Name: Large Insert Environmental Genomic Bibliothek Produktion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 59 s
Description: Erfahren Sie die Konstruktion einer großen Insert-Umweltgenombibliothek aus marinen Proben. Diese Methode nutzt Fosmid-Vektoren, Phagen-Verpackung und automatisierte Koloniepflückung für Sequenzierung und funktionelle Analysen.

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Wir möchten den kanadischen Stiftung für Innovation, der British Columbia Knowledge Development Fund und der National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada für die Unterstützung laufender Studien auf niedrigem Sauerstoffgehalt Regionen der Küsten-und offenen Meer zu danken. MT und SL wurden von Stipendien von der Stiftung finanziert TULA Zentrum für Mikrobielle Vielfalt und Evolution (CMDE) unterstützt. MT erhielt Stipendium von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG).

<ol><li>Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seawater+sampling+and%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Seawater sampling and.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+volume+%2820L%2B%29+filtration+of+coastal+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples.</a> J Vis Exp. 28, (2009).</li>
<li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Extraction+from+0.22+%CE%BCM+Sterivex+Filters+and+Cesium+Chloride+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation.</a> J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).</li>
<li>Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+uncultivated+prokaryotes%3A+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).</li>
<li>Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).</li>
<li>DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+Ocean%27s+interior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li>
<li>Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+methanogenesis%3A+testing+the+hypothesis+with+environmental+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics.</a> Science. 305, 1457-1462 (2004).</li>
</ol>

Eine Prozedur ist beschrieben, wie man am effizientesten erzeugt eine große einsetzen Fosmid Bibliothek mit genomischer DNA aus einer Küstengewässer Probe abgeleitet. Up-stream genomischen DNA-Extraktion ist in einem gesonderten Protokoll [3] beschrieben. Als Fosmid-Bibliothek Produktion ist ein mehrstufiger Prozess-, Plan mindestens zwei vor drei Wochen in der Zeit für das gesamte Verfahren einschließlich aller vier vorgestellten Schritte. Die Extraktion von genomischer DNA ist der wichtigs...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Schritt II&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CopyControl&amp;#8482; Fosmid-Bibliothek-Herstellungskit</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>CCFOS110</td><td>ausreichend für die Erzeugung von 9–10 Fosmid-Bibliotheken</td></tr><tr><td>SeaPlaque-Agarose</td><td>Cambrex</td><td>50100</td><td></td></tr><tr><td>Rührheizplatte</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>1,0X TAE-Laufpuffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHEF Mapper XA Pulsfeld-Gelelektrophorese-System inklusive Kühlmodul und variabler Drehzahlpumpe</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;#955; DNA-HindIII-Digest</td><td>New England Biolabs</td><td>N3012S</td><td></td></tr><tr><td>MidRange I PFG-Marker</td><td>New England Biolabs</td><td>N3551S</td><td></td></tr><tr><td>10.000X SYBR Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowellengeeignete Plastikfolie</td><td>Saran Premium Wrap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager Transilluminator</td><td>Invitrogen</td><td>S37102</td><td></td></tr><tr><td>GELase Agarose-Gel-Verdau-Präparation</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>G09100</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Zentrifugalfiltereinheit mit Ultracel-10-Membran</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Microcon YM-30 Zentrifugalfiltereinheit</td><td>EMD Millipore</td><td>42410</td><td></td></tr><tr><td>nukleasefreies Wasser</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA-Assay-Kit *2000 Assays*#</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Digitaler Trockenblockheizer</td><td>VWR international</td><td>12621-088</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>VWR international</td><td>14231-854</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Avanti J-E</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenrotor</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>JA 5.3</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen, 1,7 mL, klar</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>15-mL-Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Schritt III&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB-Brühe</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 1426-2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Phagenverdünnungspuffer</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl [pH 8,3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Kryoröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Schritt IV&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit Deckel</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003370(3370)</td><td></td></tr><tr><td>384-Well-Platte mit Deckel</td><td>Fisher Scientific</td><td>07201157(3680)</td><td></td></tr><tr><td>Petri-Schalen 100 O.D. x 15 mm H</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Petri-Schalen 150 Dia. x 15 mm H</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-14</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon BioDish XL 245 x 245 mm</td><td>VWR international</td><td>CABD351040</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>LB-Brühe</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 1426-2</td><td></td></tr><tr><td>Difco-Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>Glasperlen</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-310-1</td><td></td></tr><tr><td>QFill3</td><td>Genetix</td><td>X3050</td><td></td></tr><tr><td>Bleichmittel</td><td>Javex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>15-mL-Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>QPix Koloniepicker</td><td>Genetix</td><td>QPix2</td><td></td></tr><tr><td>Pick-Kopf (E. coli)</td><td>Genetix</td><td>X4006</td><td></td></tr></tbody></table>

