Name: Tracking-Dynamics of Muscle Engraftment bei Kleintieren durch In Vivo Fluorescent Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Erfahren Sie die In-vivo-Fluoreszenzbildgebung zur Überwachung der Muskelregeneration mit GFP-markierten Myoblasten bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht präzise Langzeitstudien zur Dynamik transplanterter Zellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Arbeit der Z-und Y-Yang Wang wurde möglich durch Gewährung K02 AR051181 aus NIAMS / NIH, Zuschüsse aus Muscular Dystrophy Association und Harvard Stem Cell Institute for Y Wang. Die Arbeit von Q Zeng und X Xu sind durch ein Programm Zuschuss für das Optical Imaging Lab aus dem Brigham and Women Hospital unterstützt. Die Autoren bedanken sich bei Wen Liu aus der Abteilung für Anästhesie, BWH, danke für die technische Hilfe in der Zelle arbeiten.

Zellpräparation <ol><li> Satellite Zellisolation <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Unter Narkose werden die Beinmuskeln der GFP transgenen Mäusen (C57BL / Ka-βactin-EGFP) entfernt. Nach dem Schneiden in kleine Stücke, sind Satelliten-Zellen enzymatisch gespalten durch Inkubation des zerkleinerten Gewebes mit 2% Dispase Kollagenase-Lösung für 1 Stunde bei 37 ° C. </li><li> Neutralisieren das Enzym die Verdauung mit einem Wachstum Medien mit Ham F-10 und 20% FBS, distanzieren den Muskel durch wiederholtes Verreiben mit einer Pasteurpipette. Die Zellen werden durch eine Zelle Sieb (ø70-100 um) filtriert und dann auf einem nicht-beschichteten Teller für 1 Stunde bei 37 ° C beschichtet </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und die Platte sie auf einer Kollagen-beschichtete Schale. Wiederholen Sie diesen Schritt 1 Stunde später an die Myoblasten zu reinigen. (Pre-Platte) </li><li> Ändern Sie den Medien-und Platte die Zellen in der Zeit. Die endgültige Reinigung Myoblasten werden in Medium mit Ham F-10, 20% FBS, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin (Wachstumsmedium) bei 37 ° C mit 5% CO2, 95% Luft kultiviert. </li></ol> </li><li> Kultur und erweitern Sie den primären Myoblasten in Wachstumsmedium mit Zugabe basischer FGF von 10 ng / ml. </li><li> Für alle die in-vivo-Experimente, spritzen wir 5x10 5 Zellen pro TA Muskel. </li><li> Bei der Ernte die Myoblasten, lösen wir die Zellen mit 0,25% Trypsin / EDTA und waschen Sie sie mit PBS zweimal. Die Zellzahlen sind mit einer Zählkammer gezählt und die Zellen in HBSS bei einer Konzentration von 5x10 4 Zellen / ul resuspendiert. Die konzentrierte Zellen in HBSS auf Eis gestellt und injiziert innerhalb von 1 Stunde nach der Entnahme. </li></ol> In Vivo Imaging <ol><li> Männlich mdx-Mäusen im Alter von 4-6 Wochen aus Jackson Labor gekauft und bei einem Tier Wohnanlage. </li><li> Nach ca. 1 Woche Unterkunft für die Umwelt, werden die Mäuse bereit, mit den kultivierten Zellen implantiert werden. </li><li> Vor-Transplantation ist die Maus durch eine intraperitoneale (ip) Injektion der Mischung von Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) narkotisiert. Dann werden die Haare um den TA Muskel-Bereich wird durch die Anwendung Nair, um das Bein und wartet 30 Sekunden, um wischen Sie sie mit destilliertem Wasser reinigen entfernt. </li><li> Während sich die Maus noch in Narkose, sind 5x10 5 Zellen in 10 &amp;mgr; l HBSS langsam in jeder TA Muskel an 3 Punkten mit einem 30-Gauge-Nadel injiziert. </li><li> Nach Schritt 4, kann die Maus regelmäßig durch in vivo Fluoreszenz-Imaging abgebildet werden. Die Fluoreszenz-Imaging-Station Nightowl LB981 (Berthold Technologies, Inc.) mit einer hochempfindlichen CCD-Kamera ausgestattet, wird verwendet, um Bilder aus dem behindern Beine der Mäuse zu erhalten. </li><li> Am Tag des In-vivo-Bildgebung, überprüfen wir zunächst die das Nachwachsen der Haare auf dem TA Muskel. Wenn nötig, werden wir erneut bewerben Nair, um das Haar, wie oben beschrieben zu entfernen, nachdem Anästhesie der Maus mit der Mischung aus Ketamin und Xylazin. </li><li> Während sich die Maus in Narkose legen wir die Maus in Bauchlage auf einem Stück schwarzen, nicht fluoreszierendem Papier (schwarz Artagain Papier aus Strathmore). Um vollständig aussetzen TA Muskel für eine bessere Bildgebung, tape wir die Hinterpfoten, um das Papier. </li><li> Wir platzieren Sie den Mauszeiger in der Imaging-Kammer und die Position der Hinterbeine, um in der Mitte des Sichtfeldes der Kamera abgebildet werden. Wir ersten Schalter aus dem Emissions-Filter zu einem traditionellen Graustufen-Foto-Bild des Beines mit einer Belichtungszeit von 5 Sekunden dauern. Danach ist die Position der Maus und Fokus der Kamera, wenn nötig. Die Imaging-Parameter einschließlich Belichtungszeit (1.250 ms), Probenhöhe (0,9 cm) etc. konstant gehalten werden in der experimentellen Verfahren. </li><li> Wir haben dann in die entsprechende Emission Filter-Schalter für das grün fluoreszierende Protein Wellenlänge. Wir nehmen Fluoreszenzbild mit einer Belichtungszeit von 1.250 ms und einem Binning-Zahl von 1. Nach der Belichtung wird die Maus aus dem Imaging-Kammer auf einen Käfig, um Erholung zu warten entfernt. </li><li> Für die Analyse erstellen wir eine Region of Interest (ROI) über die Fluoreszenz-Signale ihrer Intensität in Bezug auf die Photonen pro Sekunde zu messen. Wir messen auch die Größe der ROI in Bezug auf die Anzahl der Pixel als eine weitere Quantifizierung Wert. Die Imaging-Experimente können jede Woche wiederholt werden oder häufiger über ein paar Monate, falls erforderlich, Längsschnittdaten zu erwerben. </li></ol> Am Ende der Experimente wird die Maus getötet und das TA Muskel ist für die Histologie Analyse geerntet.

