Name: Ein High-Throughput-Methode für Zebrabärblinge Sperma Kryokonservierung und In Vitro Fertilisation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-06T19:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Erfahren Sie eine Hochdurchsatz-Methode zur Kryokonservierung von Danio rerio-Sperma mit durchschnittlich 25% Fertilität bei In-vitro-Fertilisation. Dieses Protokoll ermöglicht die langfristige Lagerung über sieben Jahre.

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Diese Arbeit wurde vom NIH R01 HG002995 unterstützt &quot;TILLING der Zebrafisch-Genom: ein Reverse Genetics Approach&quot; zu CBM.

Teil A: Sperm Freezing-Lösungen 1. Ginsberg Fisch Ringers (Stellen frische alle 3 Tage, Ginsburg, 1963) Hinweis: Reihenfolge der Zugabe ist WICHTIG Ausfallen verhindern In 450 ml sterile ddH2O auflösen: <ul><li> NaCl 3,25 g </li><li> KCl 0,125 g </li><li> CaCl2 • 2 H2O 0,175 g Dann fügen Sie: </li><li> NaHCO3 0,10 g </li></ul> Bringen Endvolumen von 500 ml mit sterilem ddH2O und lagern bei 4 ° C. 2. Freezing Medium (Machen Sie täglich frisch) <ol style="list-style-type:lower-roman"><li> Ohne Methanol <ul><li> Ginsburg Fisch Ringers 10 ml (Raumtemp.) </li><li> Magermilchpulver 1,5 g </li></ul></li><li> Mit Methanol Hinweis: Reihenfolge der Zugabe ist WICHTIG Ausfallen verhindern <ul><li> Ginsburg Fisch Ringers 9 ml (Raumtemp.) </li><li> Methanol 1 ml </li><li> Magermilchpulver 1,5 g </li></ul> Nach der Montage Einfrieren Medien, gut mischen für 20 min. auf Orbitalschüttler oder Wippe. Vor der Verwendung aliquoter in 1 ml Eppendorf-Röhrchen, die Vermeidung Oberfläche Blasen. </li></ol> Teil B: Materialien für die Spermien Einfrieren benötigt Materialien für die Spermien Einfrieren benötigt <ol><li> 10 pl Einwegpipetten (Fisherbrand cat # 22-358697) </li><li> 250ml Becher für Fische Wasser mit MESAB / Tricaine </li><li> Uhrgläser (Pyrex cat # 9985-75) </li><li> P20 Pipetman (oder gleichwertig) und Tipps </li><li> Sponge Fisch Halter (männlich halten, während Quetschen) </li><li> Präpariermikroskop mit über Bühnenbeleuchtung </li><li> Flache Pinzette (zB Millipore Typ) </li><li> 2.0ml Kryoröhrchen (Corning cat # 430488) </li><li> 10X10 Cryoboxen (Nalgene cat # 03-337-7AA) </li><li> Styropor-Container mit ~ 15 cm, fein zerkleinert trockene ice1 gefüllt </li><li> 15 ml konische Röhrchen (Falcon # 352099) </li><li> Dewar mit flüssigem Stickstoff </li><li> Lange Zangen (zB CMS Fisher Health Care cat # 10-316B) </li><li> Kryo- </li><li> Schmutzwassertank für Männer </li><li> Ein Eppendorf-Röhrchen mit dem Einfrieren Medien ohne Methanol gefüllt </li><li> Ein Eppendorf-Röhrchen mit dem Einfrieren Medien mit Methanol gefüllt </li><li> Cryofreezer (z. B. Taylor-Warton K-Serie) </li></ol> 1 Ein einfaches Verfahren zur Herstellung von fein zerkleinertem Trockeneis ist, um es in ein Handtuch wickeln und pulverisieren sie mit einem Hammer. Eine effizientere Methode ist es, eine Trockeneis Mühle, z. B. Clawson Modell RE-2 verwenden. Teil C: Sperm Freezing-Methode <ol><li> MARK Kapillarröhrchen: Vor Beginn, markieren Sie die 10 &amp;mgr; l Kapillarröhrchen mit einem Labor Stift auf dem Niveau von 3,33 ul (dh 16,7 mm von unten, siehe Abb. 1.1.). </li><li> Betäuben MALE: Platz männlich (s) in Becherglas mit MESAB / Tricaine in Fischwasser (Rezept in &quot;Der Zebrafisch Book&quot;) verwässert </li><li> Trockenfisch: Einmal betäubt, Lift Fisch aus der Narkose mit einem Plastiklöffel und sanft Blot Fisch trocken auf einem Papiertuch, wobei besonderes Augenmerk auf das Trocknen der Bauchseite. Wasser aktiviert Spermien so ist es wichtig, gründlich rund um die Kloake trocken. Position Fisch auf Schwammhalter, Bauchseite nach oben (Abb. 1.2). Wenn Region um Afterflosse ist noch feucht, sanft mit einem trockenen Kimwipe. Achten Sie darauf, nicht quetschen Spermien vorzeitig! </li><li> Ort markiert Kapillare in Gummi Mund pipettieren Adapter, der mit Kapillaren enthalten ist. Der Adapter ist ein Gummischlauch, dass ein Mundstück an einem Ende und einem Kapillarenhalter auf der anderen Seite hat. Alternativ kann die Kapillare zu einem 50 ul Hamilton Spritze über ein kurzes Stück Tygon-Schlauch der entsprechenden Durchmesser angeschlossen werden. </li><li> Platz männlich unter den Anwendungsbereich und setzen die urogenitalen Eröffnung durch vorsichtiges Verbreitung der Bauchflossen auseinander mit dem Ende der Kapillare. </li><li> COLLECT SPERM: Expel Spermien durch leichtes Streicheln der Seiten