Ein High-Throughput-Methode für Zebrabärblinge Sperma Kryokonservierung und In Vitro Fertilisation

Hallo, ich bin Bruce Draper von der University of California Davis, Abteilung für Molekulare und Zelluläre Biologie, und ich bin Cecilia Moans aus der Abteilung für Grundlagenforschung am Fred Hutchinson Cancer Research Center in Seattle. Heute werden Cecilia und ich die Protokoll zur Kryokonservierung von Zebrafisch-Sperma demonstrieren, eine Modifikation des ursprünglichen Brian-Harvey-Protokolls. Wir zeigen Ihnen, dass es in Teams zu zweit möglich ist, Sperma von 100 einzelnen Männchen innerhalb von weniger als zwei Stunden einzufrieren.

Obwohl die Fruchtbarkeit nach dem Auftauen stark variieren kann, erhalten wir im Durchschnitt eine Fruchtbarkeit von 25 %, und dies aus einer Bibliothek, die seit über sieben Jahren kryokonserviert wurde. Beginnen wir also. Bevor Sie dieses Verfahren durchführen, stellen Sie zunächst die Spermafrostmischungen her.

Die Ginsburg-Fish-Ringer-Lösung wird alle drei Tage frisch hergestellt, und das Einfriermedium wird täglich frisch mit und ohne Methanol hergestellt. Die Zusammensetzung dieser Lösungen ist in den Online-Ergänzungsinformationen zu diesem Protokoll enthalten. Die Materialien, die bei diesem Verfahren verwendet werden, können die Geschwindigkeit des Einfrierens und Auftauens beeinflussen, was wiederum die Fruchtbarkeit des eingefrorenen Spermas beeinträchtigen kann.

Aus diesem Grund wird eine Liste empfohlener Materialien auch als ergänzende Online-Information bereitgestellt. Es ist am besten, die Spermien auf fein zerstoßenem Trockeneis einzufrieren, anstatt auf Trockeneis-Perlen. Eine einfache Möglichkeit, Trockeneis zu zerkleinern, besteht darin, es in ein Handtuch zu wickeln und mit einem Hammer zu pulverisieren.

Eine effizientere Methode besteht darin, einen Trockeneismühle wie eine Claws- und Modell-RE-2-Mühle zu verwenden, um Zebrafischsperma einzufrieren. Markieren Sie zunächst Kapillarrohre mit 10 µL Fassungsvermögen mit einem Laborstift auf der Höhe von 3,33 µL oder etwa 16,7 mm vom Boden aus, um die Männchen zu betäuben. Platzieren Sie zwei bis vier Männchen in einem Becher, der mit verdünntem Trica und Fischwasser gefüllt ist. Das Rezept finden Sie im Zebrafisch-Buch.

Nach der Betäubung den Fisch mit einem Plastiklöffel aus der Anästhetika-Lösung heben und vorsichtig mit einem Papiertuch trocken tupfen. Besondere Aufmerksamkeit sollte der Ventralseite gewidmet werden. Wasser aktiviert das Sperma, daher ist es entscheidend, die Umgebung des Ika gründlich zu trocknen.

Platzieren Sie den Fisch mit der Bauchseite nach oben auf dem Schwammhalter. Wenn der Bereich um die Bauchflossen noch feucht ist, trocknen Sie ihn vorsichtig mit einem Kim-Tuch ab. Setzen Sie das markierte Kapillarrohr in einen Gummimundpipettenadapter, der den Kapillarrohren beiliegt.

Der Adapter ist ein Gummischlauch mit einem Mundstück an einem Ende und einem Kapillarhalter am anderen Ende. Alternativ kann die Kapillare an eine 50-Mikroliter-Hamilton-Spritze angeschlossen werden. Mit einem kurzen Stück Tigon-Schlauch passenden Durchmessers wird das Männchen unter dem Mikroskop platziert und die urogenitale Öffnung freigelegt, indem die Beckenflossen vorsichtig auseinandergezogen werden.