<ol><li>Ballou, B., Ernst, L. A., Waggoner, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+tumors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of tumors in vivo.</a> Curr Med Chem. 12, 795-805 (2005).</li>
<li>Green, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Godavarty, A., Sevick-Muraca, E. M., Eppstein, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fluorescence+lifetime+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Phys%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fluorescence lifetime tomography.</a> Med Phys. 32, 992-1000 (2005).</li>
<li>Graves, E. E., Weissleder, R., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+molecular+imaging+of+small+animal+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models.</a> Curr Mol Med. 4, 419-430 (2004).</li>
<li>Graves, E. E., Yessayan, D., Turner, G., Weissleder, R., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+in+vivo+fluorochrome+concentrations+measured+using+fluorescence+molecular+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography.</a> J Biomed Opt. 10, 44019-44 (2005).</li>
<li>Gurfinkel, M., Ke, S., Wen, X., Li, C., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+fluorescence+optical+imaging+and+tomography.+Dis+Markers%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Near-infrared fluorescence optical imaging and tomography. Dis Markers.</a> , 107-121 Forthcoming.</li>
<li>Lee, J., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fluorescence+enhanced+optical+tomography+using+referenced+frequency-domain+photon+migration+measurements+at+emission+and+excitation+wavelengths%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+Soc+Am+A+Opt+Image+Sci+Vis%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fluorescence enhanced optical tomography using referenced frequency-domain photon migration measurements at emission and excitation wavelengths.</a> J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 19, 759-771 (2002).</li>
<li>In vivo fluorescence imaging of muscle regeneration by transplanted eGFP-labeled myoblasts. Xu, X., Yang, Z., Liu, Q., Wang, Y. Annual Meeting of American Society of Gene Therapy, 2008 May 28-June 1, Boston, Ma, , American Society of Gene & Cell Therapy. Milwaukee, WI. (1985).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+biology+of+cancer+cells+visualized+with+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins.</a> Curr Top Dev Biol. 70, 121-144 (2005).</li>
<li>Coulton, G. R., Morgan, J. E., Partridge, T. A., Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mdx+mouse+skeletal+muscle+myopathy%3A+I.+A+histological%2C+morphometric+and+biochemical+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol+Appl+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 53-70 (1988).</li>
<li>Morgan, J. E., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle satellite cells.</a> Int J Biochem Cell Biol. 35, 1151-116 (2003).</li>
<li>Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A., King, W., Signore, L., Prior, T. W., Sahenk, Z., Benson, S., McAndrew, P. E., Rice, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblast+transfer+in+the+treatment+of+Duchenne%27s+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy.</a> N Engl J Med. 333, 832-838 (1995).</li>
<li>Bogdanovich, S., Perkins, K. J., Krag, T. O., Khurana, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutics+for+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+current+approaches+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutics for Duchenne muscular dystrophy: current approaches and future directions.</a> J Mol Med. 82, 102-115 (2004).</li>
<li>Morgan, J. E., Coulton, G. R., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdx+muscle+grafts+retain+the+mdx+phenotype+in+normal+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts.</a> Muscle Nerve. 12, 401-409 (1989).</li>
<li>Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+skeletal+muscle+contributions+from+circulating+cells%2C+bone+marrow+cells%2C+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells. 22, 1292-1304 (2004).</li>
<li>Cerletti, M., Jurga, S., Witczak, C. A., Hirshman, M. F., Shadrach, J. L., Goodyear, L. J., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient%2C+functional+engraftment+of+skeletal+muscle+stem+cells+in+dystrophic+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles.</a> Cell. 134, 37-47 (2008).</li>
</ol>