des Fisches mit glatten Pinzette (zB Millipore), oder durch leichtes Drücken den Seiten des Fisches zwischen Zeigefinger und Daumen. Sammeln Spermien in Kapillare, wie es ist ausgeschlossen mit sanftem Sog (Abb. 1.2). Vermeiden Fäkalien, die mit Spermien ausgeschlossen werden kann. </li><li> NORMALIZE Samenzellenvolumens auf 3,3 ul: Wenn das Volumen des Spermas erreicht oder überschreitet Stift Zeichen auf Kapillare (dh 16,7 mm oder größer), dann fahren Sie mit Schritt 8 fort. Wenn Spermien Volumen nicht erreicht Zielvolumen, dann normalisieren Volumen Stift markieren Einsatz des Freeze-Medium ohne Methanol (Abb. 1.3). Mindestbetrag von Spermien, die akzeptabel ist, hängt mit der Qualität der Spermien. Gute Spermien ist weiß und undurchsichtig. Schlechte Spermien sieht wässrig. In der Regel übernehmen wir als Minimum: 1 ul gute Spermien (oder 1 / 3 target) und 2 ul schlechte Spermien (oder 2 / 3 target). Volume ist nun auf 3,3 ul normalisiert. </li><li> ADD Gefrierschutzmittel für Spermien: Suck bis Einfriermedium mit MEthanol zum orangefarbene Markierung (ca. Gesamtvolumen beträgt jetzt 20 ul;. Abb. 1,4). Expel Spermien und Frostschutzmittel-Gemisch auf die saubere Fläche von einem Uhrglas, wobei besonderes Augenmerk auf nicht vorstellen Blasen. Vorsichtig durch Auf-und Abpipettieren ~ 4 mal (zu vermeiden Einführung von Blasen) zu mischen. </li><li> PLACE 10 &amp;mgr; l Sperma in je 2 Kryoröhrchen: Je 10 ul der Spermien: Gefrierschutzmittel Lösung in den unteren zwei getrennte Kryoröhrchen, dass alle relevanten Informationen (Abb. 1,5) markiert worden sind. Umzug schnell, Kappe Fläschchen und legen Sie sie in den Boden der Raumtemperatur 15 ml Falcon-Tubes-one-Kryoröhrchen / Rohr. Cap Falcon-Röhrchen und setzen Sie das Paar Kryoröhrchen-haltigen Falcon-Röhrchen in zerkleinertem Trockeneis. </li><li> FREEZE Spermien für 20 MIN. Auf Trockeneis: Trockeneis sollte in feiner Pulverform, nicht Pellets werden. Die Rohre sollten in das Trockeneis eingesetzt tief genug, dass nur ihre Mützen (Abb. 1.6) zeigen werden. Um den Überblick über Rohre in Trockeneis zu halten, geben Sie jedem Paar Falcon-Tubes eine Zahl von 1-20 (geschrieben an den Kappen) und notieren Sie die Zeit, die sie gehen in die Trockeneis. </li><li> PLACE Kryoröhrchen in flüssigen Stickstoff:. Nach der Spermien wurde auf Trockeneis für 20 min eingefroren, übertragen Sie sie auf einem flüssigen Stickstoff-haltige Dewar. Sperma ist hier bis zum Zeitpunkt, in flüssigem Stickstoff Gefrierschrank gelagert. Beim Platzieren in den Gefrierschrank Boxen, Platz Gefrierfach in einem Bad aus flüssigem Stickstoff, so dass Proben nicht erwärmen. Verwenden Sie lange Metall-Zange Röhrchen aus Dewargefäß erholen und Griff mit Kryo. Alternativ können Kryoröhrchen direkt aus Trockeneis überführt werden in die Tiefkühltruhe, wenn der Gefrierschrank Box gehalten wird eingetaucht in flüssigem Stickstoff in einem Styropor-Behälter. </li><li> Shop Kryoröhrchen langfristig in einer kryogenen flüssigen Stickstoff Gefrierschrank. Zur Aufrechterhaltung Lebensfähigkeit von Spermien, ist es wichtig, dass Fläschchen gespeichert sind eingetaucht in flüssigem Stickstoff. In unserer Erfahrung, verlieren Fläschchen in der Gasphase gespeichert Lebensfähigkeit im Laufe der Zeit. Schnelligkeit ist wichtig! Die Zeit zwischen dem Hinzufügen der Gefrierschutzmittel und Platzierung Spermien Fläschchen in Trockeneis (dh die Schritte 6-10) sollte nicht mehr als 30 Sekunden sein. </li></ol> Teil D: In-Vitro-Fertilisation Methode unter Einsatz von Kryokonservierte Sperm Wir finden, dass dies am besten mit zwei Personen. Eine Person drückt Eier von Weibchen während die andere Person taut der Spermien. <ol><li> Legen Sie ein Wasserbad auf 33 ° C. </li><li> Entfernen Sie aus flüssigem Stickstoff Gefrierschrank und Transfer-Kryoröhrchen in flüssigen Stickstoff-haltigen Dewargefäß erst unmittelbar vor der Schneeschmelze. </li><li> Squeeze Eier vom Weibchen in 35-mm-Petrischale aus Kunststoff. Wenn möglich, versuchen zu 3 Gelege zu erhalten und vereinigen sich zu einem Gericht. Wenn Sie nicht bekommen kann drei gute Kupplungen innerhalb von 1 min Ihrer ersten Kupplung, dann gehen Sie zu Schritt 4 (ein guter Kupplung ist ausreichend). Definition des guten Kupplung:&gt; 150 gleichmäßig gut aussehende Eier (dh gelblich, ohne weiße Rückstände Anzeichen für Degradation). Keep Schüssel abgedeckt, während Spermien aufgetaut. </li><li> Entfernen Fläschchen aus flüssigem Stickstoff