Large Insert Environmental Genomic Bibliothek Produktion

Hallo, ich bin Marcus to aus dem Labor von Steven Helm am Department für Mikrobiologie und Immunologie der University of British Columbia. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Konstruktion einer Umweltbibliothek mit großem Insert. Bei dem heutigen Verfahren assistieren mir San Lee, die die Phagenverpackung und Infektion des Bibliotheks-Wirtes E. coli durchführen wird, sowie Elise Hawley und Chin Yang, die die Kolonieauswahl vornehmen werden.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Struktur und den Stoffwechsel mikrobieller Gemeinschaften in marinen und terrestrischen Umgebungen zu untersuchen. Beginnen wir also. Dieses Protokoll zur Erstellung einer fosmidischen DNA-Bibliothek setzt nach der Isolierung und Fragmentierung genomischer DNA aus Biomassenproben an, Schritte, die wir in begleitenden JoVE-Artikeln ausführlich beschrieben haben.

Die nächsten Schritte bereiten die SHE-DNA für die Ligierung in den SMID-Vektor PCC one vor. Der erste Schritt besteht darin, die Enden der SHE-DNA-Stücke zu reparieren und zu phosphorylieren. An den fünfsträngigen Enden – alle für diesen Schritt notwendigen Reagenzien sind im PCC one SMID-Bibliotheks-Produktionskit von Epicenter enthalten – um die Endreparationsreaktion vorzubereiten, alle Reagenzien auf Eis auftauen lassen und dann den Endreparationspuffer, DNTP-Mix, aTP sowie bis zu 20 Mikrogramm SHE-Insert-DNA mit einer Konzentration von 0,5 Mikrogramm pro Mikroliter Enzymmix und Wasser so kombinieren, dass ein Gesamtvolumen von 80 Mikrolitern erreicht wird. Den Tube kurz zentrifugieren, um die gesamte Flüssigkeit auf den Boden zu bringen.

Die Endreparaturreaktion bei Raumtemperatur 45 Minuten bis eine Stunde inkubieren. Anschließend die Enzyme bei 70 Grad Celsius für 10 Minuten hitzeinaktivieren. Während der Inkubation der Endreparatur können Sie das Gel für den nächsten Schritt vorbereiten.

Pulsfeld-Gelelektrophorese oder PFGE, Ihr Ziel ist es, DNA-Moleküle im Bereich von 30 bis 60 Kilobasen zu isolieren. PFGE ist eine elektrophoretische Methode zur Auftrennung dieser großen Fragmente, die bei der Standardgelelektrophorese zusammenlaufen. Bereiten Sie zunächst ein 1 %-Gel unter Verwendung von Low-Melting-Agarose in 150 Milliliter 1×TAE-Laufpuffer vor.

Wählen Sie Kämme, die es ermöglichen, die gesamte 80-Mikroliter-Probe der Endreparatur-DNA zusammen mit dem Ladepuffer in ein oder zwei Gelen einzuladen. Seien Sie besonders vorsichtig beim Umgang mit dem Gel, da Gele aus niedrig schmelzendem Agarose sehr empfindlich sind und leicht brechen, während das Gel erstarrt.

Bereiten Sie die Elektrophoresekammer vor. Geben Sie 2,2 Liter eines XTAE in die Kammer und schalten Sie das Gerät ein, um den Laufpuffer zu zirkulieren. Stellen Sie die Kühlvorrichtung auf 14 Grad Celsius ein und setzen Sie die Pumpe auf 70 U/min.

Schließen Sie einen mittleren Ein-PFG-Marker von NEB ein. Um zu vermeiden, dass das Gel zu hoch geschnitten wird, pressen Sie Aros aus der Gelspritze aus und schneiden Sie mit dem Skalpell einen kleinen Pfropfen vom Ende ab. Legen Sie den Pfropfen an die Vorderseite der Vertiefung und versiegeln Sie ihn mit geschmolzenem Aros.