Wir haben eine zuverlässige und stabile Imaging-Plattform für die Verfolgung der fluoreszenzmarkierten transplantierten Zellen in Host Skelettmuskulatur in dieser Studie. GFP-markierten Myoblasten aus GFP transgenen Maus steht für einen Typ von adulten Stammzellen, die Kandidaten für die Zelltherapie in der Zukunft sein wird. Eine ständige Manipulation einschließlich Zellzahl, Zell-Injektion, klaren Hintergrund, Bildposition und Maschinen-Parameter ist für die Gewinnung hochwertiger Bild-und vor allem für die quantitative Analyse wichtig. Fluoreszenz-Bildgebung hat viele Anwendungen in der biomedizinischen Forschung, wie sie nicht-invasiv, einfach zu bedienen ist, und hat einen hohen Durchsatz. Neben Fluoreszenz-Bildgebung kann eine quantitative Messung der Photonen, obwohl aufgrund der Streuung, Dämpfung und Absorption basiert bereitzustellen, kann Licht nicht durchdringen einen großen Abstand im Gewebe, die einen Mangel der Technik ist. Es wurden Anstrengungen im Gange, um Rot-oder Nah-Infrarot-Reporter nutzen, um die Eindringtiefe des Lichts zu erhöhen. Ein weiterer Vorteil der Fluoreszenz-Bildgebung ist, dass es übersetzbar Kliniken ist, wenn die spezifischen fluoreszierenden Reporter für den menschlichen Gebrauch zugelassen ist. Im Vergleich mit MRT, CT und PET, hat Fluoreszenz-Bildgebung eine hohe Flexibilität, da sie nicht teure Hardware-und Imaging-Agenten. Ein Beispiel hierfür ist Fluoreszenz-basierten Endoskop und Mikro-Endoskop, das in Kliniken verwendet wurden. Durch die Kombination von Fluoreszenz-Imaging mit anderen Modalitäten, erwarten wir die Fähigkeit, sowohl anatomische und funktionelle Informationen über die zugrunde liegenden biologischen Prozesse erwerben zu erreichen.

<table><tbody><tr><td>NightOwl LB981</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tracking-dynamics of muscle engraftment bei kleintieren durch in vivo fluorescent imaging