und Kappe entfernen. Schnell tauchen Fläschchen ~ 1 / 2 Weg ins 33 ° C Wasserbad für 8-10 sek. </li><li> Schnelles Hinzufügen von 70 ul Raumtemperatur Hanks zu Fläschchen und mischen durch Auf-und Abpipettieren. Unmittelbar nach Eier hinzufügen und vorsichtig mischen mit Pipettenspitze. </li><li> Ohne Verzögerung, aktivieren Spermien und Eier durch Zugabe von 750 ul Fisch Wasser. Swirl zu mischen. Inkubieren 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Nach 5 min, füllen Teller mit Fisch Wasser und inkubieren Schale bei 28 ° C. Nach 2-3 Stunden, zu zählen und zu übertragen fruchtbaren Embryonen bis 100mm Gerichte (50/dish). Graf unbefruchtete Eier, so dass die Befruchtung Frequenz bestimmt werden kann. </li><li> Passen Sie gut auf die Larven! Für die ersten 5 Tage, ändern Wasser täglich und entfernen abgestorbene Embryonen. Legen Sie nur Larven, die Schwimmblase haben in den Kindergarten am Tag 5. </li></ol> Teil E: Repräsentative Ergebnisse Wir haben dieses crypreservation Methodik, um eine Bibliothek von 8600 eingefrorenen Spermien Proben für TILLING zwischen den Jahren 2001 und 2003 zu machen. Wir haben 106 dieser Proben aufgetaut und bestimmt ihre Fruchtbarkeit. Die Fruchtbarkeit ist das Verhältnis von lebensfähigen Embryonen in einem in-vitro-Fertilisation durch die Gesamtzahl der Eier, die mit dem gefrorenen Sperma befruchtet wurden unterteilt produziert. Fresh (non cryporeserved) Spermien typischerweise&gt; 95% Fruchtbarkeit; kryokonservierten Spermien hat viel niedriger Fruchtbarkeit: durchschnittlich 29% (n = 106 Flaschen). Das Fläschchen-to-Fläschchen Variabilität in der Fruchtbarkeit ist groß und reicht von weniger als 1% auf bis zu 62%. Diese Variabilität ist durch die großen Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung in Abb. dargestellt. 2. Doch in 106 Spermaproben aufgetaut bis heute haben wir nur einmal 0% Fruchtbarkeit bei beiden Samenproben erfahrenen und es versäumt, die entsprechenden TILLING Mutation zu erholen. Mit dem Auftauen Spermien Fläschchen aus unserer Bibliothek im Laufe von mehreren Jahren (2001-2008) haben wir festgestellt, dass die durchschnittliche Fruchtbarkeit von Sperma-Proben mit dieser Methode eingefroren bleibtüber die Zeit stabil (Abb. 2). Die durchschnittliche Fruchtbarkeit der gefrorenen Sperma-Proben im Jahr 2001 wieder aufgetaut war 23,5% (basierend auf 11 Spermaproben) und in 2008 betrug 25% (basierend auf 21 Spermaproben). Eine Reihe anderer Forscher sind jetzt mit diesem Sperma Einfrieren Protokoll in ihren Labors. Einige haben gute Erfolge mit Geburtenraten und Probe zu Probe Variabilität ähnlich dem, was wir beobachtet haben, berichtet. Andere haben angeblich nicht, um dieses Protokoll in ihren Händen arbeiten. Wir glauben, dass wahrscheinlichen Quellen von Problemen sind: <ol><li> Die Nichtbeachtung der genauen Kryoröhrchen oder konische wir in das Protokoll vorgeschlagen haben zu verwenden, was zu einer unterschiedlichen Geschwindigkeit der Abkühlung, wenn in Trockeneis; </li><li> Andernfalls gepudert Trockeneis verwenden, was zu einer sub-optimalen Kühlrate; </li><li> Mit männlicher Fische mit schlechter Fruchtbarkeit: Sie sollten mindestens 1 ul der Spermien von einem einzigen Männchen bekommen. Sie können auch testen, männliche Fruchtbarkeit, indem Sie eine in-vitro-Fertilisation mit frischem Sperma, dies kann jedoch irreführend sein, weil es sehr wenig frisches Sperma braucht, um nahezu 100% der Fruchtbarkeit bekommen. </li><li> Mit minderer Qualität Eier in den in-vitro-Fertilisation. Mit alles andere als perfekt Kupplungen führt immer zu nahe bei 0% Fruchtbarkeit, auch von Samenproben, die tatsächlich gute Fruchtbarkeit (basierend auf die Fruchtbarkeit der doppelten Durchstechflasche). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Spermien Einfrieren Methodik. <img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Kryokonservierte Spermien Fruchtbarkeit bleibt stabil über die Zeit. Prozent Fruchtbarkeit ist die Anzahl der lebensfähigen Embryonen in einem in-vitro-Fertilisation durch die Gesamtzahl der Eier, die mit dem gefrorenen Sperma befruchtet wurden unterteilt produziert. &quot;N&quot; bezieht sich auf die Zahl der kryokonservierten Spermien Fläschchen, deren Fruchtbarkeit wurde in das entsprechende Jahr getestet. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung. Da jedes Spermium Durchstechflasche ist aus einem anderen Männchen, Fläschchen-to-Fläschchen Variabilität beobachtet.

