Mit den Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, In Vision Research

Hallo, ich bin Chris Paglia, Leiter des Labors für visuelle Informationsverarbeitung am Department für Biomedizinische Technik an der Boston University. Hallo, ich bin Jacque Liu, Doktorandin in Dr. Paglias Labor. Die Forschungsaktivitäten unseres Labors zielen darauf ab, die neuronalen Berechnungen zu verstehen, die es Tieren ermöglichen, zu sehen.

Für diese Forschung nutzen wir eines der ältesten Lebewesen der Erde, den amerikanischen Pfeilgräten. Diese Tiere könnten lebende Fossilien sein. Sie spielen weiterhin eine unverzichtbare Rolle in der biomedizinischen Forschung.

Nicht nur enthalten ihre Blutkörperchen spezielle Zellen, die Wissenschaftler zur Detektion von Bakteriengiften in unseren Arzneimitteln nutzen, sondern auch ihr Auge besitzt ein neuronales Netzwerk, das tiefgreifende Einblicke in die Funktionsweise unseres Sehsystems ermöglicht hat. Die zelluläre Grundlage von Prozessen wie Lichtanpassung und lateraler Hemmung wurde erstmals in Studien an den zusammengesetzten Seitenaugen dieses Tieres aufgeklärt, und für diese bahnbrechende Arbeit erhielt Dr. Keffer Hartline 1967 den Nobelpreis. Der Atlantische Pfeilgiftkrebs bleibt ein attraktives Modell für die Sehforschung, da das Tier für ein Wirbelloses groß und robust ist und seine Netzhautneuronen groß und leicht zugänglich sind.

Sein Sehsystem ist kompakt und umfassend erforscht, und sein visuelles Verhalten ist gut charakterisiert. Darüber hinaus werden Struktur und Funktion der Augen täglich durch eine circadiane Uhr im Gehirn des Tieres moduliert. Kurz gesagt, ist das Sehsystem der Pfeilschwanzkrebse einfach genug, um verstanden zu werden, und gleichzeitig komplex genug, um interessant zu sein.

In diesem Video stellen wir drei experimentelle Paradigmen zur Untersuchung der neurobiologischen Grundlagen der Sehfunktion vor, die in vivo an diesem klassischen Tiermodell durchgeführt werden können. Für die Sehforschung sind dies die Elektroretinogrammableitung, die Ableitung am Sehnerv und die intraretinale Ableitung. Die Hufeisenkrebs werden in einem belüfteten Salzwassertank in einem Raum gehalten, der einem regulierten Hell-Dunkel-Wechsel ausgesetzt ist.

Bevor mit einer der Aufnahmetechniken begonnen wird, werden die Tiere etwa 10 Minuten lang in einem Eimer mit Eis abgekühlt und anschließend durch zwei Edelstahlschrauben im Pro-Soma und zwei weiteren im EPI-Soma auf einer Holzplattform fixiert. Unterhalb ist die Plattform mit Granit beschwert, sodass sie im Wasser versinkt. Das Elektroretinogramm oder ERG dient zur Überwachung der Empfindlichkeit des Auges im Zeitverlauf.

Es misst die grobe elektrische Antwort aller Zellen im Auge. Für diesen Vorgang benötigte Lichtblitz-Werkzeuge umfassen einen Schraubendreher, Vaseline, Ringer-Lösung, eine Pipette, eine LED, eine Ableitkammer, Edelstahlschrauben und einen Wattestäbchen. Wir verwenden eine selbstgebaute Ableitkammer, um die ERG zu messen.

Der Körper ist so konstruiert, dass er ein Reservoir mit Kochsalzlösung enthält, das mit dem Auge in Kontakt steht. Der Deckel enthält einen Silberchlorid-Draht, um die leitfähige Lösung mit einem Verstärker zu koppeln, sowie ein kleines Loch, das für eine LED ausgelegt ist, bevor diese angebracht wird. Die Unterseite der Kammer ist mit Vaseline beschichtet.

Die Kammern wurden anschließend mit zwei mit Salzlösung gefüllten und verschlossenen Schrauben über dem Hufeisenkrebsauge befestigt. Das Tier wird in einen lichtdichten Käfig in einem Becken mit Meerwasser über den Kiemen platziert. Das LED-Kabel wird in den Kammerndeckel eingeführt.

Die Signalleitung wird an den Kammern Draht und die Referenzleitung an eine der implantierten Schrauben geklemmt, und beide Leitungen werden an die Kopfstufe eines Differenzverstärkers mit hohem Eingangswiderstand zur Signalverstärkung und Rauschfilterung angeschlossen. Der Käfig wird dann so geschlossen, dass kein Raumlicht das Tier erreicht. Die ad-Stufe ist mit dem Verstärker verbunden, und die Verstärkerfilter sind so eingestellt, dass Frequenzen unter etwa 10 Hertz durchgelassen werden.

