Large Insert Environmental Genomic Bibliothek Produktion

Hallo, ich bin Marcus aus dem Labor von Steven Helm in der Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie an der University of British Columbia. Heute zeigen wir Ihnen eine Vorgehensweise für den Aufbau einer großen Einfüge-Umweltbibliothek. Bei der heutigen Prozedur wird mir San Lee zur Seite stehen, die die Phagenverpackung und die Infektion des Wirts der Bibliothek durchführen wird, sowie Elise Hawley und Chin Yang, die die Kolonie-Picking durchführen werden.

Wir haben dieses Verfahren in unserem Labor, um die Struktur und den Stoffwechsel der Mikrobiogemeinschaft in marinen und terrestrischen Umgebungen zu untersuchen. Also lasst uns loslegen. Dieses Protokoll zur Erstellung einer fo smid DNA-Bibliothek beginnt nach der Isolierung und dem Scheren von genomischer DNA aus Biomasseproben, Verfahren, die wir in den begleitenden Artikeln ausführlich beschrieben haben.

In den nächsten Schritten wird die SHE-DNA für die Ligation in den SMID-Vektor PCC vorbereitet. Der erste Schritt besteht darin, die Enden der SHE-DNA-Stücke zu reparieren und zu phosphorylieren. Die fünf Primzahlenenden, alle Reagenzien, die für diesen Schritt erforderlich sind, sind im PCC One SMID Library Production Kit von epicenter enthalten, um die Endreparaturreaktion einzurichten, alle Reagenzien auf Eis aufzutauen, dann den Endreparaturpuffer DNTP zu kombinieren, ein TP bis zu 20 Mikrogramm der sie einfügenden DNA bei 0,5 Mikrogramm pro Mikroliter Enzymmischung und Wasser zu mischen Um 80 Mikroliter zu erreichen, zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz, um die gesamte Flüssigkeit zum Enzym zu bringen Unteres.

Inkubieren Sie die Endreparaturreaktion bei Raumtemperatur für 45 Minuten bis eine Stunde. Dann erhitzen, er inaktiviert die Enzyme bei 70 Grad Celsius für 10 Minuten. Während der Inkubation der Endreparatur können Sie das Gel für den nächsten Schritt vorbereiten.

Bei der gepulsten Feld-Gelelektrophorese oder PFGE ist es Ihr Ziel, DNA-Moleküle im Bereich von 30 bis 60 zu isolieren. Kilobases PFGE ist ein elektrophoretisches Verfahren zur Auflösung dieser großen Fragmente, die bei der Standardelektrophorese zusammenlaufen. Bereiten Sie zunächst ein 1%-Gel mit niedrigschmelzenden Aromen in 150 Millilitern eines XTAE-Laufpuffers vor.

Wählen Sie Kämme, mit denen Sie die gesamte 80-Mikroliter-Probe der Endreparatur-DNA plus Ladepuffer in ein oder zwei Wells laden können. Seien Sie besonders vorsichtig beim Umgang mit dem Gel als niedrigschmelzende Agros-Gele. Bricht sehr leicht, während sich das Gel verfestigt.

Bereiten Sie die Elektrophoresekammer vor. Geben Sie 2,2 Liter eines XTAE in die Kammer und schalten Sie die Maschine ein, um den laufenden Puffer zu zirkulieren. Stellen Sie das Kühlgerät auf 14 Grad Celsius und die Pumpe auf 70 U/min ein.

Fügen Sie einen PFG-Marker für den mittleren Bereich, ebenfalls von NEB, hinzu. Um zu vermeiden, dass das Gel zu hoch geschnitten wird, extrudieren Sie Aros aus der Gelspritze und schneiden Sie mit dem Skalpell einen kleinen Stöpsel vom Ende ab. Platzieren Sie den Stopfen an der Vorderseite der Vertiefung und verschließen Sie ihn mit geschmolzenem Aros.