<ol><li>Ginsburg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm-egg+association+and+its+relationship+to+activation+of+the+egg+in+salmonid+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Sperm-egg association and its relationship to activation of the egg in salmonid fishes.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 11, 13-33 (1963).</li>
<li>Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+zebra+fish+spermatozoa+using+methanol%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Zoology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol.</a> Can. J. Zoology. 60, 1867-1870 (1982).</li>
</ol>

Eine Reihe anderer Forscher sind jetzt mit diesem Sperma Einfrieren Protokoll in ihren Labors. Einige haben ähnliche Fruchtbarkeit und derselben Probe zu Probe Variabilität, die wir beobachtet haben, berichtet. Andere haben angeblich nicht, um dieses Protokoll in ihren Händen arbeiten. Wir glauben, dass wahrscheinlichen Quellen von Problemen sind: <ol><li> Die Nichtbeachtung der genauen Kryoröhrchen oder konische wir in das Protokoll vorgeschlagen haben zu verwenden, was zu einer unterschiedlichen Geschwindigkeit der Abkühlung, wenn in Trockeneis; </li><li> Andernfalls gepudert Trockeneis verwenden, was zu einer sub-optimalen Kühlrate; </li><li> Mit männlicher Fische mit schlechter Fruchtbarkeit: Sie sollten mindestens 1 ul der Spermien von einem einzigen Männchen bekommen. Sie können auch testen, männliche Fruchtbarkeit, indem Sie eine in-vitro-Fertilisation mit frischem Sperma, dies kann jedoch irreführend sein, weil es sehr wenig frisches Sperma braucht, um nahezu 100% der Fruchtbarkeit bekommen. Größer, robust gefärbten Männchen in der Regel mehr geben höhere Qualität der Spermien. </li><li> Mit minderer Qualität Eier in den in-vitro-Fertilisation. Mit alles andere als perfekt Kupplungen führt immer zu nahe bei 0% Fruchtbarkeit, auch von Samenproben, die tatsächlich gute Fruchtbarkeit (basierend auf die Fruchtbarkeit der doppelten Durchstechflasche). </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Einweg-Pipetten, 10 &amp;mu;l</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-358697</td><td></td></tr><tr><td>Uhrgläser</td><td>Pyrex</td><td>9985-75</td><td></td></tr><tr><td>Kryoröhrchen, 2 ml</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>Kryoboxen, 10 x 10</td><td>Nalge Nunc international</td><td>03-337-7AA</td><td></td></tr><tr><td>Kegelröhrchen, 15 ml</td><td>Falcon BD</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>Zange</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-316B</td><td></td></tr><tr><td>Kryotank</td><td>Taylor-Wharton</td><td>K-series</td><td>Zum Beispiel</td></tr></tbody></table>

ein high-throughput-methode für zebrabärblinge sperma kryokonservierung und in vitro fertilisation