large insert environmental genomic bibliothek produktion

Large Insert Environmental Genomic Library Production

Die überwiegende Mehrheit der Mikroben in der Natur bestehen derzeit noch unzugänglich traditionellen Anbaumethoden. Während des letzten Jahrzehnts, Kultur-unabhängigen Umweltgutachter genomische (<em&gt; Dh</em&gt; Metagenomische) Ansätze entstanden, so dass die Forscher diese Lücke Anbau durch die Erfassung der genetischen Inhalt der indigenen mikrobiellen Gemeinschaften direkt aus der Umwelt zu überbrücken. Zu diesem Zweck sind genomischen DNA-Bibliotheken unter Verwendung von Standardtechniken wenn auch kunstvolle Labor Klonierungstechniken. Hier beschreiben wir den Bau einer großen einfügen Umwelt genomische Fosmid Bibliothek mit DNA aus der vertikalen Tiefe Kontinuum einer saisonal hypoxischen Fjord abgeleitet. Dieses Protokoll wird direkt an eine Reihe von verbundenen Protokolle einschließlich der Küstengewässer Meerwasser Probenahme [1] verbunden, großvolumige Filtration von mikrobieller Biomasse [2] und ein DNA-Extraktion und Reinigung-Protokoll [3]. Zu Beginn ist von hoher Qualität genomischen DNA mit der Schaffung von 5-phosphorylierten stumpfen Enden Ende repariert. End-reparierte DNA ist Puls-Feld-Gelelektrophorese (PFGE) für Größe Auswahl und Gel-Extraktion wird durchgeführt, um DNA-Fragmente zwischen 30 und 60 Tausend Basenpaaren (Kb) in der Länge wieder ausgesetzt. Größe ausgewählt DNA liegt abseits der PFGE Gelmatrix gereinigt und ligiert, um die Phosphatase-behandelten blunt-end Fosmid CopyControl Vektor pCC1 (EPICENTRE<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"&gt; Http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a&gt;). Linear Konkatemeren von pCC1 und Insert-DNA werden anschließend headfull verpackt in Phagenpartikel durch Lambda terminase, mit nachfolgender Infektion des Phagen-resistente<em&gt; E. coli</em&gt; Zellen. Erfolgreich transduzierten Klone auf LB-Agarplatten unter Antibiotika-Selektion erholt und archiviert in 384-Well-Platten-Format mit Hilfe eines automatisierten Kolonie Kommissionier-Roboter (Qpix2, GENETIX). Das aktuelle Protokoll speist sich aus verschiedenen Quellen, einschließlich der CopyControl Fosmid Bibliothek Production Kit von EPICENTRE und die veröffentlichten Arbeiten mehrerer Arbeitsgruppen [4-7]. Jeder Schritt wird mit Best-Practice im Auge präsentiert. Wann immer möglich, werden wir Feinheiten in der Ausführung Highlight die allgemeine Qualität und Effizienz der Bibliothek Produktion zu verbessern. Der gesamte Prozess der Fosmid Bibliothek Herstellung und automatisierte Kommissionierung Kolonie dauert mindestens 7-10 Tage, da es viele Inkubationsschritte enthalten sind. Allerdings gibt es mehrere Haltestellen möglich, die innerhalb des Protokolls genannt sind.