Stellen Sie sicher, dass der laufende Puffer auf 14 Grad Celsius abgekühlt ist, bevor Sie Ihr Gel laden. In der ersten Vertiefung laden Sie fünf Mikroliter New England Biolabs Lambda Hindi drei verdauen. In der zweiten Vertiefung wird ein Mikroliter des Smid-Kontrollgrößenmarkers in 10 Mikrolitern sterilem Wasser plus Ladepuffer befüllt

Laden Sie dann Ihre reparierte und wärmeinaktivierte Mischung plus Ladepuffer. Schließen Sie den Deckel und programmieren Sie die Maschine. Das Gel läuft über Nacht oder 12 Stunden.

Wenn das Gel fertig läuft, verwenden Sie einen Cyber-Gold-Fleck, um zu visualisieren, wie die DNA das Cyber-Gold verdünnt. In 250 Milliliter eines XTAE geben Sie Ihr Gel in die Lösung und färben Sie eine Stunde lang im Dunkeln cyberg gold ist lichtempfindlich, während das Gel färbt. Bereiten Sie ein Wasserbad bei 70 Grad Celsius und ein F 45 Grad Celsius für den folgenden Schritt der Gelextraktion vor.

Der nächste Schritt ist die Besteuerung und Gelierung. Reinigen Sie die DNA innerhalb des von Ihnen gewünschten Größenbereichs von 30 bis 60 Kilobasen. Bringen Sie Ihr gefärbtes Gel zusammen mit einem leeren, zerrissenen und beschrifteten Mikro-Täuschungsröhrchen und einem sterilen Skalpell zum Blaulicht-Transluminator.

Legen Sie den Transluminator mit Plastikfolie aus, um eine Kreuzkontamination Ihres Gels zu vermeiden. Setzen Sie die Brille auf und schalten Sie das blaue Licht ein. Jetzt können Sie Ihre endreparierte genomische DNA und den FO smid Kontrollgrößenmarker sehen. Mit dem Skalpell schneiden Sie eine fünf bis sieben Millimeter breite Gelscheibe heraus, die mit und leicht über dem Größenmarker der smid control migriert ist.

Verwenden Sie den PFG-Marker als obere Begrenzung für Ihren Slice. Übertragen Sie die Scheibe auf das zerrissene Rohr. Sie können die Scheiben bis zu einem Jahr bei minus 20 Grad Celsius lagern, bevor Sie fortfahren.

Jetzt ist es an der Zeit, sich zu gelieren. Reinige die DNA aus deinem Stück. Wiegen Sie die Tube mit Ihrer Gelscheibe und berechnen Sie das Gewicht der Scheibe, indem Sie das Tränengewicht abziehen.

Anschließend schmelzen Sie die Scheibe 10 bis 15 Minuten lang im 70 Grad warmen Wasserbad. Nachdem deine Gelscheibe vollständig geschmolzen ist, übergibst du die Tube schnell in das 45 Grad Celsius warme Wasserbad. Denken Sie daran, dass ein Milligramm festes Gel nach dem Schmelzen ein Volumen von einem Mikroliter hat.

Fügen Sie eine Einheit oder einen Mikroliter Jase-Enzympräparat pro 100 Mikroliter geschmolzenen Aros hinzu. Eine Stunde lang bei 45 Grad Celsius inkubieren. Dann zwei bis vier Mikroliter mehr hinzufügen und bei 45 Grad Celsius eine Stunde mehr Hitze inkubieren.

Inaktivieren Sie das Gel nach dem Erhitzen 10 Minuten lang bei 70 Grad Celsius. Inaktivierung des Enzyms, das Röhrchen 10 Minuten lang auf Eis legen und dann bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren. 13.000 U/min für 15 Minuten, um unlösliche Partikel zu pelletieren.

Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. Entfernen Sie den oberen Überstand, der Ihre gereinigte DNA enthält, und übertragen Sie ihn in ein 15-Milliliter-Falkenröhrchen. Dann tupfen Sie es mit drei Millilitern sterilem Wasser daneben, um die DNA zu waschen und zu konzentrieren.

Übertragen Sie die Lösung aus dem 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen auf eine Ancon Ultra Vier-Zentrifugalfilter-Einheit mit einer Ultra Cell 10-Membran. Stellen Sie die Filtereinheit mit einem 50-Milliliter-Falcon-Schlauch als Adapter in einen schwingenden Schaufelrotor und schleudern Sie sechs bis acht Minuten lang bei 4.000 GS. Zentrifugieren bis etwa 100 bis 500 Mikroliter Lösung.

Bleiben Sie auf dem Filter und entsorgen Sie den Durchfluss. Geben Sie dann weitere drei Milliliter steriles Wasser in das leere Falkenröhrchen. Übertragen Sie die Lösung in das Amon-Röhrchen und wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt.

Waschen Sie das Falkenrohr ein drittes Mal und reduzieren Sie das auf dem Filter gesammelte Endvolumen auf 50 bis 100 Mikroliter. Sie müssen sich keine Sorgen machen, dass die Probe verloren geht. Der Filter hält auch nach längerer Zentrifugation 50 Mikroliter Flüssigkeit zurück.

Übertragen Sie die restliche DNA-Lösung aus dem AmCon-Röhrchen in eine vorgewaschene MicroCon YM 50-Zentrifugalfiltereinheit und spülen Sie das Amon-Röhrchen mit weiteren 50 Mikrolitern sterilem Wasser, um die gesamte DNA-Zentrifuge zurückzugewinnen. Die MicroCon YM 50 Zentrifugalfiltereinheit in einer Mikrozentrifuge bei 10.000 GS, bis der Filter noch leicht mit Flüssigkeit bedeckt ist. Überprüfen Sie jede Minute.

Wenn nur noch eine geringe Menge Flüssigkeit auf dem Filter verbleibt. Drehen Sie den Filter auf den Kopf und gewinnen Sie Ihre DNA-Lösung in einem zweiten Zentrifugationsschritt bei 1000 GS für drei Minuten in einem frischen Mikrozentrifugenröhrchen zurück. Das resultierende Volumen sollte insgesamt 10 bis 15 Mikroliter nicht überschreiten.

Andernfalls könnte Ihre DNA für die Ligatur zu verdünnt sein. Überprüfen Sie die Konzentration der resultierenden DNA-Lösung mit NanoDrop oder Pico Green Assay. Wiederhergestellt und repariert.

Die DNA ist nun bereit, an den PCC one FO SMID-Klonierungsvektor für die Ligation ligiert zu werden, um alle Reagenzien auf Eis aufzutauen. Dann in der hier aufgeführten Reihenfolge mischen und nach jeder Zugabe mischen. Zuerst wird steriles Wasser hinzugefügt, um ein Reaktionsvolumen von 10 Mikrolitern zu erreichen.

Dann 10 x Fast-Link-Ligationspuffer, 10 millimolare A-T-P-P-C-C einen SMID-Vektor und Insert in einem molaren Verhältnis von 10 zu eins. Und schließlich Fast Link DNA Ligase. Zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz, um die gesamte Flüssigkeit auf den Boden zu bekommen.

Tippen Sie auf die Röhre und drehen Sie sie erneut. Inkubieren Sie die Ligationsreaktion zwei Stunden lang bei Raumtemperatur und inaktivieren Sie das Enzym 10 Minuten lang bei 70 Grad Celsius. Zu diesem Zeitpunkt können Sie die Ligationsreaktion entweder bei minus 20 Grad Celsius lagern oder mit dem Schritt der Phagenverpackung fortfahren.