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muskeldystrophien sind eine Gruppe von degenerativen Muskel-Erkrankungen, die durch fortschreitenden Verlust der kontraktilen Zellen gekennzeichnet. Derzeit gibt es keine kurative Behandlung nicht möglich. Jüngste Fortschritte in der Stammzellbiologie haben neue Hoffnungen für die Entwicklung wirksamer Therapien Zelle erzeugt werden, um diese Krankheiten zu behandeln. Transplantation von verschiedenen Arten von Stammzellen mit fluoreszierenden Proteine ​​in Muskeln der dystrophischen Tiermodellen beschriftet wurde weitgehend in das Feld verwendet. Eine nicht-invasive Technik mit der Möglichkeit, die transplantierten Zellen Schicksal track längs können weiter unsere Fähigkeit, Muskel-Transplantation von transplantierten Zellen genauer und effizienter zu bewerten. In der vorliegenden Studie zeigen wir, dass in vivo Fluoreszenz-Imaging ist eine sensible und zuverlässige Methode für die Verfolgung von transplantierten GFP (Green Fluorescent Protein)-markierten Zellen in Maus Skelettmuskeln. Trotz der Besorgnis über die Hintergründe durch die Verwendung eines externen Licht notwendig für die Anregung des fluoreszierenden Proteins, fanden wir, dass, indem Sie entweder Nacktmaus oder Beseitigung Haar mit Haarentfernung Reagenzien viel von diesem Problem beseitigt ist. Mit einer CCD-Kamera, kann das Fluoreszenzsignal in den Tibialis anterior (TA) Muskel nach der Injektion von 5 x 10 5 Zellen entweder von GFP transgenen Mäusen oder eGFP transduziert Myoblasten Kultur erkannt werden. Für weitere oberflächliche Muskeln wie dem M. extensor digitorum longus (EDL), Injektion von weniger Zellen produziert ein nachweisbares Signal. Signalintensität gemessen und quantifiziert werden, da die Anzahl der emittierten Photonen pro Sekunde in einer region of interest (ROI). Da die aufgenommenen Bilder klare Grenzen zur Abgrenzung der transplantierten Bereich zeigen, kann die Größe der ROI sowie gemessen werden. Wenn die Beine konsequent jedes Mal positioniert sind, spiegeln die Veränderungen in der Gesamtzahl der Photonen pro Sekunde pro Muskelgruppe und die Größe der ROI die Änderungen in der Zahl der transplantierten Zellen und die Größe des eingepflanzten Bereich. Die Veränderungen in den gleichen Muskel im Laufe der Zeit sind quantifizierbar. In vivo Fluoreszenz-Imaging-Technik wurde in erster Linie auf das Wachstum von Zellen tumorogene Spur verwendet, unsere Studie zeigt, dass es ein mächtiges Werkzeug, das uns ermöglicht, das Schicksal der transplantierten Stammzellen Weg ist.

Wir beschreiben einen<em&gt; In vivo</em&gt; Fluoreszenz-Imaging-Protokoll, um die Regeneration der Muskulatur von GFP-markierten Myoblasten Monitor nach der Transplantation in der Skelettmuskulatur von gesunden und dystrophischen Mäusen. Dieses Protokoll kann angepasst an die Regeneration der Muskulatur durch die Transplantation von anderen Arten von Zellen und in anderen Muskelerkrankungen sowie zu studieren.

Tracking-Dynamics of Muscle Engraftment bei Kleintieren durch In Vivo Fluorescent Imaging

Muskeldystrophien sind eine Gruppe degenerativer Muskelerkrankungen, die durch einen fortschreitenden Verlust kontraktiler Muskelzellen gekennzeichnet sind. Derzeit gibt es keine ...