Stellen Sie sicher, dass der Laufpuffer auf 14 Grad Celsius abgekühlt ist, bevor Sie Ihr Gel beladen. In das erste Brunnen laden Sie fünf Mikroliter des New England Biolabs Lambda Hindi drei Verdauungsmusters. In das zweite Brunnen laden Sie ein Mikroliter des Smid-Kontrollgrößenmarkers, der in 10 Mikrolitern steriler Wasser plus Ladebuffer verdünnt wurde.

Beladen Sie dann Ihre endreparierte und durch Erhitzen inaktivierte Mischung zusammen mit dem Puffer zum Beladen. Schließen Sie den Deckel und programmieren Sie das Gerät. Der Gel läuft über Nacht oder 12 Stunden.

Wenn das Gel durchgelaufen ist, verwenden Sie eine Cyber-Gold-Färbung, um die DNA sichtbar zu machen. Verdünnen Sie das Cyber-Gold in 250 Milliliter 1×TAE, legen Sie das Gel in die Lösung und färben Sie es eine Stunde lang im Dunkeln – Cyber-Gold ist lichtempfindlich. Während das Gel gefärbt wird, bereiten Sie ein Wasserbad bei 70 Grad Celsius und ein weiteres bei 45 Grad Celsius für den anschließenden Schritt der Gel-Extraktion vor.

Der nächste Schritt besteht darin, das Gel zu schneiden und die DNA im gewünschten Größenbereich von 30 bis 60 Kilobasen zu reinigen. Nehmen Sie Ihr angefärbtes Gel zusammen mit einem leeren, zerrissenen und beschrifteten Mikrosubterfuge-Röhrchen sowie einem sterilen Skalpell zum Blaulicht-Transilluminator.

Legen Sie den Transilluminator mit Plastikfolie aus, um eine Kreuzkontamination Ihres Gels zu vermeiden. Tragen Sie die Schutzbrille und schalten Sie das blaue Licht ein. Nun können Sie Ihre endreparierte genomische DNA und den FO smid-Kontrollgrößenmarker sehen. Mit dem Skalpell schneiden Sie einen Gelstreifen von fünf bis sieben Millimetern Breite aus, der mit dem smid-Kontrollgrößenmarker mitgelaufen ist und sich leicht darüber befindet.

Verwenden Sie den PFG-Marker als obere Grenze für Ihren Schnitt. Überführen Sie den Schnitt in das aufgerissene Röhrchen. Die Schnitte können bei minus 20 Grad Celsius bis zu einem Jahr lang gelagert werden, bevor Sie fortfahren.

Jetzt ist es an der Zeit, das Gel zu verwenden. Reinigen Sie die DNA aus Ihrem Schnitt. Wiegen Sie das Röhrchen mit Ihrem Gelschnitt und berechnen Sie das Gewicht des Schnitts, indem Sie das Tarragewicht subtrahieren.

Als Nächstes schmelzen Sie den Gelstreifen im Wasserbad bei 70 Grad Celsius 10 bis 15 Minuten lang auf. Sobald der Gelstreifen vollständig geschmolzen ist, überführen Sie das Gefäß schnell in das Wasserbad bei 45 Grad Celsius. Beachten Sie, dass ein Milligramm festes Gel nach dem Schmelzen ein Volumen von einem Mikroliter hat.

Gebe eine Einheit oder ein Mikroliter Jase-Enzympräparation pro 100 Mikroliter geschmolzenes Aros hinzu. Inkubiere eine Stunde lang bei 45 Grad Celsius. Danach weitere zwei bis vier Mikroliter Les zugeben und eine weitere Stunde bei 45 Grad Celsius unter Hitzeeinwirkung inkubieren.

Die Gelelektrophorese bei 70 Grad Celsius für 10 Minuten nach der Hitzebehandlung inaktivieren. Um das Enzym zu inaktivieren, stellen Sie das Röhrchen für 10 Minuten auf Eis und zentrifugieren Sie anschließend mit maximaler Geschwindigkeit, 13.000 U/min, für 15 Minuten, um unlösliche Partikel zu pelletieren.

