Generieren Chimäre Zebrafischembryonen durch Transplantation

Hallo, ich bin Hillary Kemp vom Labor von Cecilia Owens. Und ich bin Cecilia Owens. Hillary und ich sind in der Abteilung für Grundlagenforschung am Fred Hutchinson Cancer Research Center in Seattle.

Heute zeigen wir Ihnen eine Technik zur Herstellung von chimären Zebrafischembryonen, die auch als genetische Mosaike bekannt sind. Dieses Verfahren ermöglicht es uns, die zellulären Grundlagen der Genfunktion während der Entwicklung zu beurteilen. Wir können fragen, ob ein gegebenes Gen in den Zellen mit einem mutierten Phänotyp, der als zellautonome Funktion bekannt ist, oder in der Umgebung dieser Zellen, die als Zellnichtautonomie bekannt ist, funktioniert.

Wir stellen diese Mosaike her, indem wir Zellen zwischen Wildtyp-mutierten Embryonen entweder in einem Blastula- oder frühen Gastrostadium transplantieren. Anschließend beurteilen wir die Genfunktion, indem wir den Phänotyp und Genotyp von Spenderzellen in ihrer Wirtsumgebung beobachten. Also lasst uns loslegen.

In diesem Teil des Protokolls wird ein Abstammungsfarbstoff in den Spenderembryo injiziert, so dass das Schicksal der von Spenderzellen nach der Transplantation verfolgt werden kann. Jede Art von Nukleinsäuren kann auch mit dieser Technik injiziert werden, jedoch lassen Sie den Dekorationsschritt bei der Injektion von DNA weg, bevor Sie mit den Embryonen arbeiten, bereiten Sie eine Injektionsschale vor, indem Sie einen Glasobjektträger in einem 45-Grad-Winkel über die breiteste Stelle einer Petrischale einführen. Drei Viertel gefüllt mit 1,2%aros im Stift-Streptokokken-Embryo-Medium.

Entfernen Sie den Schieber, nachdem die Agro ausgehärtet ist, um eine abgeschrägte Wanne zu erhalten. Füllen Sie den Trog mit Stift-Streptokokken-Embryo-Medium. Fahren Sie nun mit der enzymatischen Dekoration von Embryonen im Zellstadium fort.

Inkubieren Sie die Embryonen im Einzellstadium für ein bis fünf Minuten in einer Menge von 0,5 Milligramm pro Milliliter. Pronase-Lösung. Überwachen Sie die Dekoration genau.

Sobald das Corion sichtbar zu kollabieren beginnt, tauchen Sie die Embryonen in Systemwasser und dieses schüttet das gesamte Corium ab und die Embryonen bleiben unten am unteren Ende der Schnabelkurve. Und es ist wirklich wichtig, dass die Embryonen nicht nur ein weiteres Mal auf die Wasseroberfläche treffen, und die meisten von ihnen haben ihr Korion abgenommen. Es gibt ein paar herumwirbelnde Außenseite, die das nicht tun.

Wenn sich noch etwas in seinem Corion befindet, dann werden sie durch das Pipettieren auf diese Weise herausgeholt und dann die Embryonen freigesetzt, so dass sie niemals die Wasseroberfläche berühren. Es ist wichtig, beschichtete Embryonen mit einer Pipette zu behandeln, die feuerpoliert wurde, um die Ränder zu glätten. Übertragen Sie die zerbrechlichen, entkoffeinierten Embryonen vorsichtig mit einer feuerpolierten Glaspipette mit breiter Bohrung in die Wanne der Injektionsschale.

Und dann laden wir eine einzelne Datei in diesen Trog. Jetzt sind die Embryonen bereit, mit einem genau kalibrierten Feuer, einer gezogenen Glasinjektionspipette und einer Druckinjektionsanlage mit einem Abstammungsmarker injiziert zu werden. Wir werden eine Schale mit Embryomedium verwenden, um die Nadel zu brechen, und eine Schale mit Öl, um die Nadel zu kalibrieren.