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

Dies ist eine Methode zur Zebrafisch Spermien Kryokonservierung, dass eine Anpassung der Harvey-Methode (Harvey et al., 1982) ist. Wir haben zwei Änderungen an dem ursprünglichen Protokoll eingeführt, dass sowohl die Verfahren zu straffen und zu erhöhen Probe Uniformität. Zunächst normalisieren wir alle Spermien Volumes mit dem Gefrierpunkt Medien, die nicht enthält Gefrierschutzmittel. Zweitens kryokonservierten Spermien in Kryoröhrchen statt Kapillarrohre gespeichert. Die Preise von Spermien Einfrieren und Auftauen (δ ° C / Zeit) sind wohl die beiden wichtigsten Variablen, die in diesem Verfahren zu kontrollieren. Aus diesem Grund sind kein Ersatz für verschiedene Rohre für diejenigen angegeben. Arbeiten in Teams von 2 ist es möglich, die Spermien von 100 Männern pro Team in ~ 2 Stunden einfrieren. Sperma kryokonserviert mit diesem Protokoll hat einen Durchschnitt von 25% der Fruchtbarkeit (gemessen als die Anzahl der lebensfähigen Embryonen in einem in-vitro-Fertilisation durch die Gesamtzahl der Eier befruchtet unterteilt erzeugt) und das Prozent Fruchtbarkeit ist über viele Jahre stabil.

Dies ist ein High-Throughput-Spermien Kryokonservierung Protokoll für Zebrafisch. Sperma kryokonserviert mit diesem Protokoll hat einen Durchschnitt von 25% der Fruchtbarkeit in späteren vitro-Fertilisation und ist über viele Jahre stabil.

Ein High-Throughput-Methode für Zebrabärblinge Sperma Kryokonservierung und In Vitro Fertilisation

Dies ist eine Methode zur Kryokonservierung von Zebrafisch-Spermien, die eine Anpassung der Harvey-Methode (Harvey et al., 1982) darstellt. Wir haben zwei Änderungen an ... eingeführt.