Der nächste Schritt besteht darin, Bakterienphagen zu generieren, die dazu dienen, Ihre FO-SMID-Bibliothek zwei oder drei Tage vor dem geplanten Phagenverpackungsschritt in E. coli einzuführen: Streichen Sie den bereitgestellten EPI 300 T, einen resistenten Plattierungsstamm, auf einer einfachen LB-Platte aus und inkubieren Sie ihn über Nacht bei 37 bis Grad Celsius, um einzelne Kolonien zu erhalten. Sie können diese Platte versiegeln und für die zukünftige Verwendung bei vier Grad Celsius lagern. Am Tag vor den Verpackungsreaktionen impfen Sie 50 Milliliter Albee-Brühe plus 10 Millimolare Magnesiumsulfate mit einer einzigen Kolonie aus Ihrer Epi 300-Platte Schütteln Sie sie über Nacht bei 225 U/min und 37 Grad Celsius.

Am Tag der Verpackungsreaktionen wird frische 50 Milliliter LB-Bouillon plus 10 Millimolar Magnesiumsulfat mit fünf Millilitern der Nachtkultur beimpft. Kultivieren Sie die Bakterien bei 37 Grad Celsius auf einen OD 600 von 0,8 bis 1,0. Überschreiten Sie nicht OD 600 von 1,0.

Verdünnen Sie Ihre Probe vor der Messung mit dem Spektralphotometer, damit Sie ein genaues Ergebnis erhalten. Auf Eis oder bei vier Grad Celsius lagern, bis Sie bereit sind, fortzufahren, oder bis zu 72 Stunden. Jetzt, da die Bakterien bereit für die Infektion sind, ist es an der Zeit, das Auftauen der Phagen vorzubereiten.

Die maximale Anzahl von Plaques, die Lambda Packaging auf Eis extrahiert. Bei Verwendung eines Röhrchens pro Ligationsreaktion dauert das Auftauen etwa 10 bis 15 Minuten. In der Zwischenzeit ein leeres 1,5-Milliliter-Röhrchen erneut mit einem Röhrchen pro Reaktion auf Eis vorkühlen.

Sobald die Lambda-Verpackungsextrakte aufgetaut sind, sofort auf 25 Mikroliter jedes Verpackungsextrakts in das vorgekühlte 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen umfüllen und auf Eis legen. Restlichen Verpackungsextrakt wieder auf minus 80 Grad Celsius bringen. Wenn Sie die aufgetauten Verpackungsextrakte zu lange auf Eis liegen lassen, verringert sich die Infektionseffizienz.

Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter der Ligationsreaktion zu je 25 Mikrolitern der aufgetauten Extrakte auf Eis hinzu, die durch mehrmaliges Pipettieren der Lösung gemischt werden, ohne Luftblasen einzuführen. Zentrifugieren Sie kurz, um die gesamte Flüssigkeit am Boden der Röhrchen zu verfestigen, und inkubieren Sie die Verpackungsreaktionen 90 Minuten lang in einem 30 Grad Celsius warmen Wasserbad. Nach 80 Minuten Inkubation den restlichen Verpackungsextrakt auf Eis auftauen.

Nachdem die 90-minütige Verpackungsreaktion abgeschlossen ist, geben Sie die restlichen 25 Mikroliter Verpackungsextrakt in jedes Reaktionsröhrchen. Inkubieren Sie die Reaktionen für weitere 90 Minuten bei 30 Grad Celsius. Nach der zweiten Inkubation geben Sie 100 Mikroliter des vorbereiteten Phagenverdünnungspuffers in jedes Verpackungsröhrchen und mischen vorsichtig und geben Sie fünf Mikroliter Chloroform in jedes Röhrchen.

Nun solltest du ein Gesamtvolumen von 165 Mikrolitern in der Tube haben. Nach der Chloroform-Edition kann sich ein viskoser Niederschlag bilden. Vermeiden Sie diesen Niederschlag sowie die organische Chloroformphase beim Pipettieren der Phagenpartikel.

