum des Lochs befindet sich etwa zwei Zentimeter vor dem seitlichen Auge und leicht dorsal zur Linie, sodass der Nerv entlang des ventralen Abschnitts der Kammer verläuft. Das überlagernde Bindegewebe wird so lange entfernt, bis eine vollständige Strecke des Nervs sichtbar ist, und der freigelegte Nerv wird von umgebendem und darunterliegendem Gewebe gelöst. Ein Faden wird um den Nerv geschlungen und durch die halbkreisförmige Öffnung im Boden in die Kammer hineingezogen.Durch dieselbe Öffnung wird der Nerv vorsichtig in die Kammer hineingeführt, indem an dem Faden gezogen wird. Während der Nerv in die Kammer eindringt, wird der Boden in das Loch geschoben, um die Dehnung des Nervs zu minimieren. Anschließend wird die Kammer mit zwei Schrauben befestigt und mit Ringer-Lösung gefüllt.Nach der Befestigung der Kammer wird das Tier in einen Beleuchtungskäfig in einem Tank mit Meerwasser über den Kiemen platziert. Das Innere der Kammer wird unter einem Stereomikroskop sichtbar gemacht, und Baumwolle wird um die Öffnung der Unterseite gepolstert, um ein Eindringen von Blut in die Kammer und ein Austreten von Ringer-Lösung zu verhindern. Die Kammer wird mit frischer Ringer-Lösung erneut befüllt.Restliches Gewebe wird mit feinen gebogenen Scheren und Pinzetten entfernt. Es wird ein kleiner Schnitt in die Hülle gemacht, die den Nerv umgibt, und der Nerv wird mit einer feinen Nadelsonde von der Hülle gelöst. Die Hülle wird schrittweise abgewickelt und durch Einschneiden entlang der Länge des Nervs entfernt.Ein kleines Faserbündel wird dann mit der Sonde aus dem Nerv gelöst und am Ende, das am weitesten vom Auge entfernt liegt, für die afferente Faserableitung und am Ende, das dem Auge am nächsten liegt, für die efferente Faserableitung, durchtrennt. Zur Ableitung verwenden wir eine Schnitt-Elektrode nach dem AM-System, die mit Ringerlösung gefüllt ist und über eine Schlauchverbindung mit einer Gilson-Spritze zur Absaugung verbunden ist. Die Elektrodenspitze wird hergestellt, indem das Ende einer ein Millimeter durchmessenden Borosilikatglas-Kapillare (A und C) mit dem Bunsenbrenner poliert wird; eine B- und C-Verbindung liefert die Signalleitung, und die Referenzleitung besteht aus einem Silberchlorid-Draht, der um die Elektrode gewickelt ist, um Störgeräusche zu reduzieren.Die Elektrodenspitze wird in die Ableitungskammer positioniert und das durchtrennte Ende des Nervenbündels wird über Saugung in die Glasöffnung gezogen. Die Signalleitung und die Referenzleitung werden an die Kopfstufe eines Differenzverstärkers zur Signalverstärkung und Rauschfilterung angeschlossen. Die Ausgabe des Verstärkers wird an ein Oszilloskop zur Darstellung sowie an eine Datenerfassungskarte zur Computeranalyse und -speicherung weitergeleitet.Wir verwenden ein speziell angefertigtes, in LabVIEW geschriebenes Programm zur Steuerung von Lichtreizen und einen digitalen Spikendiskriminator zur Aufzeichnung von Spiketrainen. Für die Einzelzellbeleuchtung kommt ein Lichtleiter aus Glasfaser zum Einsatz, während für die Musterstimulation bei Ableitungen vom Sehnerv eine computergesteuerte Videodarstellung verwendet wird, mit der man die Signalübertragung zwischen Auge und Gehirn intraretinal untersuchen kann. Die Ableitung erfolgt durch Einführen einer Mikroelektrode direkt in Zellen des Auges und Aufzeichnung der durch Licht induzierten intrazellulären Spannungsschwankungen.Zu den für dieses Verfahren benötigten Werkzeugen gehören ein Schraubendreher, eine L-förmige durchsichtige Plattform. Die Gewindeschraubenlöcher eines Mikroelektrodenhalters über der Glaselektrode, Edelstahlschrauben, Pinzette und ein feines Skalpell. Nach der Fixierung der Krabbe wird ein stabiler Halter, eine