Von dort gelangt das Signal zum Oszilloskop zur Ansicht und zu einer Datenerfassungskarte für die Computeranalyse und -speicherung. Wir verwenden ein benutzerdefiniertes Programm, das in LabVIEW geschrieben wurde, um Lichtreize von der LED zu liefern und das ERG-Signal aufzuzeichnen. Die LED wird alle 10 Minuten mit einem 100 Millisekunden langen Puls von fünf Volt ausgelöst. Links ist die ERG-Wellenform auf jeden Lichtblitz dargestellt, und rechts ist die Spitze-zu-Spitze-Amplitude aufeinanderfolgender Blitzwellenformen aufgetragen, um Änderungen der Empfindlichkeit des Auges im Zeitverlauf zu verfolgen.

Mit ERG-Aufnahmen können die Effekte der Lichtanpassung und der zirkadianen neuronalen Modulation untersucht werden. Das Auge leitet visuelle Signale an das Gehirn weiter und die Aktionspotenzialantworten seiner Nervenfasern des Sehnervs. Die codierten Signale können durch extrazelluläre Ableitung von einzelnen Nervenfasern untersucht werden.

Methoden, bei denen circadiane Uhrsignale an das Auge zurückgeleitet werden, können ebenfalls mit dieser Methode untersucht werden. Für dieses Verfahren benötigte Werkzeuge sind ein Schraubendreher, eine Schere, eine Ringer-Lösung, gekrümmte Pinzetten, eine feine Nadelsonde, ein stumpfes Skalpell, chirurgische Scheren und eine Schneidelektrode. Die Aufzeichnungskammern sind mit einer Zunge ausgestattet, um den Nerv aufzunehmen. 20 Milliliter Blut können aus dem Herzen der Krabbe entnommen werden, indem eine 16-Gauge-Nadel zwischen die Scharniermuskulatur und das Herz eingeführt wird.

Die Exsanguination ist nicht notwendig, erleichtert jedoch die Sehnerv-Dissektion, wenn das Tier auf der Plattform fixiert ist. Die Lage des Sehnervs wird geschätzt, indem eine leicht gekrümmte Linie am Karpus zwischen den lateralen und medianen Augen eingezeichnet wird. Anschließend wird mit einem Refin ein kreisförmiges Loch in den Karpus gebohrt.

Das Loch hat den gleichen Durchmesser wie der Boden der Kammer. Das Zentrum des Lochs befindet sich etwa zwei Zentimeter vor dem seitlichen Auge und leicht dorsal zur Linie, sodass der Nerv entlang des ventralen Abschnitts der Kammer verläuft. Das überlagernde Bindegewebe wird so lange entfernt, bis eine vollständige Strecke des Nervs sichtbar ist, und der freigelegte Nerv wird von umgebendem und darunterliegendem Gewebe gelöst. Ein Faden wird um den Nerv geschlungen und durch die halbkreisförmige Öffnung im Boden in die Kammer hineingezogen.

Durch dieselbe Öffnung wird der Nerv vorsichtig in die Kammer hineingeführt, indem an dem Faden gezogen wird. Während der Nerv in die Kammer eindringt, wird der Boden in das Loch geschoben, um die Dehnung des Nervs zu minimieren. Anschließend wird die Kammer mit zwei Schrauben befestigt und mit Ringer-Lösung gefüllt.

Nach der Befestigung der Kammer wird das Tier in einen Beleuchtungskäfig in einem Tank mit Meerwasser über den Kiemen platziert. Das Innere der Kammer wird unter einem Stereomikroskop sichtbar gemacht, und Baumwolle wird um die Öffnung der Unterseite gepolstert, um ein Eindringen von Blut in die Kammer und ein Austreten von Ringer-Lösung zu verhindern. Die Kammer wird mit frischer Ringer-Lösung erneut befüllt.

Restliches Gewebe wird mit feinen gebogenen Scheren und Pinzetten entfernt. Es wird ein kleiner Schnitt in die Hülle gemacht, die den Nerv umgibt, und der Nerv wird mit einer feinen Nadelsonde von der Hülle gelöst. Die Hülle wird schrittweise abgewickelt und durch Einschneiden entlang der Länge des Nervs entfernt.

Ein kleines Faserbündel wird dann mit der Sonde aus dem Nerv gelöst und am Ende, das am weitesten vom Auge entfernt liegt, für die afferente Faserableitung und am Ende, das dem Auge am nächsten liegt, für die efferente Faserableitung, durchtrennt. Zur Ableitung verwenden wir eine Schnitt-Elektrode nach dem AM-System, die mit Ringerlösung gefüllt ist und über eine Schlauchverbindung mit einer Gilson-Spritze zur Absaugung verbunden ist. Die Elektrodenspitze wird hergestellt, indem das Ende einer ein Millimeter durchmessenden Borosilikatglas-Kapillare (A und C) mit dem Bunsenbrenner poliert wird; eine B- und C-Verbindung liefert die Signalleitung, und die Referenzleitung besteht aus einem Silberchlorid-Draht, der um die Elektrode gewickelt ist, um Störgeräusche zu reduzieren.

