Name: Visualisierung des schlagenden Herzens in Drosophila /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-28T21:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Lernen Sie die Visualisierung des schlagenden Herzens bei Drosophila für Entwicklungsbiologie und Herzphysiologie. Diese Methode ermöglicht Forschern die Untersuchung der Herzfrequenz bei Larven und adulten Fliegen.

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KO wird durch einen Zuschuss von der American Heart Association unterstützt.

Bevor Sie beginnen Adult Herzen <ol><li> Frisch vorzubereiten künstliche Hämolymphe (AH) Lösung mit 108mm Na +, 5 mM K +, 2 mM Ca 2 +, 8mm MgCl 2, 1 mM NaH 2 PO 4, 4mm NaHCO 3, 10 mM Saccharose, 5 mM Trehalose, 5 mM HEPES (pH 7,1, alle Reagenzien von Sigma Chemicals). Die Saccharose und Trehalose sollte auf die AH aus dem Kühlschrank Stammlösungen hinzugefügt gerade vor Gebrauch, um bakterielle Verunreinigungen zu verhindern. </li><li> Bringen AH auf Raumtemperatur und mit Sauerstoff die Lösung durch Luft-Blasen für mindestens 15 min. </li><li> Ziehen Sie mehrere feine Kapillaren (z. B. Glaskapillaren, 100 ul, VWR) zur Entfernung von Fett benötigt. </li></ol> Larven Herzen <ol><li> Sylgard-beschichtete Deckgläser: mit einem Zahnstocher, Transfer über 50-70μl der Sylgard Lösung auf eine 22x22mm Deckglas. Lassen Sie die Sylgard härten bei 65 ° C über Nacht. </li><li> Bereiten Sie die Broadie und Bate-Puffer (135mm NaCl, 5 mM KCl, 4mm MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM TES, 36mm Sucrose;. PH 7,15 Siehe Broadie und Bate, 1993). </li><li> Bereiten Sie die notwendigen Tools, um die Histoacryl Klebstoff anwenden. Ziehen Sie zunächst mehrere feine Kapillaren (zB Science Products GB100T8P). Schließen Sie ein 1,5 ml Pipettenspitze mit einem kleinen Plastikschlauch (Tygon, 1 / 32 &quot;), indem Sie das kleinere Ende in die Röhre. Legen Sie eine Kapillare mit der weiten Öffnung am anderen Ende. Laden Sie die Kapillare mit Histoacryl Kleber durch Eintauchen der Kapillare in einem Tropfen Klebstoff und sanfte Saugwirkung in die Spitze aus Kunststoff. Bei der Arbeit mit dem Klebstoff sollte man eine zweite Glaskapillare zur Hand haben, um übermäßige Kleber von der Spitze des Klebers Kapillare zu entfernen. Der Kleber ist flüssig, bis es in Kontakt mit Kochsalzlösung, wo es härtet innerhalb von ein paar Sekunden. Aber es bleibt in der Regel aus Kunststoff lange genug, um aus dem Leim Kapillarspitze oder während ihrer Anwendung auf die Probe entfernt werden. </li></ol> Semi-intakt Drosophila Herz aus dem Adult Fly <ol><li> Adult Drosophila-Fliegen werden anästhesiert mit Fly Nap (Carolina Biological Supply Co.) für 2-5 Minuten. Vorsicht ist geboten, um die Fliegen in der Fly Nap für längere Belichtungszeiten zu verlassen. Kurzfristige Exposition gegenüber Kälte kann auch verwendet werden, um Fliegen zu betäuben, aber CO 2 wird nicht empfohlen, da es länger hat nachhaltige Auswirkungen auf die Herzfrequenz und Rhythmik. </li><li> Narkotisierten fliegt platziert sind, dorsalen Seite nach unten in eine Petrischale mit einer dünnen Schicht Vaseline beschichtet. Die hydrophoben Cuticula in den Flügeln und Körper reversibel &quot;kleben&quot; an das Gelee, aber die fliegen können neu positioniert, wenn nötig. Dies wird besonders wichtig bei der späteren Manipulationen. </li><li> Eine erste Schnitt erfolgt mit einer gebogenen Feder Schere (Roboz # 5611). Die Scherenblätter sind unter die Beine gelegt und nach unten in Richtung der dorsalen Fläche des Brustkorbes in der Nähe des Halses abgewinkelt. Der Kopf, Bauchmark und Beine sind mit einem einzigen Schnitt entfernt. Das Präparat wird dann in ein mit Sauerstoff angereichertes, künstliche Hämolymphe (AH)-Lösung getaucht. </li><li> Mit Feder Schere der hinteren Spitze des Bauches (bestehend aus Abdominalsegmente 7 und 8) ist mit einem einzigen Schnitt entfernt. Dies ermöglicht den Zugang zur Herstellung von seitlichen Einschnitte an den beiden Rändern des Bauches und dient dazu, die Verbindung zwischen dem hinteren Bauch und der Bauch Nagelhaut zu durchtrennen. Die befreiten Klappe ventral abdominal Nagelhaut wird dann entfernt. </li><li> In den Schritten 3 und 4 des vorderen und hinteren Anschlüsse des Darms werden durchtrennt, so dass die Bauchorgane sind jetzt an Stelle nur durch tracheols statt. Der Darm und andere Bauchorgane können in der Regel als eine einzige Masse mit Juwelier Zange (Roboz, # 55) und sanft