Unter Verwendung des Endes des Kapillarrohrs das Sperma gewinnen, indem man mit einer glatten Pinzette sanft die Seiten des Fisches abstreicht oder die Seiten des Fisches vorsichtig mit Zeigefinger und Daumen zusammendrückt, und das Sperma während des Austretens mittels sanfter Absaugung in einer Kapillare sammelt. Verunreinigungen durch möglicherweise zusammen mit dem Sperma ausgetretene Fäkalien vermeiden. Das Zielvolumen des Spermas beträgt 3,3 Mikroliter.

Die minimale akzeptable Menge an Sperma variiert je nach Spermienqualität. Gutes Sperma ist weiß und undurchsichtig, während schlechtes Sperma wässrig aussieht. Im Allgemeinen beträgt die minimal akzeptable Menge ein Mikroliter guten Spermas oder ein Drittel des Ziels sowie zwei Mikroliter schlechten Spermas oder zwei Drittel des Ziels.

Wenn das Spermienvolumen das Zielvolumen von 3,3 Mikrolitern nicht erreicht, ist es notwendig, das Volumen mit gefrierschutzmittelhaltigem Medium ohne Methanol bis zur Strichmarke zu normalisieren. Wenn das Spermienvolumen die Strichmarke an dem Kapillarrohr bereits erreicht oder überschreitet, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Geben Sie nun das Kryoprotektivmittel zum Sperma hinzu.

Saugen Sie das Gefriermittel mit Methanol bis zur orangefarbenen Markierung auf. Das ungefähre Gesamtvolumen beträgt nun 20 Mikroliter. Geben Sie das Sperma und die Kryoprotektansmischung vorsichtig auf eine saubere Stelle eines Uhrglases ab, und mischen Sie sie durch etwa viermaliges Auf- und Abpipettieren sanft, wobei Sie vermeiden sollten, Blasen einzuführen.

Geben Sie jeweils 10 Mikroliter der Spermien-Kryoprotektionslösung mit einer Pipette in den Boden von zwei beschrifteten Kryoröhrchen, um das Sperma aufzuteilen. Verschließen Sie die Röhrchen schnell und geben Sie jedes Kryoröhrchen in ein separates 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Verschließen Sie die Falcon-Röhrchen bei Raumtemperatur und stellen Sie sie in fein pulverisierte Trockeneis.

Die Röhrchen sollten so tief eingeführt werden, dass nur noch die Verschlüsse sichtbar sind, um die Falcon-Röhrchen zu identifizieren. Nummerieren Sie sie und notieren Sie den Zeitpunkt, zu dem jedes Röhrchen in Trockeneis gegeben wird. Lassen Sie das Sperma 20 Minuten lang im Trockeneis einfrieren.

Nachdem das Sperma eingefroren ist, überführen Sie die beiden Kryoröhrchen in einen Dewar-Flasche, die flüssigen Stickstoff enthält, für die vorübergehende Lagerung. Stellen Sie die Gefriertablette in ein Bad aus flüssigem Stickstoff, damit die Proben nicht erwärmen.

Verwenden Sie lange Metallzangen, um die Vials aus dem Dewar-Gefäß zu entnehmen, und handhaben Sie sie mit Kryohandschuhen. Alternativ können Kryo-Vials direkt vom Trockeneis in den Gefrierschrank überführt werden. Wenn die Gefriermulde langfristig in flüssigem Stickstoff in einem Styroporbehälter aufbewahrt wird, stellen Sie die Kryo-Vials in einen kryogenen Flüssigstickstoffgefrierschrank.

Um die Spermien-Vitalität aufrechtzuerhalten, ist es entscheidend, dass die Vials in flüssigem Stickstoff gelagert werden; Vials, die in der Dampfphase gelagert werden, können im Laufe der Zeit an Vitalität verlieren. Auch die Geschwindigkeit ist entscheidend für die Erhaltung der Spermien-Vitalität. Die Zeit zwischen dem Hinzufügen des Kryoprotektivums und dem Stellen der Spermien-Vials auf Trockeneis sollte nicht länger als 30 Sekunden betragen In-vitro-Fertilisation.

Die Verwendung von kryokonserviertem Sperma funktioniert am besten mit zwei Personen. Eine Person presst die Eier aus den Weibchen, während die andere Person das Sperma auftaut. Stellen Sie ein Wasserbad auf 33 Grad Celsius ein.