Hallo, ich bin Bruce Draper von der University of California Davis, Abteilung für Molekulare und Zelluläre Biologie, und ich bin Cecilia Moans aus der Abteilung für Grundlagenforschung am Fred Hutchinson Cancer Research Center in Seattle. Heute werden Cecilia und ich die Protokoll zur Kryokonservierung von Zebrafisch-Sperma demonstrieren, eine Modifikation des ursprünglichen Brian-Harvey-Protokolls. Wir zeigen Ihnen, dass es in Teams zu zweit möglich ist, Sperma von 100 einzelnen Männchen innerhalb von weniger als zwei Stunden einzufrieren.Obwohl die Fruchtbarkeit nach dem Auftauen stark variieren kann, erhalten wir im Durchschnitt eine Fruchtbarkeit von 25 %, und dies aus einer Bibliothek, die seit über sieben Jahren kryokonserviert wurde. Beginnen wir also. Bevor Sie dieses Verfahren durchführen, stellen Sie zunächst die Spermafrostmischungen her.Die Ginsburg-Fish-Ringer-Lösung wird alle drei Tage frisch hergestellt, und das Einfriermedium wird täglich frisch mit und ohne Methanol hergestellt. Die Zusammensetzung dieser Lösungen ist in den Online-Ergänzungsinformationen zu diesem Protokoll enthalten. Die Materialien, die bei diesem Verfahren verwendet werden, können die Geschwindigkeit des Einfrierens und Auftauens beeinflussen, was wiederum die Fruchtbarkeit des eingefrorenen Spermas beeinträchtigen kann.Aus diesem Grund wird eine Liste empfohlener Materialien auch als ergänzende Online-Information bereitgestellt. Es ist am besten, die Spermien auf fein zerstoßenem Trockeneis einzufrieren, anstatt auf Trockeneis-Perlen. Eine einfache Möglichkeit, Trockeneis zu zerkleinern, besteht darin, es in ein Handtuch zu wickeln und mit einem Hammer zu pulverisieren.Eine effizientere Methode besteht darin, einen Trockeneismühle wie eine Claws- und Modell-RE-2-Mühle zu verwenden, um Zebrafischsperma einzufrieren. Markieren Sie zunächst Kapillarrohre mit 10 µL Fassungsvermögen mit einem Laborstift auf der Höhe von 3,33 µL oder etwa 16,7 mm vom Boden aus, um die Männchen zu betäuben. Platzieren Sie zwei bis vier Männchen in einem Becher, der mit verdünntem Trica und Fischwasser gefüllt ist. Das Rezept finden Sie im Zebrafisch-Buch.Nach der Betäubung den Fisch mit einem Plastiklöffel aus der Anästhetika-Lösung heben und vorsichtig mit einem Papiertuch trocken tupfen. Besondere Aufmerksamkeit sollte der Ventralseite gewidmet werden. Wasser aktiviert das Sperma, daher ist es entscheidend, die Umgebung des Ika gründlich zu trocknen.Platzieren Sie den Fisch mit der Bauchseite nach oben auf dem Schwammhalter. Wenn der Bereich um die Bauchflossen noch feucht ist, trocknen Sie ihn vorsichtig mit einem Kim-Tuch ab. Setzen Sie das markierte Kapillarrohr in einen Gummimundpipettenadapter, der den Kapillarrohren beiliegt.Der Adapter ist ein Gummischlauch mit einem Mundstück an einem Ende und einem Kapillarhalter am anderen Ende. Alternativ kann die Kapillare an eine 50-Mikroliter-Hamilton-Spritze angeschlossen werden. Mit einem kurzen Stück Tigon-Schlauch passenden Durchmessers wird das Männchen unter dem Mikroskop platziert und die urogenitale Öffnung freigelegt, indem die Beckenflossen vorsichtig auseinandergezogen werden.Unter Verwendung des Endes des Kapillarrohrs das Sperma gewinnen, indem man mit einer glatten Pinzette sanft die Seiten des Fisches abstreicht oder die Seiten des Fisches vorsichtig mit Zeigefinger und Daumen zusammendrückt, und das Sperma während des Austretens mittels sanfter Absaugung in einer Kapillare sammelt. Verunreinigungen durch möglicherweise zusammen mit dem Sperma ausgetretene Fäkalien vermeiden. Das Zielvolumen des Spermas beträgt 3,3 Mikroliter.Die minimale akzeptable Menge an Sperma variiert je nach Spermienqualität. Gutes Sperma ist weiß und undurchsichtig, während schlechtes Sperma wässrig aussieht. Im Allgemeinen beträgt die minimal akzeptable Menge ein Mikroliter guten Spermas oder ein Drittel des Ziels sowie zwei Mikroliter schlechten Spermas oder zwei Drittel des Ziels.Wenn das Spermienvolumen das Zielvolumen von 3,3 Mikrolitern nicht erreicht, ist es notwendig, das Volumen mit gefrierschutzmittelhaltigem Medium ohne Methanol bis zur Strichmarke zu normalisieren. Wenn das Spermienvolumen die Strichmarke an dem Kapillarrohr bereits erreicht oder überschreitet, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Geben Sie nun das Kryoprotektivmittel zum Sperma hinzu.Saugen Sie das Gefriermittel mit Methanol bis zur orangefarbenen Markierung auf. Das ungefähre Gesamtvolumen beträgt nun 20 Mikroliter. Geben Sie das Sperma und die Kryoprotektansmischung vorsichtig auf eine saubere Stelle eines Uhrglases ab, und mischen Sie sie durch etwa viermaliges Auf- und Abpipettieren sanft, wobei Sie vermeiden sollten, Blasen einzuführen.Geben Sie jeweils 10 Mikroliter der Spermien-Kryoprotektionslösung mit einer Pipette in den Boden von zwei beschrifteten Kryoröhrchen, um das Sperma aufzuteilen. Verschließen Sie die Röhrchen schnell und geben Sie jedes Kryoröhrchen in ein separates 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Verschließen Sie die Falcon-Röhrchen bei Raumtemperatur und stellen Sie sie in fein pulverisierte Trockeneis.Die Röhrchen sollten so tief eingeführt werden, dass nur noch die Verschlüsse sichtbar sind, um die Falcon-Röhrchen zu identifizieren. Nummerieren Sie sie und notieren Sie den Zeitpunkt, zu dem jedes Röhrchen in Trockeneis gegeben wird. Lassen Sie das Sperma 20 Minuten lang im Trockeneis einfrieren.Nachdem das Sperma eingefroren ist, überführen