zerren entfernt werden. Das Entfernen der inneren Organe zeigt das schlagende Herz Rohr noch an der dorsalen Kutikula durch Fettkörper umgeben befestigt. </li><li> Die Fettkörper sind ziemlich undurchsichtig im Lichtmikroskop folglich ist es oft notwendig, um etwas von diesem Fett zu entfernen, um das Herz Rohr deutlich zu sehen. Dies wird durch eine Fettabsaugung Technik mit fein gezeichneten Glaskapillaren durchgeführt. Kapillaren werden mit einer Standard-Pipette Abzieher (zB Sutter P-97 Pipette Puller) und werden dann in Kunststoff-Schlauch (Tygon, 1 / 16 &quot;) befestigt, um ein Vakuum Quelle eingefügt. Dieses System ist zur Absaugung von überschüssigem Fett um das Herz Rohr eingesetzt. Saugkraft ist proportional zur Spitze Durchmesser so Pipetten mit Spitzen von mehr als 40 Mikrometer im Durchmesser nicht verwendet werden sollte. Extreme Vorsicht ist zu vermeiden, berühren das Herz selbst und werden, weil der hintere Teil des Herzens ist sehr zerbrechlich dieser Region insgesamt sollte vermieden werden. </li><li> Die erwachsenen Drosophila Herzen Röhre ist nun frei und sollte zu schlagen. Bei Bedarf kann die Nagelhaut und befestigt Herz kann durch leichtes Anheben der Oberhaut aus der Vaseline und sorgfältig Stopf es wieder nach unten, wieder jeglichen Kontakt mit dem Herzgewebe neu positioniert werden. Bei tseine Stelle die Lösung Baden der Zubereitung sollte mit frischem AHL ersetzt werden. Dieses Präparat sollte gestattet werden, für 20-30 Minuten mit Sauerstoffanreicherung vor Manipulationen Gleichgewicht sein. Wenn die Zubereitung nicht länger als 60 Minuten gehalten werden, sollte es mit frischen AHL perfundiert werden. </li></ol> Immobilisierung Drosophila-Larven für die optische Aufzeichnung <ol><li> Geben Sie einen Tropfen Histoacryl Kleber in der Nähe von jeder Ecke des Sylgard Deckgläser. Add 50 ul B &amp; B-Puffer auf den Leim Tropfen, die sich verhärten sofort. Füllen Sie den Raum zwischen den geklebten Stellen mit B &amp; B - der Leim der Puffer auf der Folie halten. </li><li> Nehmen Sie eine Wanderung L3 Larve und legen Sie es auf ein Stück nasse Seidenpapier auf Eis für 2 min. Dies verlangsamt die Bewegung. Übertragen Sie anschließend die Larve in den Puffer und richten Sie ihn mit dem Rücken nach oben (dies ist die Seite der Larve, die denticle Gürtel fehlt). Schnell mit Leim zwischen dem Kopfbereich und dem Sylgard. Der Kleber härtet sehr schnell und verhindern, dass der Kopf der Larve von bewegten. </li><li> Mit einer Pinzette vorsichtig packen das Tier von der hinteren Luftlöcher und sanft dehnen. Fix die Larve in dieser Position durch die Anwendung des Klebers auf beiden Seiten der Larve an der hinteren Hälfte. Um eine weitere Bewegung der Kutikula durch die Wand des Körpers Muskeln zu verringern, fügen Sie mehr Leim an den Flanken des Tieres. Die Larve ist nun in dieser Position fixiert. Das Deckglas kann in eine kleine Petrischale mit AHL oder PBS gefüllt platziert werden. Herzschläge können nun ohne Einmischung von Körper Wand Bewegungen aufgezeichnet werden. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Die semi-intakten, erwachsenen Drosophila Herz rhythmisch schlagen für Stunden nach Dissektion, wenn in frischen, sauerstoffreichen AH gepflegt (siehe Ergänzende Daten, Ocorr, et al., 2007). Ein repräsentatives Beispiel ist in Movie 1 dargestellt. Herz vom 3. Larvenstadium Larve und jungen Fliegen (1 bis 3 Wochen nach Schlüpfen) weisen in der Regel eine regelmäßige Herzschlag mit Raten zwischen 1 bis 3 Hz. Flies älter als 3 Wochen in der Regel mehr Arrhythmie, dennoch sind diese Herzen noch in der Lage, spontan zu schlagen über Stunden in Sauerstoff AHL. Hearts in erwachsenen Fliegen, die als Folge der Dissektion Verfahren beschädigt sind in der Regel zeigen lokalisierten Regionen extreme Verengung, die nicht in der Lage zu entspannen. Damit solche Präparate gelten als beschädigt werden und werden verworfen; Heartbeat Preise langsamer als 1 Hz sind nur selten in Fliegen jünger als 3 Wochen alt beobachtet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1425/MOVIE1.avi">Klicken Sie hier, um Movie 1 herunterladen.</a> - A eine Woche alt erwachsenen Wildtyp fly (w 1118 Labor-Stamm), die den exponierten Bauch-Herz Rohr (anterior nach links). Beachten Sie regelmäßige, rhythmische Kontraktionen. Opaque Regionen in der oberen rechten Ecke werden die restlichen Bauchfett Stellen; runde Zellen auf beiden Seiten des Herzens sind pericardial Zellen.