Zu diesem Zeitpunkt können Sie die verpackten Phagenpartikel bei Bedarf mehrere Tage bei vier Grad lagern, verwenden Sie jedoch frisch zubereitete Phagen, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Jetzt sind Sie bereit, die Wirtszellen, die Sie während der Phagenverpackungsschritte hochgezüchtet haben, mit dem verpackten Phagen zu infizieren. Geben Sie verpackte Phagen zu EPI 300 T one resistenten Wirtszellen OD 600,8 bis 1,0 im Verhältnis von 400 Mikrolitern epi 300 T one resistenten Zellen pro 10 Mikroliter Phagenpartikel

Um zu vermeiden, dass Chloroform vom Boden des Röhrchens verpackter Phagen pipettiert wird, verwenden wir 125 Mikroliter der verpackten Phagenpartikel und fünf Milliliter vorbereiteter epi 300 T one resistenter Wirtszellen, die schonend gemischt und dann 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert werden. Der nächste Schritt besteht darin, den Titer des verpackten Phagen zu bestimmen. Dazu plattieren Sie die infizierten Bakterien auf Medium, um infizierte Zellen auszuwählen.

Zählen Sie dann die resultierenden Kolonien und dividieren Sie sie durch das Volumen der Phagen, die den von Ihnen platierten Bakterien hinzugefügt wurden. Die C one SMID enthält ein Chloramphenicol-Resistenzgen. Um also nach infizierten Klonen zu selektieren, plattieren Sie die Bakterien auf Chloramphenicol-haltigen LB-Platten.

Verteilen Sie zwei mal 50 Mikroliter und zwei mal 10 Mikroliter der mit Phagen infizierten EPI 300 T one resistenten Zellen auf vier separate Platten und legen Sie die Platten kopfüber für 16 bis 24 Stunden, nicht länger als 48 Stunden, in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, bis sich Kolonien bilden. In der Zwischenzeit werden die verbleibenden EPI 300 T 1-resistenten Zellen aus der Fünf-Milliliter-Infektion durch Zentrifugation bei 3.500 GS für 10 Minuten bei vier Grad Celsius geerntet. Entsorgen Sie den Überstand.

Geben Sie einen Milliliter LB mit 20%igem Glycerin in die Röhrenresusus. Suspendieren Sie das Zellpellet und quat Sie auf je 100 Mikroliter in zwei Milliliter Kryo-Fläschchen, frieren Sie sofort ein und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius. Für die weitere Verwendung im Kolonie-Picking-Schritt am nächsten Tag zählen Sie die Anzahl der Klone auf den vier Platten im 37 Grad Celsius heißen Inkubator und bestimmen den Titer des verpackten Phagen, den Sie im nächsten Schritt verwenden.

Der gefrorene EPI 300 T one resistente Glycerinstamm enthält Zellen, die mit allen verschiedenen Plasmiden in Ihrer Bibliothek transduziert wurden. Verteilen Sie anschließend eine angemessene Menge basierend auf dem Virustiter und der Plattengröße jedes Smids. Klonen Sie auf 2 45 x 2 45 Millimeter im Quadrat.

Bioassay-Platten von LB mit Chloramphenicol unter Verwendung von Glasperlen. Geben Sie auch eine kleine Menge LB-Brühe auf den Teller, um Ihre Zellen gleichmäßig zu verteilen. Denke daran, dass die Aufbereitung der Glycerinbrühe deine Zellen zusätzlich etwa fünffach konzentriert.

An den Tagen der Kolonieernte 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, 96 oder 3 84-Well-Platten vorbereiten, die mit 200 Mikrolitern oder 70 Mikrolitern LB-Brühe pro Well gefüllt sind. Ergänzt mit 12,5 Mikrogramm Chloramphenicol pro Milliliter Brühe zur Auswahl von Antibiotika und 10 % Glycerin zum Einfrieren. Für diesen Schritt verwenden wir das automatisierte qfi Drei-Platten-Abfüllsystem.