Hallo, ich bin Juwan Ma aus der Abteilung für Anästhesiologie am Bergham Women's Hospital in Boston. Heute zeigen wir Ihnen eine Technik zur Gewinnung von In-vivo-Fluoreszenzbildern, um den Fortschritt der Muskelregeneration bei Mäusen zu überwachen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Einheilung transplantierten muskulären Stammzellen zu untersuchen.Beginnen wir also. Für die Transplantation markierte GFP-Zellen werden aus GFP-transgenen Mäusen isoliert und kultiviert. Bevor fortgefahren wird, wird mittels einer Zehenzangengefühlprüfung bestätigt, dass die Maus vollständig anästhesiert ist. Anschließend werden die Hinterbeinmuskeln entfernt. Unter aseptischen Bedingungen wird der Muskel dann mazeriert.Satellitenzellen werden durch Inkubation des Muskelminzes mit einer 2 %igen Kollagenase-Lösung bei 37 Grad Celsius für eine Stunde dissoziiert. Nach der Inkubation wird Wachstumsmedium, das Ham F10 und 20 % FBS enthält, hinzugefügt, um die enzymatische Verdauung zu stoppen. Anschließend werden die Muskeln durch wiederholtes Pipettieren mit einer Pasteurpipette dissoziiert.Anschließend werden die Zellen durch einen Zellfilter gefiltert und auf eine unbehandelte Kulturschale ausgesät. Die Schale wird für eine Stunde in einen standardmäßigen Zellkulturschrank gestellt. Um Satellitenzellen von anderen Zellpopulationen mit stärkeren Adhärenseigenschaften zu trennen, wird das Überstandmedium auf eine kollagenbeschichtete Schale abdekantiert und weitere eine Stunde inkubiert.Nach dieser Inkubation wird der resultierende, angereicherte Satellitenzell-Supernatant erneut entfernt und auf eine neue, mit Kollagen beschichtete Platte übertragen, wo er kultiviert wird, bis Myoblastenkolonien sichtbar sind. Dieser Vorgang wird als Präpl bezeichnet; die Zellen werden bei Erreichen einer Zellkonfluenz von 60 bis 70 % weitergegeben. Ein kleiner Teil der Zellen wird für die immunzytochemische Färbung mit myogenen Zellmarkern verwendet, um die Reinheit der Muskelzellen in der Kultur zu überprüfen.Nach Bestätigung der Reinheit myogener Zellen werden die Zellen in derselben Kultur erweitert. Unter den Bedingungen der Transplantation vor der Zelltransplantation werden die Zellen mit 0,25 %igem Trypsin-EDTA abgelöst, zweimal gewaschen und in HBSS in einer Konzentration von fünf mal 10 hoch sieben Zellen pro Milliliter resuspendiert. Pro Musculus tibialis anterior (TA) werden 10 Mikroliter der Zellsuspension injiziert.Für die In-vivo-Bildgebung werden GFP-markierte Myoblasten zunächst in vier bis sechs Wochen alte männliche Mäuse transplantiert. Die Maus wird mit Ketamin-Xylazin anästhesiert, und der Eingriff wird nach Bestätigung des Anästhesiezustands begonnen. Um Hintergrundrauschen zu reduzieren, wird das Haar an beiden Hinterbeinen entfernt, indem Nare auf die Beine aufgetragen wird und 30 Sekunden gewartet wird, bevor es abgewischt wird.Für den Wattestäbchenapplikator werden die Beine anschließend erneut mit einem neuen, in destilliertem Wasser getränkten Wattestäbchen abgewischt, um verbleibende Nasenschleimhaut und Haare zu entfernen, um Zellen in die Maus zu transplantieren. Ziehen Sie zunächst fünfmal 10 hoch 5 Zellen in 10 Mikrolitern HBSS in eine Hamilton-Spritze ein. Injizieren Sie mit einer 30-Gauge-Nadel eine gleiche Anzahl von Zellen an drei Positionen entlang der Längsachse des TA-Muskels, im oberen medialen und unteren Bereich.Nach jeder Injektion die Nadel zwei Minuten lang halten, bevor sie aus dem Muskel gezogen wird, um ein Austreten entlang der Nadel zu verhindern. Während der Wartezeit dieselbe Zellmenge in eine andere Spritze aufziehen und den kontralateralen TA-Muskel auf dieselbe Weise injizieren. Unmittelbar nach den Zellinjektionen wird die Maus in Bauchlage auf ein Stück schwarzes, nicht fluoreszierendes Papier gelegt, beide Füße mit der Sohle nach unten am Papier befestigt und die Beine im 90-Grad-Winkel auseinander gespreizt. Anschließend wird die Maus in die Messkammer eines Night Owl LB 981 Fluoreszenz-Imaging-Systems platziert.Mit einer hochsensitiven CCD-Kamera ausgestattet, wird ein Hinterbein in der Mitte des Sichtfeldes der Kamera positioniert. Zunächst wird ein herkömmliches Graustufen-Foto des Beins aufgenommen. Um mit der Bildaufnahme zu beginnen, wählt man den geeigneten Emissionsfilter mit einer spezifischen Wellenlänge für das grün fluoreszierende Protein.Nehmen Sie ein Bild mit einer Belichtungszeit von 1.250 Millisekunden auf, gefolgt von einem weiteren Bild mit einer Belichtungszeit von 500 Millisekunden. Wir stellen fest, dass eine längere Belichtungszeit die Detektion eines schwachen Signals ermöglicht, während eine kürzere Belichtung mehr Details offenbart. Nachdem ein Hinterbein abgebildet wurde, positionieren Sie das andere Hinterbein in der Bildmitte und nehmen Sie dieses Bein auf dieselbe Weise wie zuvor gezeigt auf.Um vergleichbare Ergebnisse zu gewährleisten, sollte die Probenhöhe unverändert bleiben. Nach der Bildgebung wird die Maus in einen Käfig zurückgebracht und ihre Erholung von der Anästhesie überwacht. Zur Analyse wird ein interessierender Bereich über die fluoreszierenden Signale gezeichnet, um Photonen pro Sekunde zu messen.Wir messen außerdem die Größe des interessierenden Bereichs in Anzahl der Pixel, um einen zusätzlichen quantitativen Wert zu erhalten. Um Längsschnittdaten zu gewinnen, können die Bildgebungsexperimente bei Bedarf an verschiedenen Tagen oder Wochen wiederholt werden. Bei den Experimenten zeigte ein fluoreszierendes Bild eines Hinterbeins der Maus, das am Tag aufgenommen wurde, an dem die mit GFP markierten Zellen injiziert wurden, eine hohe Signalintensität. Die Signalintensität sank anschließend am zweiten Tag und stieg dann bis zum siebten, 14. und 21. Tag auf ein stabiles Niveau an. Als diese Änderungen der Fluoreszenz quantifiziert wurden, indem die Signalintensität in Photonen pro Sekunde gemessen wurde, beobachteten wir einen deutlichen Rückgang der Signalintensität einen Tag nach der Injektion, was auf eine Abnahme der Anzahl der GFP-positiven Zellen hinweist.Jedoch hatte die Signalintensität am siebten, 14. und 21. Tag ein stabiles Niveau erreicht, was darauf hinweist, dass eine Muskelregeneration stattgefunden hatte. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man die In-vivo-Fluoreszenzbildgebung verwendet, um den Fortschritt der regenerierenden Muskulatur nach der Injektion von GFP-markierten Zellen zu überwachen. Mit dieser Methode können wir die Dynamik der Muskelregeneration nach der Injektion aller Arten von fluoreszenzmarkierten Zellen untersuchen.Da Bilder in festgelegten Zeitabständen nichtinvasiv erfasst werden können, lassen sich genauere longitudinale Daten mit weniger Tieren und geringerem Arbeitsaufwand gewinnen. Bei Verwendung fester Messparameter sollten Bilder desselben Tieres über die Zeit quantitativ vergleichbar sein. Es ist äußerst wichtig, die Hautoberfläche über dem Muskel sauber zu halten, um Hintergrundsignale zu reduzieren, und es ist unbedingt erforderlich, alle Haare von den Beinen zu entfernen und die Region gründlich mit Wattestäbchen oder -auflagen abzuwischen.Und denken Sie daran, verwenden Sie jedes Mal denselben Parametersatz, um die Konsistenz aller Ihrer Messungen sicherzustellen. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