Vorsichtig vorgehen, um den Pellet nicht aufzuwirbeln. Die obere Überstandslösung, die die gereinigte DNA enthält, abnehmen und in ein 15-Milliliter-Falcon-Gefäß überführen. Anschließend mit drei Millilitern sterilen Wassers verdünnen, um die DNA zu waschen und zu konzentrieren.

Überführen Sie die Lösung aus dem 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen in eine Ancon-Ultra-4-Zentrifugalfiltereinheit mit einer Ultrazell-10-Membran. Stellen Sie die Filtereinheit in einen Schwenkköbelrotor, wobei ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen als Adapter dient, und zentrifugieren Sie bei 4.000 × g für sechs bis acht Minuten. Zentrifugieren Sie, bis etwa 100 bis 500 Mikroliter Lösung verbleiben.

Verbleiben Sie auf dem Filter und entsorgen Sie den Durchlauf. Geben Sie dann weitere drei Milliliter sterilem Wasser in den leeren Falcon-Röhrchen. Überführen Sie die Lösung in das Amon-Röhrchen und wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt.

Spülen Sie den Falcon-Röhrchen ein drittes Mal und reduzieren Sie das endgültige auf dem Filter gesammelte Volumen auf 50 bis 100 Mikroliter. Sie müssen keine Sorge haben, die Probe zu verlieren. Der Filter behält 50 Mikroliter Flüssigkeit zurück, selbst nach längerer Zentrifugation.

Überführen Sie die restliche DNA-Lösung aus dem AmCon-Röhrchen in eine vorgewaschene MicroCon YM 50 Zentrifugalfiltereinheit und spülen Sie das Amon-Röhrchen mit weiteren 50 Mikrolitern sterilem Wasser aus, um die gesamte DNA zu gewinnen. Zentrifugieren Sie die MicroCon YM 50 Zentrifugalfiltereinheit in einer Mikrozentrifuge bei 10.000 × g, bis der Filter noch leicht mit Flüssigkeit bedeckt ist. Überprüfen Sie den Vorgang jede Minute.

Wenn nur eine kleine Menge Flüssigkeit auf dem Filter verbleibt, drehen Sie den Filter um und gewinnen Sie Ihre DNA-Lösung durch eine zweite Zentrifugation bei 1000 × g für drei Minuten in einem frischen Mikrozentrifugenröhrchen zurück. Das resultierende Volumen sollte insgesamt 10 bis 15 Mikroliter nicht überschreiten.

Andernfalls könnte Ihre DNA für die Ligierung zu stark verdünnt sein. Überprüfen Sie die Konzentration der resultierenden DNA-Lösung mittels NanoDrop oder Pico-Green-Assay. Wiederhergestellt und repariert.

Die DNA ist nun bereit, an den PCC one FO SMID-Klonierungsvektor ligiert zu werden. Zum Ligationsansatz alle Reagenzien auf Eis auftauen. Anschließend in der hier aufgeführten Reihenfolge zusammengeben, wobei nach jeder Zugabe gründlich gemischt wird. Zunächst sterilem Wasser hinzufügen, um ein Reaktionsvolumen von 10 Mikroliter zu erreichen.

Dann 10× Fast-Link-Ligationspuffer, 10 Millimolar A-T-P-P-C-C, einen SMID-Vektor und Insert im molaren Verhältnis von 10 zu 1. Und schließlich Fast-Link-DNA-Ligase. Zentrifugieren Sie das Gefäß kurz, um die gesamte Flüssigkeit an den Boden zu bringen.

Tippen Sie auf das Röhrchen und zentrifugieren Sie erneut. Inkubieren Sie die Ligationsreaktion zwei Stunden bei Raumtemperatur und inaktivieren Sie das Enzym anschließend 10 Minuten bei 70 Grad Celsius durch Erhitzen. An diesem Punkt können Sie die Ligationsreaktion entweder bei minus 20 Grad Celsius lagern oder mit dem Phagenverpackungsschritt fortfahren.