Holzplattform, eine durchsichtige Platte mit vorgegebenen Schraubenlöchern, mit zwei Schrauben an der Seite und einer Schraube an der Oberseite am Carpus befestigt.Das Tier wird in einen lichtdichten Käfig in einem Behälter platziert, der mit Meerwasser über den Kiemen gefüllt ist. Ein motorisierter Mikropositionierer wird mit Schrauben an der Klinge befestigt, und der Arm des Positionierers wird über dem Auge ausgerichtet. Eine Charge aus Glas-Mikropipetten wird aus Silikatglas mit einem Außendurchmesser von einem Millimeter gezogen, und die Spitzen werden durch Kapillarwirkung rückgefüllt.Indem die Pipetten einige Minuten lang in ein Gefäß mit dreimolarer Kaliumchloridlösung gestellt werden, wird der restliche Teil der Pipette manuell mit der Salzlösung gefüllt und anschließend in einen Mikroelektrodenhalter eingeführt, der zur Vermeidung von Blasenbildung vorab mit Lösung gefüllt wurde. Der Elektrodenhalter wird dann in die Kopfstufe eines an den Mikropositionierer befestigten intrazellulären Verstärkers eingesetzt. Ein Abschnitt der Netzhaut wird freigelegt, indem vorsichtig ein kleines quadratisches Stück der dorsalen Hornhaut herausgeschnitten wird.Mit dem Skalpell wird ein Tropfen Ringer-Lösung auf das exponierte Gewebe gegeben, um Austrocknung zu verhindern, und die Mikropipette wird in Richtung Netzhaut vorgeschoben. Wenn die Pipettenspitze die Lösung berührt, wird der Strominjektionsmodus des intrazellulären Verstärkers aktiviert und die Elektrodenimpedanz gemessen; Mikropipetten mit Impedanzen außerhalb des Bereichs von 20 bis 70 Megaohm werden verworfen. Pipetten mit Impedanzen in diesem Bereich werden schrittweise in mikroskopisch kleinen Schritten in die Netzhaut vorgeschoben und durch elektronische Vibration der Spitze in Zellen eingestochen; Lichtreize werden zur Erfassung der Zellen über eine Glasfaserleitung oder eine Videodarstellung zugeführt.Drei Arten von Zellen können im Auge des Hufeisenkrebses angetroffen werden: Ular-Zellen, exzentrische Zellen und Pigmentzellen. Ular-Zellen zeigen eine starke Depolarisation als Antwort auf Licht, exzentrische Zellen zeigen eine Serie von Aktionspotentialen auf einer Depolarisationsantwort, während Pigmentzellen überhaupt keine Lichtantworten zeigen. Die Antwort wird auf einem Oszilloskop beobachtet und mittels intraretinaler Ableitungen auf einem Computer aufgezeichnet. So lässt sich die zelluläre Grundlage der Sehfunktion untersuchen.Zusammenfassend haben wir gezeigt, wie man Elektroretinogrammaufnahmen, Aufnahmen vom Sehnerv und intraretinale Aufnahmen an lebenden Pfeilkrabben durchführt. Diese Methoden sind weit verbreitet und liefern einzigartige Einblicke in die neuronalen Mechanismen der visuellen Informationsverarbeitung bei Pfeilkrabben. Sie sind nicht nur einfach in einem Forschungslabor anzuwenden, sondern können auch problemlos in ein Lehrpraktikum zur visuellen Neurophysiologie integriert werden.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Der amerikanische Pfeilschwanzkrebs Limulus Polyphemus, ist wohl die günstigste Quelle für große Mengen von Blut aller Wirbellosen. Das Blut ist einfach in der Komposition, mit nur einem Zelltyp in der allgemeinen Zirkulation, die körnige Amöbocyten, und nur drei vorkommenden Proteine ​​im Plasma, Hämocyanin, das C-reaktive Proteine ​​und α2-Makroglobulin. Das Blut wird vom Herzen gesammelt und die Blutzellen und Plasma durch Zentrifugation abgetrennt.

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Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging

Die Dissektionstechnik zeigt Enukleation der Maus Auge für Gewebefixierung um Phänotypisierung in Hochdurchsatz-Screening durchzuführen.

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