Dies ist nur ein normales Standard-Mineralöl in Laborqualität. Wir nehmen eine angespitzte Uhrmacherzange und während wir durch die Okulare schauen, um die richtige Größe zu bestimmen, setzen wir die Pinzette auf beide Seiten der Nadel und brechen dann vorsichtig den Chip ab, was ich eigentlich nicht tun kann, ohne zu schauen, um das Volumen des abgegebenen Farbstoffs oder Ribonukleotids zu bestimmen. Bevor es losgeht.

Messen Sie die Bolusgröße in einer Schale mit Mineralöl. Die Nadel sollte abgebrochen werden, so dass ein Bolus von einem Nanoliter mit einem oder zwei Impulsen des Mikroinjektors abgegeben wird. Das Volumen des Bolus kann aus seinem Durchmesser berechnet werden, wie er mit einem Okularmikrometer gemessen wird.

Injizieren Sie einen Nanoliter einer bis 3%igen Lösung fluoreszierendes Dextran direkt in das Ylk von beschichteten Embryonen zwischen dem Ein- und dem Vierzellstadium. Was ich tun werde, ist, den Embryo direkt unter der Nadel zu positionieren. Ich werde die Nadel sanft in die Mitte des Eigelbs stechen und das Fußpedal durchtreten.

Nach der Injektion ist es wichtig, in die Dotterströme zu injizieren, damit der Farbstoff in die Zellen transportiert wird. Diese Injektion reicht aus, um Zellen in chimären Embryonen über mehrere Tage der Entwicklung zu verfolgen. Im Idealfall tun wir dies, bevor die Zellen das Vierzellstadium erreichen. Ziehen Sie die injizierten Embryonen bei geringer Dichte in einer beschichteten Petrischale auf, die mit frischen Streptokokken-Embryonen gefüllt ist. Mittel.

Beachten Sie, dass injizierte Embryonen dazu neigen, eine leicht verlangsamte Entwicklungsrate zu haben, Embryonen bei unterschiedlichen Temperaturen von 25, 28 und 31 Grad Celsius zu inkubieren, um ihre Entwicklung zu staffeln und das Zeitfenster zu maximieren, in dem Transplantationen durchgeführt werden können. Die für die Zelltransplantation in die Blastula des Zebrafisches verwendete Vorrichtung besteht aus einer antriebsgesteuerten Hamilton-Spritze, die durch einen Dreiwege-Absperrhahn an einem Mineralölreservoir und über ein Stück flexibler Schlauch an einem Mikropipettenhalter befestigt ist. Beseitigen Sie alle Luftblasen aus dem System, da sie Ihre Fähigkeit ruinieren, die Saugkraft und den Druck zu kontrollieren.

Verwenden Sie ein Stereomikroskop mit einer hochwertigen Optik mit mindestens einer DX-Vergrößerung. Um die Positionierung des Mikropipettenhalters und der Nadel zu kontrollieren, empfehlen wir einen manuellen Mikromanipulator NARA shige. Stellen Sie sicher, dass es mit einem Magnetfuß an der Bank befestigt ist, um zu verhindern, dass Vibrationen auf das Transplantat übertragen werden.

Nadeltransplantationsnadeln werden aus Glaskapillarpipetten hergestellt, die an einer polaren Elektrode zu einem sanften Kegel gezogen werden. Siehe das JoVE-Protokoll aus dem Labor von Miriam Goodman für Details zum Ziehen von Pipetten unter einem Präpariermikroskop, brechen Sie die Spitze der gezogenen Nadel ab. Bei Transplantationen im Blastulastadium sollte der Außendurchmesser der Nadel etwa 50 bis 60 Mikrometer oder 30 bis 40 Mikrometer für einen Gastro-Stadium-Transfer betragen.

Für einen Gastro-Stufentransfer zur Verbesserung der Penetration muss zuerst ein scharfer Widerhaken mit einem Mikrofutter am Ende der Nadel gezogen werden, dann glätten Sie die Nadelspitze, indem Sie sie nahe an das Filament der Mikroschmiede bringen. Drehen Sie dann die Nadel so, dass die Vorderkante der Fase mit dem Filament in Kontakt kommen kann. Sobald die Vorderkante der Nadel das Filament berührt, ziehe sie schnell weg, um einen Widerhaken zu erzeugen.