Der nächste Schritt besteht darin, Bakteriophagen zu erzeugen, die dazu dienen, Ihre FO SMID-Bibliothek in E. coli einzubringen. Zwei oder drei Tage vor dem geplanten Phagen-Verpackungsschritt streichen Sie den bereitgestellten EPI 300 T1-resistenten Überimpfstamm auf eine gewöhnliche LB-Platte und inkubieren diese über Nacht bei 37 Grad Celsius, um Einzelkolonien zu erhalten. Sie können diese Platte versiegeln und bei 4 Grad Celsius für die spätere Verwendung aufbewahren. Am Tag vor den Verpackungsreaktionen impfen Sie 50 Milliliter Albee-Bouillon mit 10 Millimolar Magnesiumsulfat mit einer einzelnen Kolonie von Ihrer Epi 300-Platte an und schütteln über Nacht bei 225 U/min und 37 Grad Celsius.

Am Tag der Verpackungsreaktionen 50 Milliliter frische LB-Brühe mit 10 Millimolar Magnesiumsulfat mit fünf Millilitern der Übernachtkultur beimpfen. Die Bakterien bei 37 Grad Celsius bis zu einem OD 600 von 0,8 bis 1,0 kultivieren. Den OD 600 von 1,0 nicht überschreiten.

Verdünnen Sie Ihre Probe, bevor Sie sie im Spektrophotometer messen, um ein genaues Ergebnis zu erhalten. Lagern Sie sie auf Eis oder bei vier Grad Celsius, bis Sie fortfahren möchten, oder bis zu 72 Stunden. Da die Bakterien nun bereit für die Infektion sind, ist es an der Zeit, das Phagen-Tau vorzubereiten.

Die max-Plaques Lambda Packaging werden auf Eis extrahiert. Unter Verwendung eines Reagenzglases pro Ligationsreaktion dauert das Auftauen etwa 10 bis 15 Minuten. In der Zwischenzeit kühlen Sie erneut ein leeres 1,5-Milliliter-Gefäß pro Reaktion auf Eis vor.

Nachdem die Lambda-Verpackungsextrakte aufgetaut sind, überführen Sie sofort 25 Mikroliter jedes Verpackungsextrakts in eine vorab gekühlte 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrobe und stellen Sie diese auf Eis. Bringen Sie den verbleibenden Verpackungsextrakt zurück auf minus 80 Grad Celsius. Wenn die aufgetauten Verpackungsextrakte zu lange auf Eis verbleiben, verringert sich die Infektionseffizienz.

Fügen Sie anschließend 10 Mikroliter der Ligationsreaktion zu jeweils 25 Mikrolitern der auf Eis aufgetauten Extrakte hinzu, indem Sie die Lösung mehrmals vorsichtig mit einer Pipette mischen, ohne Luftblasen einzuschließen. Kurz zentrifugieren, um die gesamte Flüssigkeit am Boden der Röhrchen zu sammeln, und inkubieren Sie die Verpackungsreaktionen 90 Minuten lang in einem Wasserbad bei 30 Grad Celsius. Nach 80 Minuten Inkubation tauen Sie den verbleibenden Verpackungsextrakt auf Eis auf.

Nach Abschluss der 90-minütigen Verpackungsreaktion die verbleibenden 25 Mikroliter Verpackungsextrakt zu jedem Reaktionsröhrchen hinzufügen. Die Reaktionen weitere 90 Minuten bei 30 Grad Celsius inkubieren. Nach der zweiten Inkubation 100 Mikroliter des vorbereiteten Phagenteilpuffer zu jedem Verpackungsröhrchen hinzufügen und vorsichtig fünf Mikroliter Chloroform zu jedem Röhrchen geben.

Jetzt sollten Sie ein Gesamtvolumen von 165 Mikrolitern im Reaktionsgefäß haben. Nach der Zugabe von Chloroform kann sich ein viskoser Niederschlag bilden. Vermeiden Sie diesen Niederschlag sowie die organische Chloroformphase, wenn Sie die Phagenteilchen abpipettieren.

