Antifouling Selbstorganisierte Monoschichten auf Mikroelektroden für die Strukturierung von Biomolekülen

Dieses Verfahren beginnt mit der Herstellung einer Mikroelektrode auf einem Silikonsubstrat. Über der Mikroelektrode und dem Substrat wird eine selbstorganisierende Monoschicht aus Polyethylenglykol gebildet, um eine Verschmutzung der Mikrotubuli zu verhindern. Dann werden mit Pansen markierte Mikrotubuli hergestellt.

Schließlich werden Mikrotubuli mittels Elektrophorese auf die atifizierten Elektroden aufgebracht. Hallo, ich bin John Noel vom Nana Lab im Department of Physics und vom Molecular Biomechanics Laboratory im Department of Biomedical Engineering an der Texas a and m University. Ich bin Wil Free Teza von der Physikabteilung und Direktor des Center Skill Science and Technology an der Texas a m University.

Und ich bin Juan Quang, der Direktor des Molecular Biomechanics Laboratory am Texas a and m University Department of Biomedical Engineering. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung von Mikroelektroden, die mit einer selbstorganisierten Monoschicht beschichtet sind. Dieses Verfahren verwenden wir in unserem Labor, um das Paling von Mikroröhrchen mittels Elektrophorese zu untersuchen.

Also lasst uns loslegen. Verwenden Sie zunächst einen Ritzer oder Waferschneider, um Siliziumwafer in ein Zentimeter mal 1,5 Zentimeter große Stücke zu schneiden, die als Substrate verwendet werden. Reinigen Sie nun die Substrate, indem Sie sie in ein Becherglas legen, das mit genügend Aceton bedeckt ist, und beschallen Sie sie fünf Minuten lang, ohne die Substrate trocknen zu lassen.

Spülen Sie sie in frischem Aceton und spülen Sie sie dann sofort wieder in Isopropanol ab und trocknen Sie sie mit Stickstoff. Stellen Sie die Gold-Mikroelektroden mit der Standard-Positivton-Photolithographie oder der Elektronenstrahllithographie auf den sauberen Substraten her. Halten Sie bei der Gestaltung der Mustergeometrie den Durchmesser jedes Elektrodenmusters unter 100 Mikrometern. Um eine Abdeckung durch die selbstorganisierte Monoschicht oder Peg Sam aus Polyethylenglykoltrimeth Oxy Seline zu gewährleisten, fügen Sie Kontaktpads hinzu, die 300 bis 500 Mikrometer vom Muster entfernt positioniert sind, mit einer 1-Millimeter-Linie, die das Pad mit der Elektrode verbindet.

Nachdem Sie das Muster in der Lackschicht entwickelt haben, kratzen Sie mit einer Pinzette eine Linie vom Kontaktpad bis zum Rand des Substrats in den Lack. Bei der Metallabscheidung ermöglicht der Kratzer den elektrischen Kontakt zwischen der Elektrode und dem Rand des Substrats. Zur Abscheidung der Metallschicht wird eine Abscheidungskammer, vorzugsweise mit zwei Quellen, verwendet.

Die Elektroden werden durch Abscheidung von zwei Nanometern Chrom gebildet, gefolgt von sechs Nanometern Gold. Ohne das Vakuum zu brechen, kann eine im Inneren der Kammer angebrachte Quarzkristall-Mikrowaage verwendet werden, um die Dicke der Schichten während der Abscheidung zu messen. Wir können nun damit beginnen, die selbstorganisierte Monoschicht in einem gut belüfteten Bereich vorzubereiten, vorzuheizen und auf 75 Grad Celsius zu backen. Für die Herstellung der Lösung wird ein Milliliter Peg Seline mit 20 Millilitern Toluol in ein 250-Milliliter-Glasbecherglas gegeben.

Gut mischen, indem Sie fünf- bis 10 Mal auf und ab pipettieren und dann 30 Sekunden lang mit der Pipette umrühren. Lege die Musterproben mit der Seite nach oben in das Becherglasmuster und achte darauf, dass sie vollständig in die Lösung eingetaucht sind und gleichmäßig über den Boden des Becherglases verteilt sind. Den Becher in den Ofen schieben und 18 bis 21 Stunden backen, während sich der Sam formt.

Bereiten Sie die Gegenelektrode vor, indem Sie einen Nanometer Chrom gefolgt von vier Nanometern Gold auf einen 22 x 50 Millimeter großen Glasdeckglas aufbringen. Die Gegenelektrode sollte nahezu transparent sein und einen hellgrauen oder rosa Farbton aufweisen. Bewahren Sie die Gegenelektrode mit der beschichteten Seite nach oben in einer Petrischale auf, um sie sauber zu halten.

Nach 18 bis 21 Stunden im Ofen den Becher aus dem Ofen nehmen. Das Toluol sollte verdampft sein und die Musterproben in einem viskosen Peg-Cline-Rückstand hinterlassen haben. Geben Sie 20 Milliliter Toluol in das Becherglas und weichen Sie die Proben ein bis zwei Minuten ein.