Entnehmen Sie eine Kryoröhre aus dem flüssigen Stickstoffgefrierschrank und überführen Sie sie in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff, bis sie zum Auftauen bereit ist. Drücken Sie die Eier aus anesthetisierten Weibchen in eine 35 Millimeter große Plastik-Petri-Schale. Dies wird detailliert im JoVE-Protokoll mit dem Titel „Erzeugung gynogenetisch vererbter Zebrafische durch frühen Druck“ beschrieben, das eine ausführliche Darstellung der Zebrafische bietet.

Bei der In-vitro-Befruchtung enthält eine gute Gelegeportion mehr als 150 Eier, die einheitlich und gelblich sind. Weiße Rückstände deuten auf eine Degradation hin. Wenn möglich, sollten drei Gelegeportionen gewonnen und in einer Schale vereint werden.

Wenn innerhalb einer Minute nach dem ersten Gelege nicht drei brauchbare Gelege erhalten werden, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Halten Sie die Schale bedeckt, während das Sperma aufgetaut wird. Entfernen Sie in der Zwischenzeit das Röhrchen aus dem flüssigen Stickstoff und nehmen Sie die Kappe ab.

Tauchen Sie das Gefäß schnell zur Hälfte in ein Wasserbad von 33 Grad für acht bis zehn Sekunden. Geben Sie schnell 70 µL Hank’s Buffered Salt Solution bei Raumtemperatur zum Gefäß hinzu und mischen Sie durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren, anschließend sofort zu den Eiern in der Petrischale hinzufügen und vorsichtig mit der Pipettenspitze mischen. Aktivieren Sie dann unverzüglich Spermien und Eier, indem Sie 750 µL Fischwasser hinzufügen, leicht wirbeln, um zu mischen, und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Nach fünf Minuten die Schale mit Fischen auffüllen, mit Wasser versetzen und bei 28 Grad Celsius inkubieren. Nach zwei bis drei Stunden die lebensfähigen Embryonen zählen und in 100-Millimeter-Schalen mit jeweils 50 Embryonen überführen. Zählen Sie außerdem die befruchteten Eier, um die Fruchtbarkeit der Spermienprobe bestimmen zu können.

Die Spermienfertilität ist das Verhältnis von lebensfähigen Embryonen zur Gesamtanzahl der für die In-vitro-Fertilisation verwendeten Eizellen. Die Eizellen können zwei bis sechs Stunden nach der In-vitro-Fertilisation sortiert werden. Wenn unfruchtbare Eizellen leicht von lebensfähigen Embryonen zu unterscheiden sind, erscheinen die unfruchtbaren Eizellen klar und ungefurcht.

Bei Betrachtung mit Durchlicht an einem Stereomikroskop variiert die durchschnittliche Fruchtbarkeit kryokonservierter Spermien stark. Es sollte jedoch möglich sein, eine durchschnittliche Fruchtbarkeit von 25 % zu erzielen, die über mehrere Jahre stabil bleibt. Dieses Diagramm zeigt den durchschnittlichen Prozentsatz der Fruchtbarkeit von Spermien, die zwischen 2001 und 2003 eingefroren und noch bis 2008 getestet wurden.

Wir haben soeben eine Hochdurchsatzmethode zur Kryokonservierung von Zebrafisch-Sperma demonstriert. Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es wichtig, sämtliche empfohlene Kunststoffartikel und Geräte zu verwenden sowie pulverisierten, zerkleinerten Trockeneis statt Trockeneis-Pellets einzusetzen. Es ist entscheidend, Sperma und Eizellen von sehr hoher Qualität zu verwenden. Bei den Eizellen ist es im Rahmen der In-vitro-Befruchtung, unmittelbar nach der Aktivierung des Spermas, wichtig, eine möglichst große Anzahl an Eizellen zu verwenden, um die Zahl der entstehenden befruchteten Embryonen zu erhöhen, was den Einsatz von drei bis vier Weibchen erfordern kann, richtig?

Eine weitere Schlüsselkomponente des Protokolls ist die Geschwindigkeit. Es sollte niemals länger als etwa eine Minute dauern, von der Entnahme des Spermas aus dem Männchen bis zum Einbringen in Trockeneis. Nun, ich denke, das war's.

Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.