Die Elektrodenspitze wird in die Ableitungskammer positioniert und das durchtrennte Ende des Nervenbündels wird über Saugung in die Glasöffnung gezogen. Die Signalleitung und die Referenzleitung werden an die Kopfstufe eines Differenzverstärkers zur Signalverstärkung und Rauschfilterung angeschlossen. Die Ausgabe des Verstärkers wird an ein Oszilloskop zur Darstellung sowie an eine Datenerfassungskarte zur Computeranalyse und -speicherung weitergeleitet.

Wir verwenden ein speziell angefertigtes, in LabVIEW geschriebenes Programm zur Steuerung von Lichtreizen und einen digitalen Spikendiskriminator zur Aufzeichnung von Spiketrainen. Für die Einzelzellbeleuchtung kommt ein Lichtleiter aus Glasfaser zum Einsatz, während für die Musterstimulation bei Ableitungen vom Sehnerv eine computergesteuerte Videodarstellung verwendet wird, mit der man die Signalübertragung zwischen Auge und Gehirn intraretinal untersuchen kann. Die Ableitung erfolgt durch Einführen einer Mikroelektrode direkt in Zellen des Auges und Aufzeichnung der durch Licht induzierten intrazellulären Spannungsschwankungen.

Zu den für dieses Verfahren benötigten Werkzeugen gehören ein Schraubendreher, eine L-förmige durchsichtige Plattform. Die Gewindeschraubenlöcher eines Mikroelektrodenhalters über der Glaselektrode, Edelstahlschrauben, Pinzette und ein feines Skalpell. Nach der Fixierung der Krabbe wird ein stabiler Halter, eine Holzplattform, eine durchsichtige Platte mit vorgegebenen Schraubenlöchern, mit zwei Schrauben an der Seite und einer Schraube an der Oberseite am Carpus befestigt.

Das Tier wird in einen lichtdichten Käfig in einem Behälter platziert, der mit Meerwasser über den Kiemen gefüllt ist. Ein motorisierter Mikropositionierer wird mit Schrauben an der Klinge befestigt, und der Arm des Positionierers wird über dem Auge ausgerichtet. Eine Charge aus Glas-Mikropipetten wird aus Silikatglas mit einem Außendurchmesser von einem Millimeter gezogen, und die Spitzen werden durch Kapillarwirkung rückgefüllt.

Indem die Pipetten einige Minuten lang in ein Gefäß mit dreimolarer Kaliumchloridlösung gestellt werden, wird der restliche Teil der Pipette manuell mit der Salzlösung gefüllt und anschließend in einen Mikroelektrodenhalter eingeführt, der zur Vermeidung von Blasenbildung vorab mit Lösung gefüllt wurde. Der Elektrodenhalter wird dann in die Kopfstufe eines an den Mikropositionierer befestigten intrazellulären Verstärkers eingesetzt. Ein Abschnitt der Netzhaut wird freigelegt, indem vorsichtig ein kleines quadratisches Stück der dorsalen Hornhaut herausgeschnitten wird.

Mit dem Skalpell wird ein Tropfen Ringer-Lösung auf das exponierte Gewebe gegeben, um Austrocknung zu verhindern, und die Mikropipette wird in Richtung Netzhaut vorgeschoben. Wenn die Pipettenspitze die Lösung berührt, wird der Strominjektionsmodus des intrazellulären Verstärkers aktiviert und die Elektrodenimpedanz gemessen; Mikropipetten mit Impedanzen außerhalb des Bereichs von 20 bis 70 Megaohm werden verworfen. Pipetten mit Impedanzen in diesem Bereich werden schrittweise in mikroskopisch kleinen Schritten in die Netzhaut vorgeschoben und durch elektronische Vibration der Spitze in Zellen eingestochen; Lichtreize werden zur Erfassung der Zellen über eine Glasfaserleitung oder eine Videodarstellung zugeführt.

Drei Arten von Zellen können im Auge des Hufeisenkrebses angetroffen werden: Ular-Zellen, exzentrische Zellen und Pigmentzellen. Ular-Zellen zeigen eine starke Depolarisation als Antwort auf Licht, exzentrische Zellen zeigen eine Serie von Aktionspotentialen auf einer Depolarisationsantwort, während Pigmentzellen überhaupt keine Lichtantworten zeigen. Die Antwort wird auf einem Oszilloskop beobachtet und mittels intraretinaler Ableitungen auf einem Computer aufgezeichnet. So lässt sich die zelluläre Grundlage der Sehfunktion untersuchen.

Zusammenfassend haben wir gezeigt, wie man Elektroretinogrammaufnahmen, Aufnahmen vom Sehnerv und intraretinale Aufnahmen an lebenden Pfeilkrabben durchführt. Diese Methoden sind weit verbreitet und liefern einzigartige Einblicke in die neuronalen Mechanismen der visuellen Informationsverarbeitung bei Pfeilkrabben. Sie sind nicht nur einfach in einem Forschungslabor anzuwenden, sondern können auch problemlos in ein Lehrpraktikum zur visuellen Neurophysiologie integriert werden.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.