Nehmen Sie die Proben aus dem Becherglas und spülen Sie sie mit Toluol, dann mit Isopropanol ab und trocknen Sie sie schließlich mit Stickstoff. Zu diesem Zeitpunkt sollten die Proben sauber aussehen und die Sam-Schicht sollte für das bloße Auge unsichtbar sein. Sam's, die auf diese Weise zubereitet werden, sind bis zu zwei Tage verwendbar, wenn sie unter kühlen, trockenen Bedingungen gelagert werden.

Eine erfolglose Sam-Bildung führt zu einer trüben oder ungleichmäßig gefärbten Rückstandsbeschichtung auf der Oberfläche. Mit dem vorbereiteten Sams können wir nun mit der Polymerisation von Tubulin zu Mikrotubuli beginnen. Beginnen Sie mit dem Auftauen von unmarkiertem Tubulin und r domine Tubulin und kombinieren Sie sie sofort in einem Verhältnis von zwei zu eins unmarkiert zu markiert, um helle Mikrotubuli zu erhalten.

Mischen Sie sie gut, indem Sie sie mehrmals auf und ab pipettieren. Als nächstes polymerisieren Sie das Tubulin für 20 bis 40 Minuten in einem erhitzten Wasserbad bei 37 Grad Celsius, während das Tubulin polymerisiert. Bereiten Sie einen Pipe-Taxol-Puffer vor, indem Sie 20 mikromolare Taxol mit Pipee-Puffer mischen.

Mischen Sie gut, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren und vortexen, und stellen Sie dann das Röhrchen in das erhitzte Bad bei 37 Grad Celsius. Nach der Polymerisation verdünnen Sie die Mikrotubuli in warmem pipee Taxol-Puffer und schirmen Sie sie vor Licht ab. Stellen Sie sicher, dass die Mikrotubuli-Polymerisation erfolgreich war und dass die Mikrotubuli unter mehrminütiger Fluoreszenzanregung stabil sind.

Durch Abbildung der präparierten Mikrotubuli mit einem Sauerstofffängergemisch wird die Polymerisation von Tubulin zu Mikrotubuli abgeschlossen. Beginnen wir mit der Strukturierung des MTS mit Elektrophorese. Schneiden Sie zunächst ein Stück doppelseitiges Klebeband in dünne Streifen, indem Sie es auf einen Objektträger legen und mit einer Rasierklinge zwei Streifen doppelseitiges Klebeband über die gemusterte, mit Sam beschichtete Probe schneiden, so dass sich die Elektrode zwischen den Streifen befindet und der Verbindungsweg senkrecht zum Band verläuft.

Legen Sie die Gegenelektrode so auf das doppelseitige Klebeband, dass die Metallseite das Band berührt, so dass der Rand der Probe etwa drei Millimeter über die Gegenelektrode hinausragt. Schneiden Sie mehrere 15 Zentimeter lange Längen isolierten Kupferlackdraht ab und isolieren Sie an beiden Enden einen Zentimeter der Isolierung ab. Verwenden Sie einen kleinen Tropfen Silberfarbe, um einen Draht an der freiliegenden Goldfläche des Substrats zu befestigen, und achten Sie darauf, keinen elektrischen Kontakt mit der Gegenelektrode zu haben.

Befestige nun mit silberner Farbe einen zweiten Draht an der Theke. Elektrodendrähte, die mit silberner Farbe befestigt sind, können mit Klebeband weiter an den Proben befestigt werden. Führen Sie anschließend mit einer Pipette Mikrotubuli im gewünschten Verdünnungsbild bei 20-facher Vergrößerung ein und lokalisieren Sie das Muster auf dem Siliziumwafer, bevor Sie eine Spannung anlegen.

Aufgrund der Tiefe der Durchflusskammer können Objektive mit großem Arbeitsabstand erforderlich sein, um die Oberseite der Durchflusskammer abzubilden. Der Abstand von der Probenoberfläche zur Oberseite der Durchflusskammer wird durch die Dicke des Bandes bestimmt und sollte etwa 60 bis 100 Mikrometer betragen. Legen Sie eine Spannung von bis zu einem Volt an und beobachten Sie die Wanderung der Mikrotubuli.

Wenn ein reversibles Einfangen von Mikrotubuli gewünscht wird. Verwenden Sie Nagellack, um die Durchflusskammer abzudichten, um eine seitliche Drift zu verhindern, und verwenden Sie niedrigere Spannungen bis hinunter zu etwa 0,5 Volt. Die Migration kann verfolgt werden, indem die vertikale Fokusebene des Mikroskops mit den angelegten Spannungen um 0,9 bis 1,2 Volt eingestellt wird; Mikrotubuli lokalisieren sich an den Elektrodenoberflächen.

Eine höhere Spannung beschleunigt die Migration und sorgt für eine stärkere Adhäsion, aber eine zu hohe Spannung induziert die Elektrolyse und depolymerisiert. Mikrotubuli, Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Sam-beschichtete Mikroelektroden für die MT-Strukturierung vorbereiten können, da die SAM-Beschichtung die Absorption von Mikrotuben auf den Mikroelektroden verhindert. Dieses Verfahren kann auch für die reversible Strukturierung von Mikrotubuli verwendet werden.

Darüber hinaus ist dieser Prozess nicht nur auf Mikrotubuli beschränkt, sondern kann auch zur Strukturierung von Biomolekülen im Allgemeinen verwendet werden. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.