Machen Gynogenetic Diploid Zebrafisch von Anfang Druck

Hallo, ich bin Charlene Walker aus dem Labor von Charles Kimmel an der University of Oregon, Institut für Neurowissenschaften. Und ich bin Gregory Walsh. Ich arbeite im Labor von Cecilia Moens in der Abteilung für Grundlagenforschung am Fred Hutchinson Cancer Research Center.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Erzeugung von zweifach diploiden Zebrafischen mittels der Frühdruckmethode. Diese Methode verwendet hydrostatischen Druck, um Mikrotubuli in einem Ei zu depolymerisieren, das mit UV-bestrahlten Spermien befruchtet wurde. Wird mit dem richtigen Zeitpunkt durchgeführt.

Dies verhindert die Ausstoßung des zweiten Polkörperchens und erzeugt so einen diploiden Embryo, dessen homologe Chromosomen die beiden Produkte der Meiose Eins sind. Diese Technik wurde Anfang der 1970er Jahre entwickelt, als ich im Labor von George Reisinger an der University of Oregon arbeitete. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren bei zwei genetischen Bildschirmen in der vierten Generation.

Die Gameten von F1-Mutagenfischen können direkt auf rezessive Mutationen untersucht werden, die Entwicklungsphänotypen bei homozygoten, gynogenetischen diploiden Nachkommen verursachen. Da Zebrafische eine hohe genetische Interferenz aufweisen, nutzen wir diese Methode auch, um Mutationen auf Chromosomen zu kartieren und abzuschätzen, wie weit diese Mutationen vom Zentromer entfernt liegen. Beginnen wir also: Am späten Nachmittag des Tages vor dem Experiment bereiten Sie die Spermagewinnung vor, indem Sie die zu entleerenden Männchen und Weibchen trennen. Ältere Männchen können verwendet werden, da sie kein genetisches Material beisteuern werden.

Weibchen sollten im Bauchbereich groß und fett erscheinen, während Männchen gelb und agil aussehen sollten. Bewahren Sie die Männchen und Weibchen über Nacht in getrennten Aufbewahrungstanks auf, auf die am Morgen leicht zugegriffen werden kann. Bereiten Sie am Morgen des Experiments Hank’s Lösung vor und geben Sie Natriumbicarbonat hinzu.

Bringen Sie es in einem Eiskübel zur Fischanlage. Die Hank's-Lösung trica einen Timer und Röhrchen zum Sammeln von Sperma. Verdünnen Sie die trica schließlich in der Fischanlage in Fischwasser.

Dies wird verwendet, um die Fische im nächsten Schritt zu betäuben. Um die Sammelung von Sperma zu beginnen, bereiten Sie ein klares Gefäß mit Hank-Lösung auf Eis vor. Kühl genug für Hank für etwa 50 Mikroliter pro männliches Tier, das ausgepresst werden soll; betäuben Sie ein oder zwei männliche Tiere gleichzeitig.

Mit einer Plastikspachtel können sie durch Eintauchen und Vorsicht aus der Anästhesie entnommen werden. Spülen Sie die Männchen und das Fischwasser ab und tupfen Sie sie auf einem Papiertuch leicht trocken. Dies ist sehr kritisch, da Wasser das Sperma aktiviert.

Wenn sie trocken sind, montieren Sie die Fische in einer Schaumhalterung unter einem Stereomikroskop bei niedriger Vergrößerung mit Epibe­leuchtung. Trennen Sie die Bauchflossen mit einer Pinzette und positionieren Sie eine Mikrokapi­lle am Eingang der Kloake, um mit der Sammlung von Sperma zu beginnen. Streichen Sie vorsichtig, aber fest mit einer glatten Millipore-Pinzette die Seiten des Fisches entlang, während das milchige Sperma aus der Genitalöffnung austritt; sammeln Sie es in der Mikokapillare durch sanfte Absaugung und ziehen Sie das Sperma mehrerer Männchen auf Eis.

Kalte Hank-Salzlösung: Spermien von fünf bis 10 Männchen reichen aus, um Eizellen von 20 bis 30 Weibchen zu befruchten. Spermien, die in kalter Hank-Lösung aufbewahrt werden, können mehrere Stunden lang Eizellen effizient befruchten.