tracking-dynamics-muscle-engraftment-small-animals-vivo-fluorescent

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieser Artikel beschreibt eine optimierte Abfolge der Ereignisse für multimodale Bildgebung von zellulären Transplantaten im Gehirn von Nagetieren mit: (i) In-vivo-Biolumineszenz-und Kernspintomographie, und (ii) post mortem histologische Analyse. Die Kombination dieser bildgebenden Verfahren auf einem einzigen Tier erlaubt zelluläre Transplantat Auswertung mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Spezifität.

Multimodale Bildgebung von Stem Cell Implantation in das zentrale Nervensystem der Mäuse

Dieses Video demonstriert das Protokoll für die orthotopische Implantation von grün fluoreszierenden Protein-exprimierenden Bauchspeicheldrüsenkrebszellen in die Bauchspeicheldrüse der Maus. Das orthotope Mausmodell hilft bei der Untersuchung der Wirksamkeit neuartiger Therapeutika bei primären und metastasierten Tumoren.

Fluoreszierendes orthotopes Mausmodell: Implantation von GFP-exprimierenden Krebszellen in eine Maus zur Beurteilung der Tumorprogression in vivo

Ein nicht-invasiver Mittel, um den Erfolg der Transplantation Myoblasten auszuwerten beschrieben. Das Verfahren nutzt ein einheitliches Fusionsprotein Reportergen, dessen Expression von Genen kann mit unterschiedlichen Bildgebungsverfahren abgebildet werden zusammengesetzt. Hier nutzen wir...

Molecular Imaging Transplantierte Muscle Progenitor Zielzellen

Induzierte pluripotente Stammzell (iPSC)-abgeleitete myogene Vorläufer sind vielversprechende Kandidaten für Zelltherapiestrategien zur Behandlung von Muskeldystrophien. Dieses Protokoll beschreibt Transplantations- und Funktionsmessungen, die erforderlich sind, um die Engraftmentierung und Differenzierung von iPSC-abgeleiteten Mesoangioblasten (eine Art von Muskelvorläufern) in Mausmodellen der akuten und chronischen Muskelregeneration zu bewerten.

Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Kombinatorische 5 fluoreszierenden Proteinen markiert von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen in vivo ermöglicht klonalen Tracking über die konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie, die einen Einblick in die Knochenmark blutbild Architektur während der Regeneration. Dieses Verfahren ermöglicht nicht-invasive Abbildung von Schicksal spektral kodierten HSPCs abgeleiteten Zellen in intaktem Gewebe für ausgedehnte Zeiträume nach der Transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

Wir beschreiben ein relativ einfaches Verfahren zur ex vivo Echtzeit-Bildgebung der Tumorzell Stroma Wechselwirkungen innerhalb Lungenmetastasen unter Verwendung fluoreszierenden Reportern in Mäusen. Verwendung von Spinnplatten konfokale Mikroskopie, ermöglicht diese Technik Visualisierung von lebenden Zellen für mindestens 4 h und angepasst werden könnten andere entzündliche Lungenerkrankungen zu untersuchen.

Ex-vivo-Live-Imaging von Lungenmetastasen und deren Mikromilieu

Intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) von der Calvarium wird in Kombination mit genetischen Tiermodelle zur Untersuchung der Referenzfahrt und Engraftment des blutbildenden Zellen des Knochenmarks (BM) Nischen angewendet.

Kombination von intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) mit genetischen Modellen Engraftment Dynamik der blutbildenden Zellen des Knochenmarks Nischen zu studieren

Wir beschreiben ein Protokoll für die präklinische in Vivo Verfolgung von Krebsmetastasen. Es basiert auf einem Radionuklid-Fluoreszenz-Reporter Kombination von Natrium Iodid Symporter, entdeckt nichtinvasive [18F] Tetrafluoroborate-PET, und ein fluoreszierendes Protein für optimierte ex Vivo Bestätigung. Die Methode ist anwendbar für präklinische in Vivo Zelle tracking über Tumorbiologie.

Radionuklid-Fluoreszenz-Reporter-Gen Imaging zu Tumorprogression in Nagetier Tumormodellen verfolgen

Hier verwenden wir Biolumineszenz, Röntgen und Positronen-Emissions-Tomographie/berechnet Tomographie Bildgebung wie hemmende mTOR-Aktivität zu studieren Auswirkungen des Knochenmarks pfropfte Myelom Tumoren in einem Xenograft-Modell. Dies ermöglicht eine physiologisch relevante, nicht-invasive und multimodalen Analysen der Anti-Myelom-Wirkung von Therapien gezielt Knochenmark pfropfte Myelom Tumoren in Vivo.

Multimodale Biolumineszenz und Positronic-Emissions-Tomographie/Computational Tomographie Bildgebung des multiplen Myeloms Knochenmark Xenotransplantate NOG Mäuse

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für live-Aufnahmen von Eindringmittel beschriftete menschliche endometrialen Fragmente bei Mäusen verpflanzt. Die Methode ermöglicht das untersuchen die Auswirkungen der Medikamente der Wahl auf die Größe der nichtmalignem Läsion durch Überwachung und Quantifizierung der Fluoreszenz emittiert von fluoreszierenden Reporter in...

Nicht-invasive Überwachung der Größe der Läsion in einer heterologen Mausmodell der Endometriose

Dieser Artikel beschreibt, wie die elektrische Impedanzmyographie in vivo (unter Verwendung von Oberflächen- und Nadelelektrodenarrays) und ex vivo (unter Verwendung einer dielektrischen Zelle) am Musculus gastrocnemius von Nagetieren durchgeführt wird. Es wird die Technik sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten demonstrieren und die verfügbaren Modifikationen (z. B. fettleibige Tiere, Welpen) detailliert beschreiben.

Durchführung der In-vivo- und Ex-vivo-Impedanz-Myographie bei Nagetieren

Erfahren Sie die In-vivo-Fluoreszenzbildgebung zur Überwachung der Muskelregeneration mit GFP-markierten Myoblasten bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht präzise Langzeitstudien zur Dynamik transplanterter Zellen.

Tracking-Dynamics of Muscle Engraftment bei Kleintieren durch In Vivo Fluorescent Imaging

Weitere Videos entdecken