Bau eines Fosmid Bibliothek mit Umwelt-genomischer DNA aus der vertikalen Tiefe Kontinuum einer saisonal hypoxischen Fjord isoliert beschrieben. Der resultierende Klon-Bibliothek ist in 384-Well-Platten aufgenommen und archiviert für Downstream-Sequenzierung und funktionelle Screening durch die Anwendung eines automatisierten Kolonie Kommissioniersystem.

Large Insert Environmental Genomic Bibliothek Produktion

Die überwältigende Mehrheit der Mikroben in der Natur bleibt derzeit für traditionelle Kultivierungsmethoden unzugänglich. Im letzten Jahrzehnt haben kulturenunabhängige ...

Hallo, ich bin Marcus to aus dem Labor von Steven Helm am Department für Mikrobiologie und Immunologie der University of British Columbia. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Konstruktion einer Umweltbibliothek mit großem Insert. Bei dem heutigen Verfahren assistieren mir San Lee, die die Phagenverpackung und Infektion des Bibliotheks-Wirtes E. coli durchführen wird, sowie Elise Hawley und Chin Yang, die die Kolonieauswahl vornehmen werden.Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Struktur und den Stoffwechsel mikrobieller Gemeinschaften in marinen und terrestrischen Umgebungen zu untersuchen. Beginnen wir also. Dieses Protokoll zur Erstellung einer fo smid DNA-Bibliothek setzt nach der Isolierung und Fragmentierung der genomischen DNA aus Biomasseproben an, Schritte, die wir in begleitenden JoVE-Artikeln ausführlich beschrieben haben.Die nächsten Schritte bereiten die SHE-DNA für die Ligierung in den SMID-Vektor PCC one vor. Der erste Schritt besteht darin, die Enden der DNA-Stücke von SHE zu reparieren und zu phosphorylieren. Für die fünfsträngigen Enden sind alle für diesen Schritt erforderlichen Reagenzien im PCC one SMID-Bibliotheks-Produktionskit von Epicen

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Forschung

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Biology

Biologie

Large-Scale-Bildschirme von Metagenombanken

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung der beiden einzigen gelesen und gepaart Ende Illumina mRNA-Seq-Sequenzierung Bibliotheken zur Genexpressionsanalyse auf T7 lineare RNA-Amplifikation basieren. Dieses Protokoll erfordert nur 10 Nanogramm ab Gesamt-RNA und erzeugt sehr konsistent Bibliotheken für ganze Transkripte.

Single Read und Paired End mRNA-Seq Illumina Bibliotheken von 10 Nanogramm Gesamt-RNA

Der genetische Reporter-Assay ist ein gut etabliertes und leistungsfähiges Werkzeug, um die Beziehung zwischen DNA-Sequenzen und ihren genregulatorischen Aktivitäten zu entschlüsseln. Die Kopplung von regulatorischen Elementkandidaten an Reportergene, die identifizierende Sequenz-Tags tragen, ermöglicht eine massive Parallelisierung dieser Assays.

Massively Parallel Reporter Assays in kultivierte Säugerzellen

Dieses Manuskript beschreibt einen automatisierten Ansatz zur Auswahl der Gelgröße zur Aufreinigung von DNA-Fragmenten für die Next-Generation-Sequenzierung. Die Ranger-Technologie ermöglicht die vollständige Automatisierung des gesamten Prozesses der Beladung des Agarosegels, der elektrophoretischen Analyse und der Rückgewinnung von DNA-Zielfragmenten und ermöglicht so einen hohen Durchsatz und eine hohe Qualität der Sequenzierungsbibliotheken der nächsten Generation.

Automatisierte Gel Größenauswahl, um die Qualität der nächsten Generation Sequencing Libraries von Umweltwasserproben vorbereitet verbessern

Methoden zur Generierung von groß angelegten gRNA Bibliotheken sollte einfach, effizient und kostengünstig sein. Wir beschreiben ein Protokoll für die Herstellung von gRNA Bibliotheken basierend auf enzymatische Verdauung von Ziel DNA. Diese Methode CORALINA (umfassende gRNA Bibliothek Generation durch kontrollierte Nuklease Aktivität) stellt eine Alternative zu teuren benutzerdefinierte Oligonukleotid-Synthese.