Sammeln Sie genügend Spermien, um eine trübe Suspension zur UV-Inaktivierung der Spermien herzustellen. Füllen Sie zunächst den Boden einer Glas-Petrischale mit Eis. Legen Sie eine Uhrglasplatte auf das Eis in der Schale.

Als Nächstes verwenden Sie die Pipette, um die Spermien vom Reagenzglas auf das Uhrglas zu übertragen. Achten Sie darauf, möglichst alle Spermien in die Pipette aufzunehmen, ohne Luftblasen aufzusaugen. Es ist entscheidend, dass keine Blasen in den Spermien entstehen; geben Sie die Spermien in einer dünnen, gleichmäßigen Schicht auf das Uhrglas ab und entsorgen Sie die Pipette.

Nach der Übertragung des Spermas stellen Sie die Petrischale in einen UV-Vernetzer. Schalten Sie den Vernetzer ein, der eine Energie von 900 JUULs liefert. Nach der Vernetzung verwenden Sie eine saubere Pipette, um das Sperma vom Objektträger zu entfernen, und überführen es in ein Fendor-Gefäß, das mit „UV-Sperma“ gekennzeichnet ist, und stellen es auf Eis.

Um die Eiersammlung zu beginnen, betäuben Sie zunächst jeweils zwei Weibchen gleichzeitig. In Trica ist es entscheidend, die Fische nicht zu lange in Trica zu belassen, da eine verlängerte Narkose die Fische töten kann. Anschließend spülen Sie die Fische mit Fischwasser ab und tupfen sie mit einem Papiertuch leicht trocken.

Dies ist entscheidend, da überschüssiges Wasser die Eier aufquellen lässt und die Befruchtung verhindert. Legen Sie das Weibchen in eine 35 Millimeter große Kunststoff-Petrischale und berühren Sie es mit feuchten, aber nicht nassen Fingern. Drücken Sie vorsichtig, aber fest auf den Bauch.

Wenn sie bereit ist, Eier abzulegen, kommen diese leicht heraus; sammeln Sie die Eier mit einem Spatel ein und geben Sie das Weibchen zurück ins Wasser. Gute Eier haben eine gelbliche, durchscheinende Farbe, während Eier, die zu lange im Weibchen verblieben sind, weiß und wässrig erscheinen. Um sicherzustellen, dass Sie qualitativ hochwertige Eier erhalten, sammeln Sie sie innerhalb der ersten zwei Stunden nach dem Einschalten des Lichts in der Fischanlage, und halten Sie die Eier bedeckt, um Austrocknung zu verhindern.

Nach dem Sammeln der Eier 30 bis 50 Mikroliter der UV-spermiensuspension zu den Eiern geben und vorsichtig mit einer Pipettenspitze umrühren. Unmittelbar etwa ein Milliliter Fischwasser hinzufügen und den Timer starten. Eier, die ab diesem Zeitpunkt sich entwickeln lassen, werden haploid sein.

Die folgenden Schritte müssen innerhalb von 90 Sekunden nach der Befruchtung abgeschlossen werden. Starten Sie die Zeiterfassung in dem Moment, in dem die Eier durch Zugabe von Wasser aktiviert werden.

Der genaue Zeitpunkt der Metaphase der Meiose I ist temperaturabhängig. Die Dauer des Andrückens und des Loslassens ist für 28,5 Grad Celsius optimiert. Nachdem der Timer gestartet wurde, warten Sie einen Moment, fügen Sie dann mehr Wasser hinzu und schwemmen Sie die Eier in die Mitte der Schale.

Unter Verwendung einer abgeschnittenen und polierten Pasteurpipette. Überführen Sie die befruchteten Eier gegebenenfalls in Druckgefäße, fügen Sie mehr Ei-Wasser in das Gefäß hinzu, sodass es fast überläuft, und lassen Sie einen Wassertropfen am Rand des Gefäßes zurück. Bringen Sie anschließend einen Gummistopfen über den Wassertropfen an und befestigen Sie den Kunststoffdeckel über dem Gummistopfen.

Stellen Sie die Gefäße umgedreht in den Druckzylinder und fügen Sie mehr Ei-Wasser hinzu. Um den Zylinder nachzufüllen, setzen Sie den Deckel sicher auf den Zylinder. Sobald er geschlossen ist, stellen Sie den Zylinder mit dem Kolben nach oben in die Presse und bringen Sie einen Druck von 8.000 Pfund pro Quadratzoll auf.

