Ein High-Throughput-Methode für Zebrabärblinge Sperma Kryokonservierung und In Vitro Fertilisation

Hallo, ich bin Bruce Draper von der University of California Davis, Abteilung für Molekular- und Zellbiologie, und ich bin Cecilia Moans von der Abteilung für Grundlagenforschung am Fred Hutchinson Cancer Research Center in Seattle. Heute werden Cecilia und ich das Protokoll zur Konservierung von Zebrafisch-Spermien demonstrieren, das eine Modifikation des ursprünglichen Brian Harvey-Protokolls ist. Wir zeigen Ihnen, dass es in Zweierteams möglich ist, die Spermien von 100 einzelnen Männchen in weniger als zwei Stunden zu kryokonservieren.

Während es beim Auftauen eine große Bandbreite an Fruchtbarkeit gibt, erhalten wir im Durchschnitt eine Fruchtbarkeit von 25 %, und dies stammt aus einer Bibliothek, die seit über sieben Jahren kryokonserviert wurde. Also lasst uns loslegen. Bevor Sie diesen Vorgang durchführen, stellen Sie zunächst die Lösungen zum Einfrieren der Spermien her.

Die Ginsburg Fish Ringer-Lösung wird alle drei Tage frisch gemacht, und das Gefriermedium wird täglich mit und ohne Methanol frisch gemacht. Die Zusammensetzung dieser Lösungen finden Sie in den ergänzenden Online-Informationen, die diesem Protokoll beiliegen. Die bei diesem Verfahren verwendeten Materialien können die Geschwindigkeit des Einfrierens und Auftauens beeinflussen, was wiederum die Fruchtbarkeit von gefrorenen Spermien beeinträchtigen kann.

Aus diesem Grund wird auch eine Liste mit empfohlenen Materialien als ergänzende Online-Information zur Verfügung gestellt. Es ist am besten, das Sperma auf fein zerkleinertem Trockeneis einzufrieren, im Gegensatz zu Trockeneispellets. Eine einfache Möglichkeit, Trockeneis zu zerkleinern, besteht darin, es in ein Handtuch zu wickeln und mit einem Hammer zu pulverisieren.

Eine effizientere Methode ist die Verwendung einer Trockeneismühle wie einer Kralle und Modell RE two, um Zebrafischspermien einzufrieren. Markieren Sie zuerst 10 Mikroliter Kapillarröhrchen mit einem Laborstift in einer Höhe von 3,33 Mikrolitern oder etwa 16,7 Millimetern vom Boden, um die Männchen zu betäuben, und legen Sie zwei bis vier Männchen in ein Becherglas, das verdünntes Trica- und Fischwasser enthält. Das Rezept findet ihr im Zebrafisch-Buch.

Heben Sie die Fische nach der Betäubung mit einem Plastiklöffel aus der Betäubung und tupfen Sie sie vorsichtig auf einem Papiertuch trocken. Achten Sie besonders darauf, die ventrale Seite zu zeichnen. Wasser aktiviert die Spermien, daher ist es wichtig, die Umgebung der Ika gründlich zu trocknen.

Positionieren Sie den Fisch mit der Bauchseite nach oben auf dem Schwammhalter. Wenn die Region um die Bauchflossen noch feucht ist, trocknen Sie sie vorsichtig mit einem Kim-Tuch ab. Setzen Sie das markierte Kapillarrohr in einen Gummimundpipettenadapter ein, der im Lieferumfang der Kapillarröhrchen enthalten ist.

Der Adapter ist ein Gummischlauch, der an einem Ende ein Mundstück und am anderen Ende einen Kapillarhalter hat. Alternativ kann das Kapillarrohr an eine 50-Mikroliter-Hamilton-Spritze angeschlossen werden. Setzen Sie das Männchen mit einem kurzen Stück Tigonschlauch mit dem entsprechenden Durchmesser unter das Zielfernrohr und legen Sie die Urogenitalöffnung frei, indem Sie die Beckenflossen vorsichtig auseinander spreizen.