Ein universelles Protokoll für groß angelegte gRNA Bibliothek Produktion aus jeder DNA-Quelle

Mit einem pBIBAC-GW binären Vektor macht Erzeugung transgene Pflanzen mit intakten Single Copy Einfügungen, ein einfacher Vorgang. Hier präsentiert eine Reihe von Protokollen, die führen des Lesers durch den Prozess der Generierung von transgenen Pflanzen in Arabidopsis und Versuchsanlagen für Unversehrtheit und Anzahl der Einsätze zu kopieren.

Generierung von transgenen Pflanzen mit Single-Copy-Einschübe mit binären Vektor BIBAC-GW

Wir beschreiben eine Methode zur Generierung von sättigungsverstärkenden Mutationsbibliotheken in gramnegativen Bakterien und der anschließenden Herstellung von DNA-Amplikonbibliotheken für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Als Beispiel konzentrieren wir uns auf den ESKAPE-Erreger Acinetobacter baumannii, aber dieses Protokoll ist für eine Vielzahl von Gram-negativen Organismen zugänglich.

Generieren von Transposon-Einfügungsbibliotheken in gramnegativen Bakterien für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz

Dieses Protokoll beschreibt einen umfassenden Ansatz für die Kultivierung, Sequenzierung und De-novo-Hybridgenomassemblierung von Harnbakterien.   Es bietet ein reproduzierbares Verfahren zur Erzeugung vollständiger, zirkulärer Genomsequenzen, die bei der Untersuchung sowohl chromosomaler als auch extrachromosomaler genetischer Elemente nützlich sind, die zur Kolonisierung im Urin, zur Pathogenese und zur Verbreitung antimikrobieller Resistenzen beitragen.

Hybride De-Novo-Genomassemblierung zur Erzeugung vollständiger Genome von Harnbakterien unter Verwendung von Kurz- und Langzeitsequenzierungstechnologien

Insertionsmutagenese ist ein wesentliches Werkzeug in der Vorwärtsgenetik zur Identifizierung funktioneller genomischer Elemente. Hier beschreiben wir den Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), eine Methode zum Nachweis von Lentivirus-Integrationsstellen innerhalb einer Lentivirus-basierten Insertionsmutagenese-Zellbibliothek.

Identifizierung funktionell relevanter Lentivirus-Integrationsstellen in einer Insertionsmutagenese-Zellbibliothek

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur systematischen globalen Optimierung von genetisch kodierten Biosensoren durch automatisierungsgestützte Generierung und Bewertung genetischer Bibliotheken zur Verfügung. Dies wird mit Design-of-Experiment-Methoden gekoppelt, um Experimente zu rationalisieren und die Auswahl genetischer Komponenten zu ermöglichen, um Biosensoren auf bestimmte Designergebnisse abzustimmen.

Effiziente Probenahme von genetisch kodierten Biosensoren Design Space mit einem Design of Experiment- und Automatisierungs-Workflow

Diese Studie präsentiert ein räumliches Trekker–CUT&amp;Tag-Multiom-Protokoll, das direkte räumliche Barcodierung eines Gewebeschnitts mit einer Einzelzell-Multiomanalyse kombiniert. Dieser Ansatz ermöglicht räumlich aufgelöste Einzelzellprofilierung der Genexpression und der Histon-H3K27ac-Modifikation gleichzeitig und bietet mechanistische Einblicke in die Genregulation im Kontext der Gewebemikroanatomie.

räumlich aufgelöste, integrierte einzelzellige multiomische Profilierung des Transkriptoms und epigenomischen Zielen in gefrorenen Gewebeschnitten

Erfahren Sie die Konstruktion einer großen Insert-Umweltgenombibliothek aus marinen Proben. Diese Methode nutzt Fosmid-Vektoren, Phagen-Verpackung und automatisierte Koloniepflückung für Sequenzierung und funktionelle Analysen.

Large Insert Environmental Genomic Bibliothek Produktion

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