An diesem Punkt können die verpackten Phagenpartikel bei vier Grad mehrere Tage lang gelagert werden, falls erforderlich, aber für optimale Ergebnisse sollten frisch hergestellte Phagen verwendet werden. Nun sind Sie bereit, die Wirtszellen zu infizieren, die Sie während der Phagenverpackungsschritte kultiviert haben, mit den verpackten Phagen. Geben Sie verpackte Phagen zu EPI 300 T1-resistenten Wirtszellen mit einem OD600 von 0,8 bis 1,0 im Verhältnis von 400 Mikrolitern EPI 300 T1-resistenter Zellen pro 10 Mikroliter Phagenpartikel hinzu.

Um das Pipettieren von Chloroform aus dem Boden des Röhrchens mit verpackten Phagen zu vermeiden, verwenden wir 125 Mikroliter der verpackten Phagenpartikel und fünf Milliliter vorbereiteter epi 300 T1-resistenter Wirtszellen, die vorsichtig gemischt und anschließend 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert werden. Der nächste Schritt besteht darin, die Titer der verpackten Phagen zu bestimmen. Dies erfolgt durch das Auftragen der infizierten Bakterien auf ein Medium, um infizierte Zellen auszuwählen.

Danach die resultierenden Kolonien zählen und durch das Volumen des Phagen teilen, das den ausplattierten Bakterien zugesetzt wurde. Der C one SMID enthält ein Chloramphenicol-Resistenzgen. Um infizierte Klone auszuwählen, die Bakterien auf LB-Platten mit Chloramphenicol ausplattieren.

Verteilen Sie zweimal 50 Mikroliter und zweimal 10 Mikroliter der mit Phagen infizierten EPI 300 T1-resistenten Zellen auf vier separate Platten und stellen Sie die Platten umgedreht in einen 37 °C-Inkubator für 16 bis 24 Stunden, höchstens jedoch 48 Stunden, bis Kolonien entstehen. In der Zwischenzeit gewinnen Sie die restlichen EPI 300 T1-resistenten Zellen aus der fünf Milliliter großen Infektion durch Zentrifugation bei 3.500 ×g für 10 Minuten bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand.

Fügen Sie ein Milliliter LB mit 20 % Glycerin zum Röhrchen hinzu. Suspendieren Sie das Zellpellet und portionieren Sie jeweils 100 Mikroliter in zweimilliliter-Kryoröhrchen, gefrieren Sie diese sofort ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Für die spätere Verwendung im Kolonie-Auswahl-Schritt am nächsten Tag zählen Sie die Anzahl der Klone auf den vier Platten im 37-Grad-Celsius-Inkubator und bestimmen die Titer der verpackten Phagen, die Sie im nächsten Schritt verwenden.

Die gefrorene EPI 300 T1-resistente Glycerin-Stammlösung enthält Zellen, die mit allen verschiedenen Plasmiden Ihrer Bibliothek transduziert wurden. Verteilen Sie anschließend eine geeignete Menge basierend auf der viralen Titer und der Plattendicke jedes smid. Klonen Sie auf 2,45 × 2,45 Millimeter Quadrat.

Bioassay-Platten mit LB und Chloramphenicol unter Verwendung von Glasperlen. Geben Sie außerdem eine kleine Menge LB-Brühe auf die Platte, um Ihre Zellen gleichmäßig zu verteilen. Beachten Sie, dass die Herstellung der Glycerin-Stammlösung Ihre Zellen zusätzlich etwa fünf- bis sechsfach konzentriert.

Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden am Tag der Kolonieauswahl; bereiten Sie 96- oder 3 × 84-Loch-Platten vor, die mit jeweils 200 µL oder 70 µL LB-Brühe pro Loch gefüllt sind. Die Brühe ist mit 12,5 µg Chloramphenicol pro mL Brühe zur Antibiotikaselektion und mit 10 % Glycerin zum Einfrieren angereichert. Für diesen Schritt verwenden wir das automatisierte qfi-three-Plattenfüllsystem.