Drücken Sie das Sperma mit dem Ende des Kapillarrohrs aus, indem Sie die Seiten des Fisches sanft mit einer glatten Pinzette streicheln oder indem Sie die Seiten des Fisches mit Zeigefinger und Daumen sanft zusammendrücken, und sammeln Sie das Sperma in einem Kapillarröhrchen, während es durch sanftes Saugen ausgestoßen wird. Vermeiden Sie Kot, der mit dem Sperma ausgeschieden werden kann. Das Zielvolumen der Spermien beträgt 3,3 Mikroliter.

Die Mindestmenge an Spermien, die akzeptabel ist, hängt von der Qualität der Spermien ab. Gutes Sperma ist weiß und undurchsichtig, während poröses Sperma wässrig aussieht. Im Allgemeinen beträgt die minimal akzeptable Menge an Spermien einen Mikroliter gutes Sperma oder ein Drittel des Ziels und zwei Mikroliter poröses Sperma oder zwei Drittel des Ziels.

Wenn das Spermienvolumen das Zielvolumen von 3,3 Mikrolitern nicht erreicht, ist es notwendig, das Volumen mit Gefriermedium ohne Methanol auf die Stiftmarkierung zu normalisieren. Wenn das Spermienvolumen bereits die Stiftmarkierung auf dem Kapillarrohr erreicht oder überschreitet, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Gib nun das Kryoprotektivum zu den Spermien.

Gefriermedium mit Methanol bis zur orangefarbenen Markierung aufsaugen. Das ungefähre Gesamtvolumen beträgt nun 20 Mikroliter. Stoßen Sie das Samen-Kryoprotektivum-Gemisch auf eine saubere Stelle eines Uhrenglases aus, mischen Sie es sanft, indem Sie es etwa viermal auf und ab pipettieren und vermeiden Sie das Einbringen von Blasen.

Aliquotieren Sie das Sperma in zwei Kryofläschchen, indem Sie 10 Mikroliter der Kryoprotektivlösung der Spermien in den Boden jedes beschrifteten Fläschchens pipettieren. Verschließen Sie die Fläschchen schnell und lassen Sie jedes Kryofläschchen in ein separates 15-Milliliter-Falkenröhrchen fallen. Bei Raumtemperatur die Falkenröhrchen verschließen und in fein pulverisiertes Trockeneis legen.

Die Röhrchen sollten tief genug eingeführt werden, damit nur die Kappen sichtbar sind, um den Überblick über die Falkenröhrchen zu behalten. Nummerieren Sie sie und notieren Sie die Zeit, die jedes Rohr in das Trockeneis kommt. Lass das Sperma 20 Minuten im Trockeneis gefrieren.

Nachdem das Sperma eingefroren ist, geben Sie die beiden Kryo-Fläschchen in einen mit flüssigem Stickstoff haltigen Doer-Kolben. Zur vorübergehenden Lagerung. Stellen Sie die Gefrierbox in ein Bad mit flüssigem Stickstoff, damit sich die Proben nicht erhitzen.

Verwenden Sie eine lange Metallzange, um die Fläschchen aus dem Macherkolben zu holen, und fassen Sie sie mit Kryohandschuhen an. Alternativ können Kryo-Fläschchen direkt aus dem Trockeneis in den Gefrierschrank umgefüllt werden. Wenn die Gefrierbox zur Langzeitlagerung in einem Styroporbehälter in flüssigem Stickstoff getaucht aufbewahrt wird, stellen Sie die Kryo-Fläschchen in einen kryogenen Flüssigstickstoff-Gefrierschrank.

Um die Lebensfähigkeit der Spermien zu erhalten, ist es entscheidend, dass die Fläschchen in Flüssigstickstofffläschchen gelagert werden, die in der Dampfphase gelagert werden und mit der Zeit an Lebensfähigkeit verlieren können. Geschwindigkeit ist auch entscheidend für die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Spermien. Die Zeit zwischen der Zugabe des Kryoprotektivums und dem Aufstellen der Spermienfläschchen auf Trockeneis sollte nicht mehr als 30 Sekunden In-vitro-Fertilisation betragen.

Die Verwendung von kryokonserviertem Sperma funktioniert am besten mit zwei Personen. Eine Person drückt die Eier aus den Weibchen, während die andere Person das Sperma auftaut. Stellen Sie ein Wasserbad auf 33 Grad Celsius ein.