Um eine Beschädigung der Zellen zu vermeiden, sollte der Widerhaken gerade sein und die Spitze der Nadel sollte sich nicht krümmen. Wenn Sie das Rig und die Transplantationsnadeln vorbereitet haben, sind Sie bereit, chimäre Embryonen herzustellen. Blastula-Transplantate werden verwendet, um Zellen zwischen Embryonen zu transplantieren, wenn keine feinen Schicksalskarteninformationen erforderlich sind. Mit Ausnahme der primordialen Keimzellen sind die meisten Zellen in diesem Stadium in der Regel keinem Schicksal verpflichtet.

Die Schicksalskarte der Blastula ist so, dass wir zwischen Zellen unterscheiden können, aus denen Ektoderm hervorgehen wird, und Zellen, aus denen Mesoderm hervorgehen wird. Die mesodermalen und endodermalen Vorläufer liegen in der Nähe des Randes des Embryos im Blastulastadium, während die dermalen Vorläuferzellen, aus denen das Nervensystem und die Oberflächendermie hervorgehen, weiter vom Rand des Embryos entfernt liegen. Wenn wir also Zellen in Embryonen im Blastula-Stadium transplantieren, können wir diese Zellen auf das präsumtive Mesoderm oder auf das präsumtive Ektoderm ausrichten.

Aber wir können Zellen nicht auf eine bestimmte Region des Ektoderms oder des Mesoderms ausrichten, weil wir es nicht wissen. Im Blastulastadium, wo sich die dorsale Seite des Embryos befindet, bereiten Sie die Injektionsschalen im Voraus vor, indem Sie eine Kunststoffform mit paarigen Reihen keilförmiger Vorsprünge in eine Petrischale schwimmen lassen, die zur Hälfte mit geschmolzenem 1,2%aros im Embryomedium gefüllt ist. Sobald der Aros erstarrt ist, entfernen Sie die Schablone und lassen Sie Reihen dreieckiger Vertiefungen übrig, die jeweils gerade groß genug sind, um einen Embryo aufzunehmen.

Füllen Sie die Transplantationsform mit Stift-Streptokokken-Embryomedium und laden Sie die Embryonen im Blastulastadium einzeln mit einer feuerpolierten Glaspipette in jede Vertiefung. Übertragen Sie nun die Embryonen in die Transplantatvertiefungen, lassen Sie sie zunächst auf der Seite liegen. Ordnen Sie die Embryonen so an, dass die Spenderembryonen eine Spalte und die Wirtsembryonen in der angrenzenden Spalte platziert werden.

Positionieren Sie die Schale so auf dem Tisch, dass die Nadel beim Eintritt der Transplantationsnadel in einen Embryo den Embryo gegen die Rückwand seiner Vertiefung drückt. Senken Sie die Transplantationsnadel mit dem Mikromanipulator in einem ziemlich steilen Winkel in die Schale. Idealerweise sollte die Transplantationsnadel in einem Winkel von etwa 45 Grad in den Embryo eindringen.

Sobald sich die Spitze der Nadel unter der Oberfläche des Embryomediums befindet, ziehen Sie eine kleine Menge Embryomedium in die Nadel, indem Sie den Mikrometerantrieb drehen, der die Hamilton-Spritze steuert. Für eine möglichst genaue Kontrolle sollte die Grenzfläche zwischen dem Mineralöl und dem Embryomedium im dünnen, sich verjüngenden Teil der Nadel verbleiben, nicht zu nahe am Ende. Positionieren Sie den Spenderembryo vorsichtig mit der Nadel und ziehen Sie dann die Nadel zurück und führen Sie die Blastulakappe des Embryos an der gewünschten Position ein.

Ein schneller harter Schlag dringt in den Embryo ein, ohne dass er sich wälzt. Ziehen Sie Spenderzellen langsam und vorsichtig in die Nadel ein, um ein Scheren der Zellen zu vermeiden. Vermeiden Sie es, Eigelb in die Nadel zu geben, nachdem die gewünschte Anzahl von Zellen aufgenommen wurde.