Der nächste Schritt besteht darin, Kolonien von Ihren vorbereiteten LB-CHLORAMPHENICOL-Platten in Ihre vorbereiteten 96- oder 384-Well-Platten zum Einfrieren zu übertragen. Für diesen Schritt verwenden wir gemäß der Bedienungsanleitung den Kolonie-picking-Roboter qix two, um einen sterilen Bereich um die Kolonie-picking-Zone zu erzeugen. Schalten Sie das UV-Licht ein und lassen Sie es 30 Minuten lang eingeschaltet.

Stellen Sie 500 Milliliter 1 %ige Bleichlösung, 500 Milliliter sterilem deionisiertem Wasser und 500 Milliliter 80 %igen Ethanol bereit. Wenn das UV-Licht erlischt, füllen Sie die Tabletts entsprechend der Beschriftung von hinten nach vorne auf. Füllen Sie zunächst 1 %ige Bleichlösung, dann autoklaviertes deionisiertes Wasser und anschließend 80 %igen Ethanol in das vordere Tablett.

Stellen Sie sicher, dass sie voll sind, da Pinnadeln ohne ausreichende Waschlösung nicht ordnungsgemäß gereinigt werden können. Nachdem Sie die Parameter für eine optimale Auswahl eingestellt haben, nehmen Sie die Deckel von Ihren Bakterienplatten und den mit LB befüllten 96- oder 384-Loch-Platten ab und platzieren Sie sie zwischen den Halterungen des Q-Picks. Die Arbeitsplatten sollten eng an der vorderen rechten Ecke anliegen, damit sie während des Pickvorgangs nicht verrutschen können.

Danach die Frontplatte schließen. Sobald alle Parameter eingestellt sind, kann das Pflückverfahren beginnen. Nach Abschluss des gesamten Pflückvorgangs die Bürsten und Tabletts mit entionisiertem Wasser spülen und zum Trocknen auf die Arbeitsfläche stellen.

Beseitigen Sie eventuelle Verschüttungen und wischen Sie das Innere des CICS mit 80 % Ethanol ab. Stellen Sie sicher, dass alle Glycerin-Stammpflanzen beschriftet sind, und legen Sie sie für 24 Stunden in den 37 Grad Celsius Inkubator, um eine Kultur von jeder ausgewählten Kolonie anzuziehen. Hinterlassen Sie einen Zettel am Inkubator, der die Anzahl der inkubierten Platten, das Datum, die Inkubationszeit, die Entnahmzeit und Ihre Initialen enthält.

Nach der Inkubation haben Sie Ihre Bibliothek. Jeder Wells enthält eine Kultur eines bakteriellen Klons, der das PCC mit einem Stück fragmentierter DNA aus Ihrer Ausgangsprobe ligiert enthält. Gefrieren Sie die Platten bei minus 80 Grad Celsius zur Langzeitlagerung ein und gratulieren Sie sich zu guter Arbeit.

Das vorgestellte Protokoll beschreibt das Verfahren zur Erstellung einer Umwelt-SMID-Bibliothek, um den genetischen Inhalt einer mikrobiellen Gemeinschaft in einem bestimmten Lebensraum einzufangen. Dieses Protokoll soll eine SMID-Bibliothek erzeugen, die repräsentativ für den genetischen Inhalt des untersuchten Milieus ist, und dem Leser ermöglichen, kritische Schritte zu optimieren. Falls die Menge an FO-SMID-Klonen am Ende des gesamten Verfahrens zu gering ist.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man die FO-SMID-Bibliothek aus genomischer DNA, die aus einer Meerwasserprobe gewonnen wurde, konstruiert. Bei dieser Methode ist es wichtig, mit hochwertiger genomischer DNA zu beginnen. Stellen Sie sicher, dass alle Platten und Reagenzien vorbereitet sind, bevor Sie beginnen, und planen Sie ausreichend Zeit für diesen mehrstufigen Prozess ein.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.