Der nächste Schritt besteht darin, Kolonien aus Ihren vorbereiteten LB CHLORAMPHENICOL-Platten in Ihre vorbereiteten 96- oder 3-84-Well-Platten zum Einfrieren zu entnehmen. Für diesen Schritt verwenden wir den Klon-Picking-Roboter qix two, wie es in der Bedienungsanleitung heißt, um eine sterile Umgebung um den Klon-Picking-Bereich herum zu schaffen. Schalten Sie das UV-Licht 30 Minuten lang ein, während das UV-Licht eingeschaltet ist.

Bereiten Sie 500 Milliliter 1%iges Bleichmittel, 500 Milliliter steriles entionisiertes Wasser und 500 Milliliter 80%iges Ethanol vor. Wenn das UV-Licht ausgeschaltet wird, füllen Sie die Fächer wie von hinten nach vorne beschriftet. Füllen Sie 1 % Bleichmittel ein, autoklavieren Sie dann deionisiertes Wasser und 80 % Ethanol in die vordere Schale.

Vergewissern Sie sich, dass sie voll sind, da die Picknadeln ohne ausreichende Waschlösung nicht richtig gewaschen werden können. Nachdem Sie die Parameter für eine optimale Kommissionierung eingestellt haben, nehmen Sie die Deckel von Ihren Bakterienplatten und Ihren LB gefüllten 96- oder 3 84-Well-Platten ab und positionieren Sie sie zwischen den Pfosten in den Q-Picks. Die Platten des Arbeitsbereichs sollten fest an der vorderen rechten Ecke anliegen, damit sie sich während der Entnahme nicht bewegen können.

Schließen Sie dann die Frontblende. Sind alle Parameter eingestellt, kann der Kommissioniervorgang beginnen. Wenn die gesamte Kommissionierung abgeschlossen ist, spülen Sie die Bürsten und Tabletts mit entionisiertem Wasser ab und stellen Sie sie zum Trocknen auf die Bank.

Beseitigen Sie eventuell aufgetretene Verschüttungen und wischen Sie das Innere des CICS mit 80 % Ethanol ab. Stellen Sie sicher, dass alle Glycerin-Vorratsplatten beschriftet sind, und legen Sie sie für 24 Stunden in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator, um aus jedem gepflückten Volk eine Kultur zu züchten. Hinterlassen Sie eine Notiz auf dem Inkubator, die das Datum, die Anzahl der inkubierten Platten, die Zeit der Inkubation, die Zeit für die Entnahme und Ihre Initialen enthält.

Nach der Inkubation haben Sie Ihre Bibliothek. Jede Vertiefung enthält eine Kultur mit einem bakteriellen Klon, der das PCC enthält, das mit einem Stück reiner DNA aus Ihrer Ausgangsprobe ligiert ist. Frieren Sie die Platten für die Langzeitlagerung bei minus 80 Grad Celsius ein und gratulieren Sie sich zu einer guten Arbeit.

Das vorgestellte Protokoll beschreibt das Verfahren, wie eine Umwelt-SMID-Bibliothek erstellt werden kann, um den genetischen Gehalt einer mikrobiellen Gemeinschaft in einem gegebenen Lebensraum zu erfassen. Dieses Protokoll sollte eine SMID-Bibliothek erstellen, die repräsentativ für den genetischen Inhalt der untersuchten Umgebung ist, und es dem Lesegerät ermöglichen, kritische Schritte zu optimieren. Wenn die Anzahl der FO-Smid-Klone, die am Ende des gesamten Verfahrens erhalten werden, zu gering ist.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die FO-SMID-Bibliothek aus genomischer DNA aus einer Meerwasserprobe erstellen können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, mit genomischer DNA von hoher Qualität zu beginnen. Halten Sie alle Ihre Platten und Reagenzien bereit, bevor Sie beginnen, und planen Sie genügend Zeit für diesen mehrstufigen Prozess ein.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.