Lassen Sie den Zylinder in der Presse, bis sechs Minuten nach der Aktivierungszeit vergangen sind, was einer Gesamtdruckzeit von 4,5 Minuten entspricht. Entfernen Sie den Zylinder sechs Minuten nach der Aktivierung aus der Presse. Nehmen Sie die Vials aus dem Zylinder und trocknen Sie sie vorsichtig ab, um eine Abkühlung der Embryonen zu verhindern.

Setzen Sie den Zylinder zurück und füllen Sie ihn erneut mit Ei-Wasser. Bereiten Sie die nächsten Vials vor, indem Sie diese bei Bedarf teilweise mit Ei-Wasser füllen. Wiederholen Sie diese Schritte für alle Chargen der Eier.

Der Zylinder fasst jeweils bis zu zwei Vials, daher kann es sinnvoll sein, die Befruchtung der Eier um eine bis zwei Minuten zu verzögern, um zu überprüfen, ob weitere Weibchen, die sich bereits in der Trica befinden, ebenfalls Eier abgeben. Dies beschleunigt den Vorgang, da mehrere Chargen gleichzeitig behandelt werden können. Außerdem können die Eier, wenn die Fische während der Anwendung der Presse ausgepresst werden, zu trocken werden und bis zum erneuten Einsatz der Presse – 24 Stunden nach der Befruchtung – nicht mehr lebensfähig sein. Ein haploider Zebrafisch-Embryo weist 24 Stunden nach der Befruchtung einen kurzen, gedrungenen Körper, einen kurzen Schwanz und ein weniger deutlich ausgebildetes Gehirn auf.

Trotzdem weisen sie alle dieselben Körperteile auf, wie Somiten, Neuralrohr, Augen und Ohren. Da Diploide, Haploide und Diploide alle ungehinderte Beugungsbewegungen etwa 24 Stunden nach der Befruchtung zeigen, weisen EP-Diploid-Geschwister lange Schwänze, gut geformte Gehirne auf und sollten etwa zu 60 bis 70 % lebensfähig sein.

Sie sehen den unbehandelten eingesetzten Kontrollen sehr ähnlich. Normalerweise enthält eine Charge von haplo-Embryonen eine Mischung aus gut aussehenden Embryonen, toten Embryonen und allen dazwischenliegenden Zuständen. Das Verhältnis von gut aussehenden zu defekten Embryonen spiegelt die schädlichen Gene wider, die im weiblichen Genom enthalten sind.

Mutationen sind selbst bei diesem Hintergrund relativ leicht zu identifizieren, da mehrere Individuen – bis zu 50 % – das gleiche charakteristische Phänotyp aufweisen werden. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die durch dieses Verfahren erzeugten Embryonen echte tic-OIDs sind, da als Kontrollen ein Gelege normal entwickelter Eier erzeugt wird, indem etwas Sperma ohne UV-Inaktivierung beiseitegestellt wird, sowie ein Gelege haploider Embryonen, indem ein Gelege Eier beiseitegestellt wird, die mit UV-behandeltem Sperma befruchtet wurden, ohne den EP-Prozess durchzulaufen; haploide Embryonen sind nach zwei bis drei Tagen nicht mehr lebensfähig. Die mittels EP entwickelten Embryonen sollten wie normale Diploide aussehen.

Obwohl einige unregelmäßige EP-Monster auftreten können, sollten Gelege von EP-Diploiden zu etwa 70 bis 90 % lebensfähig sein. Das Vorhandensein von Haploiden im eingesetzten EP-Gelege deutet auf einen Fehler im EP-Prozess hin, beispielsweise darauf, dass die Presse den Druck nicht gehalten hat. Das Vorhandensein von Diploiden im Haplo-Gelege weist auf eine unvollständige Spermieninaktivierung hin, zum Beispiel auf einen Fehler im Vernetzer.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie einfach es ist, die In-vitro-Fertilisation bei Zebrafischen durchzuführen, und wie man durch Hemmung der zweiten meiotischen Teilung genetisch bedingte diploide Zebrafischembryonen vom Gynogenese-Typ erzeugt. Bei dieser Methode ist es wichtig, daran zu denken, dass der Zeitpunkt des frühen Drucks genau eingehalten werden muss und dass die Presse während der gesamten Behandlung einen konstanten Druck von 8.000 pounds per square inch aufrechterhält. Stellen Sie sicher, dass Ihre Presse kalibriert ist.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.