Sie die beiden Kryoröhrchen in einen Dewar-Flasche, die flüssigen Stickstoff enthält, für die vorübergehende Lagerung. Stellen Sie die Gefriertablette in ein Bad aus flüssigem Stickstoff, damit die Proben nicht erwärmen.Verwenden Sie lange Metallzangen, um die Vials aus dem Dewar-Gefäß zu entnehmen, und handhaben Sie sie mit Kryohandschuhen. Alternativ können Kryo-Vials direkt vom Trockeneis in den Gefrierschrank überführt werden. Wenn die Gefriermulde langfristig in flüssigem Stickstoff in einem Styroporbehälter aufbewahrt wird, stellen Sie die Kryo-Vials in einen kryogenen Flüssigstickstoffgefrierschrank.Um die Spermien-Vitalität aufrechtzuerhalten, ist es entscheidend, dass die Vials in flüssigem Stickstoff gelagert werden; Vials, die in der Dampfphase gelagert werden, können im Laufe der Zeit an Vitalität verlieren. Auch die Geschwindigkeit ist entscheidend für die Erhaltung der Spermien-Vitalität. Die Zeit zwischen dem Hinzufügen des Kryoprotektivums und dem Stellen der Spermien-Vials auf Trockeneis sollte nicht länger als 30 Sekunden betragen In-vitro-Fertilisation.Die Verwendung von kryokonserviertem Sperma funktioniert am besten mit zwei Personen. Eine Person presst die Eier aus den Weibchen, während die andere Person das Sperma auftaut. Stellen Sie ein Wasserbad auf 33 Grad Celsius ein.Entnehmen Sie eine Kryoröhre aus dem flüssigen Stickstoffgefrierschrank und überführen Sie sie in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff, bis sie zum Auftauen bereit ist. Drücken Sie die Eier aus anesthetisierten Weibchen in eine 35 Millimeter große Plastik-Petri-Schale. Dies wird detailliert im JoVE-Protokoll mit dem Titel „Erzeugung gynogenetisch vererbter Zebrafische durch frühen Druck“ beschrieben, das eine ausführliche Darstellung der Zebrafische bietet.Bei der In-vitro-Befruchtung enthält eine gute Gelegeportion mehr als 150 Eier, die einheitlich und gelblich sind. Weiße Rückstände deuten auf eine Degradation hin. Wenn möglich, sollten drei Gelegeportionen gewonnen und in einer Schale vereint werden.Wenn innerhalb einer Minute nach dem ersten Gelege nicht drei brauchbare Gelege erhalten werden, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Halten Sie die Schale bedeckt, während das Sperma aufgetaut wird. Entfernen Sie in der Zwischenzeit das Röhrchen aus dem flüssigen Stickstoff und nehmen Sie die Kappe ab.Tauchen Sie das Gefäß schnell zur Hälfte in ein Wasserbad von 33 Grad für acht bis zehn Sekunden. Geben Sie schnell 70 µL Hank’s Buffered Salt Solution bei Raumtemperatur zum Gefäß hinzu und mischen Sie durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren, anschließend sofort zu den Eiern in der Petrischale hinzufügen und vorsichtig mit der Pipettenspitze mischen. Aktivieren Sie dann unverzüglich Spermien und Eier, indem Sie 750 µL Fischwasser hinzufügen, leicht wirbeln, um zu mischen, und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Nach fünf Minuten die Schale mit Fischen auffüllen, mit Wasser versetzen und bei 28 Grad Celsius inkubieren. Nach zwei bis drei Stunden die lebensfähigen Embryonen zählen und in 100-Millimeter-Schalen mit jeweils 50 Embryonen überführen. Zählen Sie außerdem die befruchteten Eier, um die Fruchtbarkeit der Spermienprobe bestimmen zu können.Die Spermienfertilität ist das Verhältnis von lebensfähigen Embryonen zur Gesamtanzahl der für die In-vitro-Fertilisation verwendeten Eizellen. Die Eizellen können zwei bis sechs Stunden nach der In-vitro-Fertilisation sortiert werden. Wenn unfruchtbare Eizellen leicht von lebensfähigen Embryonen zu unterscheiden sind, erscheinen die unfruchtbaren Eizellen klar und ungefurcht.Bei Betrachtung mit Durchlicht an einem Stereomikroskop variiert die durchschnittliche Fruchtbarkeit kryokonservierter Spermien stark. Es sollte jedoch möglich sein, eine durchschnittliche Fruchtbarkeit von 25 % zu erzielen, die über mehrere Jahre stabil bleibt. Dieses Diagramm zeigt den durchschnittlichen Prozentsatz der Fruchtbarkeit von Spermien, die zwischen 2001 und 2003 eingefroren und noch bis 2008 getestet wurden.Wir haben soeben eine Hochdurchsatzmethode zur Kryokonservierung von Zebrafisch-Sperma demonstriert. Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es wichtig, sämtliche empfohlene Kunststoffartikel und Geräte zu verwenden sowie pulverisierten, zerkleinerten Trockeneis statt Trockeneis-Pellets einzusetzen. Es ist entscheidend, Sperma und Eizellen von sehr hoher Qualität zu verwenden. Bei den Eizellen ist es im Rahmen der In-vitro-Befruchtung, unmittelbar nach der Aktivierung des Spermas, wichtig, eine möglichst große Anzahl an Eizellen zu verwenden, um die Zahl der entstehenden befruchteten Embryonen zu erhöhen, was den Einsatz von drei bis vier Weibchen erfordern kann, richtig?Eine weitere Schlüsselkomponente des Protokolls ist die Geschwindigkeit. Es sollte niemals länger als etwa eine Minute dauern, von der Entnahme des Spermas aus dem Männchen bis zum Einbringen in Trockeneis. Nun, ich denke, das war's.Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Der Zebrafisch ist aufgrund seiner genetischen Ähnlichkeit mit höheren Wirbeltieren ein leistungsfähiges Modellsystem für die Entwicklungsbiologie und die Erforschung menschlicher Krankheiten. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung haploider Zebrafischembryonen, die für Forward-Screening-Strategien verwendet werden können, um rezessive Mutationen in Genen zu identifizieren, die für die frühe Embryogenese essentiell sind.