Kehren Sie den Druck leicht um, um das Saugen zu stoppen und die Nadel aus dem Wirtsembryo zu entfernen, um ihn in Position zu bringen. Durch das Bewegen der Transplantationsschale können kleine Anpassungen an der Position des Wirtsembryos vorgenommen werden, indem er mit der Transplantationsnadel vorsichtig gedreht wird, solange darauf geachtet wird, dass das Eigelb nicht berührt wird. Wenn Sie die Spenderzellen in den Wirtsembryo ausstoßen, vermeiden Sie es, ylk in den Embryo aufzunehmen, da dies die Spenderzellen eines einzelnen Spenderembryos beschädigt und abtötet. Der Embryo kann nach Abschluss der Zelltransfers auf mehrere Wirte transplantiert werden.

Übertragen Sie die Donor-Wirtspaare in die beschichteten Wells einer 24-Well-Platte, um die Entwicklung fortzusetzen. Die einzige Ausnahme von der Regel, dass Zellen im Blastulastadium keinem bestimmten Schicksal unterworfen sind, sind die Urkeimzellen. Primordiale Keimzellzellen werden sehr früh in der Entwicklung spezifiziert und sind an ihr ursprüngliches Keimzell-Schicksal gebunden.

Schon in einem sehr frühen Stadium liegen die primordialen Keimzellen in der Nähe des Randes einer Blastula und eines Embryos im Gaststadium. Wenn also das Ziel des Transplantationsexperiments darin besteht, primordiale Keimzellen zu transplantieren, dann ist es sehr wichtig, woher die Zellen im Spenderembryo kommen und nicht wichtig, wo sie in den Wirtsembryo gelangen. Die Regel lautet also, dass es für somatische Zellen wichtig ist, wohin sie im Wirtsembryo gehen, der ihr Schicksal bestimmt.

Wobei es im Fall von Urkeimzellen wichtig ist, woher sie im Spenderembryo stammen, weil ihr Schicksal bereits feststeht. Wenn das Ziel darin besteht, primordiale Keimzellen zu transplantieren, dann müssen die Zellen vom Rand der Hoffnung des Spenderembryos entnommen werden, und sie befinden sich genau in der Nähe des Randes des Embryos in vier kleinen Clustern von jeweils drei oder vier Zellen auf diesem Blatt, diesem Speerstadium oder hohen Entwicklungsstadium. Und man muss sie sehr vorsichtig aufheben, um nicht versehentlich das Eigelb aufzusaugen.

Okay, und das habe ich dort gemacht, und jetzt ziehe ich zu einem Wirtsembryo um. Jetzt werden sich die primordialen Keimzellen bis in die Genitalkammregion des Embryos verfeinern, in dem sie sich befinden. Es ist also nicht nötig, diese primordialen Keimzellen an den Rand zu transplantieren, sie gelangen selbst dorthin.

Also transplantiere ich sie einfach und setze sie an einem beliebigen alten Ort in den Postembryo zurück. Der Schlüssel für eine Keimzelltransplantation, die das Gegenteil von jeder anderen Art von Transplantation ist, besteht darin, dass es darauf ankommt, woher die Spenderzellen stammen. Die Transplantation von Zellen in einen Wirt im Gastrostadium ermöglicht es dem Experimentator, die Schicksalskarte des Zebrafisches zu nutzen, die entsteht, wenn der Embryonalschild sichtbar wird.

Es wird möglich, verschiedene Gewebetypen sowie die Domänen innerhalb des präsumtiven Zentralnervensystems zu unterscheiden. Beim Transfer von Zellen zwischen Embryonen im Stadium der Gastro-Liste gibt es einige Variationen im Protokoll, aber das allgemeine Verfahren ähnelt der Arbeit mit Blastos zur Montage von Gastros. Schmieren Sie zuerst einen vertikalen Streifen Methylcellulose in die Vertiefung eines Glasobjektträgers und fluten Sie ihn dann mit einer großzügigen Menge Stift-Streptokokken-Embryo-Medium unter Verwendung eines feuerpolierten Pipettentransfers.

Ein Spender und drei Wirte im Schildstadium des Depressionsträgers. Wählen Sie Spenderembryonen aus, die etwas jünger sind als die Wirtinnen. Ein neues Werkzeug wird benötigt, um den Gastrosenkleber zu manipulieren, die Enden einer kurzen Länge von zwei Pfund Testangelschnur in das Ende eines Kapillarrohrs.