Nehmen Sie ein Kryo-Fläschchen aus dem Flüssigstickstoff-Gefrierschrank und geben Sie es in einen D-haltigen Flüssigstickstoff oder einen Kolben, bis es zum Auftauen bereit ist. Drücke Eier von betäubten Weibchen in eine 35 Millimeter große Petrischale aus Plastik. Dies wird ausführlich im JoVE-Protokoll mit dem Titel Making Gyno Genetic deployed zebrafish by early pressure beschrieben, das eine detaillierte Beschreibung des Zebrafisches enthält.

Bei der In-vitro-Fertilisation enthält ein gutes Gelege mehr als 150 Eier, die gleichmäßig und gelblich sind. Jeder weiße Schmutz ist ein Hinweis auf eine Zersetzung. Wenn möglich, versuchen Sie, drei Gelege mit Eiern zu erhalten und in einem Gericht zu kombinieren.

Wenn innerhalb einer Minute nach der ersten Kupplung nicht drei gute Kupplungen erhalten werden, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Halte die Schale abgedeckt, während das Sperma aufgetaut ist. Entfernen Sie in der Zwischenzeit das Fläschchen aus dem flüssigen Stickstoff und entfernen Sie die Kappe.

Tauchen Sie das Fläschchen schnell acht bis 10 Sekunden lang zur Hälfte in ein 33 Grad heißes Wasserbad. Geben Sie schnell 70 Mikroliter bei Raumtemperatur und Hanks gepufferte Salzlösung in das Fläschchen und mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren, geben Sie es sofort zu den Eiern in der Petrischale und mischen Sie es vorsichtig mit der Pipettenspitze. Aktivieren Sie dann sofort das Sperma und die Eier, indem Sie 750 Mikroliter Fischwasser hinzufügen, um es zu mischen und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zu inkubieren.

Nach fünf Minuten die Schüssel mit Fisch und Wasser füllen und bei 28 Grad Celsius inkubieren. Nach zwei bis drei Stunden werden lebensfähige Embryonen gezählt und in 100-Millimeter-Schalen mit 50 Embryonen pro Schale übertragen. Rechnen Sie auch mit befruchteten Eizellen, damit die Fruchtbarkeit der Samenprobe bestimmt werden kann.

Die Spermienfruchtbarkeit ist das Verhältnis der lebensfähigen Embryonen zur Gesamtzahl der Eizellen, die für die In-vitro-Fertilisation verwendet wurden. Die Eizellen können jederzeit zwei bis sechs Stunden nach der In-vitro-Fertilisation sortiert werden. Wenn unfruchtbare Eizellen leicht von lebensfähigen Embryonen unterschieden werden können, sind unfruchtbare Eizellen klar und ungeteilt.

Bei der Betrachtung mit Trans-Beleuchtung auf einem Stereomikroskop variiert die durchschnittliche Fruchtbarkeit von kryokonservierten Spermien stark. Es sollte jedoch möglich sein, eine durchschnittliche Fruchtbarkeit von 25 % zu erreichen, die über mehrere Jahre stabil ist. Diese Grafik zeigt die durchschnittliche prozentuale Fruchtbarkeit von Spermien, die zwischen 2001 und 2003 eingefroren wurden und erst 2008 angenommen wurden.

Wir haben gerade eine Hochdurchsatzmethode demonstriert, mit der kein Fischsperma mehr übrig bleibt. Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es wichtig, alle empfohlenen Kunststoffteile und -geräte zu verwenden und pulverisiertes zerstoßenes Trockeneis anstelle von Trockeneispellets zu verwenden. Es ist wichtig, wirklich hochwertige Spermien und Eizellen zu verwenden, und im Falle der Eizellen bei der In-vitro-Fertilisation ist es wichtig, beim Schälen der Spermien eine so große Anzahl von Eizellen wie möglich zu verwenden, um die Anzahl der fruchtbaren Embryonen zu verbessern, die Sie am anderen Ende erhalten, was drei bis vier Frauen dauern kann. Rechts?

Eine weitere Schlüsselkomponente des Protokolls ist die Geschwindigkeit. Es sollte nie länger als etwa eine Minute dauern, um vom Ausdrücken des Spermas des Männchens bis zum Einlegen in das Trockeneis zu gelangen. Nun, ich denke, das war's.

Viel Glück bei Ihren Experimenten.