Die Produktion von Haploid Zebrafischembryonen durch<em&gt; In-vitro-</em&gt; Düngung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung einzelner Zellen aus Zebrafischembryonen, zur Anreicherung von Zellen von Interesse, zum Einfangen von Zebrafischzellen in mikrofluidisch basierten Einzelzell-Multiplexsystemen und zur Bewertung der Genexpression von einzelnen Zellen.

Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen

Ein modifiziertes Protokoll zur Ploidie Manipulation verwendet einen Hitzeschock eine Ein-Zyklus-Stall in cytokinesis im frühen Embryo zu induzieren. Dieses Protokoll wird in dem Zebrafisch gezeigt, sondern kann auf andere Arten anwendbar.

Ploidy Manipulation von Zebrafischembryonen mit Heat Shock 2 Behandlung

Das Hauptziel dieser Studie war die Nadel anpassen Verglasung (NIV) Verfahren um ganze Zebrafisch Hoden Ovarialgewebe eingetaucht. Darüber hinaus wurde die Reproduzierbarkeit der Methode in fünf verschiedenen Zebrafisch-Sorten getestet.

Kryokonservierung von Zebrafisch-Spermatogonien durch ganze Hoden Nadel eingetaucht, ultra-schnelle Abkühlung

Zilien Entwicklung ist wichtig, richtige Organogenese. Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zum Beschriften und ciliated Zellen der Zebrafisch zu visualisieren.

Visualisierung von Multiciliated Zellen in der Zebrabärbling durch ein kombiniertes Protokoll der ganze Berg Leuchtstofflampen In Situ Hybridisierung und Immunfluoreszenz

Zebrafisch wurden vor kurzem als in Vivo Modellsystem verwendet, um DNA-Replikation Timing während der Entwicklung zu studieren. Hier wird detailliert die Protokolle für die Verwendung von Zebrafisch-Embryonen Profil Replikation Timing. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um Replikation Timing in einzelnen Zelltypen, Mutanten, Krankheitsmodelle und andere Arten zu studieren.

DNA-Replikation Timing mit Zebrafisch als ein In Vivo Modell-System-Profiling

Dieses Protokoll demonstriert sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an Kryosektionen von Zebrafischembryonen im Frühstadium, die präzise Kolokalisierungsanalysen in bestimmten Zellpopulationen ermöglichen.

Sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an kryosektionierten Zebrafisch-Embryonen

Hier wird ein Protokoll zur Ganzmontage-IN-situ-RNA-Hybridisierungsanalyse in Zebrafischen und Rohrbildungs-Assay in patientenabgeleiteten induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Endothelzellen vorgestellt, um die Rolle von Endoglin bei der Gefäßbildung zu untersuchen.

Ganz-Mount-In-Situ-Hybridisierung in Zebrafisch-Embryonen und Tube-Formations-Assay in iPSC-ECs zur Untersuchung der Rolle von Endoglin in der Gefäßentwicklung

Hier stellen wir ein Protokoll zum fluoreszierenden Antikörper-vermittelten Nachweis von Proteinen in ganzen Präparaten von Zebrafischembryonen und Larven vor.

Ganzer Berg Immunhistochemie in Zebrafisch Embryonen und Larven

Dieses Protokoll beschreibt, wie Bilder durch die Kombination von In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie von Zebrafisch-Embryonalschnitten erhalten werden können. Vor der Kryosektion wurde eine In-situ-Hybridisierung durchgeführt, gefolgt von einer Antikörperfärbung. Es ist nützlich, die Expressionsmuster zweier Gene im Zebrafisch nachzuweisen, wenn ein Mangel an Antikörpern vorliegt.

In situ Hybridisierung kombiniert mit Immunhistochemie in kryogeschnittenen Zebrafischembryonen

Dieses Protokoll beschreibt eine kostengünstige Lichtmikroskopiemethode zur Beurteilung der Herzmorphologie und -funktion in Zebrafischembryonen, die eine reproduzierbare Bewertung der Entwicklungskardiotoxizität ermöglicht, ohne dass fortschrittliche Bildgebungssysteme erforderlich sind.

Funktionelle kardiale Bildgebung in Zebrafischembryonen mittels Standardmikroskopie und Videoanalyse: Anwendungen in der Umwelt- und biomedizinischen Forschung

Erfahren Sie eine Hochdurchsatz-Methode zur Kryokonservierung von Danio rerio-Sperma mit durchschnittlich 25% Fertilität bei In-vitro-Fertilisation. Dieses Protokoll ermöglicht die langfristige Lagerung über sieben Jahre.

Ein High-Throughput-Methode für Zebrabärblinge Sperma Kryokonservierung und In Vitro Fertilisation

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