So entsteht eine kleine Schleife. Rollen Sie die Spender- und Wirtsembryonen vorsichtig mit der Schlaufe auf die Oberseite des Methylcellulosestreifens und stopfen Sie sie in die Methylcellulose, bis sie fest sitzen. Rollen Sie sie so in Position, dass der Zielbereich nach oben zeigt.

Denn während der Transplantation dringt die Nadel tangential in den Embryo ein, um die Spenderzellen zu liefern, ohne das Ylk zu beschädigen. Gastro-Transplantationen werden am besten an einem zusammengesetzten Mikroskop mit festem Tisch durchgeführt. Verwenden Sie die Bedienelemente des Mikromanipulators, um die Spitze der Transplantationsnadel in den Fokus zu bringen.

Positionieren Sie den Mikropipettenhalter und die Nadel in einem relativ flachen Winkel, so dass die Nadel so nah an der Horizontalen ist, wie es der Rand der Vertiefung auf dem Objektträger zulässt. Als nächstes stechen Sie den Spenderembryo ein. Wenn sie richtig montiert ist, rollt sie beim Eintritt der Transplantationsnadel nicht weg, es sei denn, der Embryo ist zu alt, um die Nadel leicht eindringen zu lassen.

Um ein Durchstechen des Ylks zu vermeiden, sollte die Nadel in einer Fokalebene in den Embryo eindringen, die nur geringfügig tiefer ist als die der EDL. Nach dem Durchstechen kann dem Spender eine große Anzahl von Zellen für bis zu drei Wirtszellinjektionen entnommen werden. Vermeiden Sie beim Ziehen von Zellen das Aufsaugen des Eigelbs, indem Sie die Nadel bewegen, während die Zellen aufgenommen werden, falls gewünscht.

Zusätzliche Embryonen können für mehr Zellen mit derselben Nadel geerntet werden, bevor die Zellen in den Wirt ausgestoßen werden, während der Zellauswurf in den Wirtsembryo die Zellen ausstoßen, während die Nadel durch den Zielbereich gezogen wird, anstatt die Zellen in einem einzigen Klumpen zu deponieren. Dadurch steigt die Wahrscheinlichkeit, dass die Spenderzellen zum gewünschten Gewebe beitragen. Sobald der Zelltransfer abgeschlossen ist, legen Sie den gesamten Objektträger in eine Petrischale und fluten Sie sie vorsichtig mit einem Stift-Streptokokken-Embryo. Mittel.

In den nächsten Stunden löst sich die Methylcellulose auf und gibt die Embryonen frei. Die Anzahl der übertragenen Zellen hängt vom spezifischen Ziel des Experiments ab. Zellen eines einzigen Spenders können am Morgen nach der Transplantation in drei oder vier Wirte transplantiert werden.

Wirte können untersucht werden, um festzustellen, ob das Targeting von Spenderzellen erfolgreich war. Die erfolgreiche Transplantation von primordialen Keimzellen aus dem Blastula-Alter führt zu fluoreszenzmarkierten Zellen, die ventral in der Nähe der Verbindung zwischen dem Ylk und dem Ylk-Fortsatz positioniert sind. Deshalb haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Transplantationen im Gastrula- und Blastulastadium durchführen.

Bei dieser Technik ist es wichtig, die richtige Art der Transplantationsmethode für das Zielgewebe zu wählen, das Sie mit Ihren Zellen ansprechen möchten. Eine Transplantation im Blastulastadium ist also ausreichend, um zu bestimmen, ob die Zellen in die Haut und nicht in das Ektoderm gehen. Und Sie können diese Technik auch verwenden, um primordiale Keimzellen anzugreifen.

Wenn Sie eine feinere Kartierung vornehmen möchten, ist es besser, eine Magen-Darm-Alterstransplantation zu verwenden, bei der die dorsale Seite bereits bestimmt wurde. Und so können Sie mit dieser Technik Zellen auf verschiedene Teile des Nervensystems ausrichten, insbesondere auf das Vorderhirn, das Mittelhirn, das Hinterhirn und das Rückenmark. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei all Ihren Experimenten.