<ol><li>Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCNQ+potassium+channel+mutations+cause+cardiac+arrhythmias+in+Drosophila+that+mimic+the+effects+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).</li>
<li>Broadie, K. S., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+embryonic+neuromuscular+synapse+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster.</a> J Neurosci. 13, 144-166 (1993).</li>
</ol>

Die Drosophila-Modell hat sich als ein leistungsfähiges Tool, das genetische verwendet wurde, um eine Vielzahl von wissenschaftlichen Fragestellungen reichen von embryonalen Entwicklung, Lernen und Gedächtnis-Adresse sein. Kürzlich dieses vielseitige Modell-Organismus wurde verwendet, um die Genetik der Herzfunktion in-the-fly zu untersuchen. Eine Reihe von Versuchen, Herz Physiologie bei erwachsenen Drosophila zu quantifizieren sind auf Beobachtungen in intakten fliegt durch die Bauchdecke Nagelhaut, gelten. Die meiste...

<table><tbody><tr><td>Feine chirurgische Feder-Schere (gebogen)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5611</td><td>Geeignet für grobe Schnitte (Schritt 3)</td></tr><tr><td>Feine chirurgische Feder-Schere (gerade)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5620</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Kapillaren, 100 µl</td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Kapillaren, fein</td><td>Science Products</td><td>GB100T8P</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenzieher</td><td>Sutter Equipment</td><td>P-97</td><td>Sowohl horizontale als auch vertikale Pipettenzieher sind geeignet</td></tr><tr><td>Kunststoffschlauch</td><td>Tygon</td><td>1/16&amp;#8221; Innendurchmesser</td><td>für 100&amp;#x03BC;l-Kapillaren</td></tr><tr><td>Kunststoffschlauch</td><td>Tygon</td><td>1/32&amp;#8221; Innendurchmesser</td><td>für kleine Kapillaren</td></tr><tr><td>Histoacryl&amp;#174; Gewebekleber</td><td>B. Braun Medical</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung des schlagenden herzens in drosophila</em

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Die<em&gt; Drosophila</em&gt; Herz hat vor kurzem als ein gutes Modellsystem für die Untersuchung der genetischen, zellulären und molekularen Mechanismen, die Funktion in myogene Herzen entstanden. Ein wichtiger Schritt bei der Untersuchung der Herzfunktion in-the-fly ist, einen Weg in das Herz in einer Weise, dass seine myogene Funktion bewahrt, solange noch die schlagenden Herzen Organ beobachtet und protokolliert werden zugreifen. Zwei verschiedene Methoden zur Beobachtung und Aufzeichnung des schlagenden Herzens in beiden Larven und erwachsenen<em&gt; Drosophila</em&gt; Werden hier beschrieben. Unsere semi-intakten Präparat mit adulten Fliegen ermöglicht die übersichtliche Visualisierung der abdominalen Herz ohne Störung durch die pigmentierte Haut-und darüberliegenden Fettkörper. Zur Aufnahme Larven Herz schlägt, ist es notwendig, die Larve, die Körperwand Bewegungen wodurch Herz Bewegungen, die nicht mit myokardialen Kontraktionen verbunden sind minimiert immobilisieren. Unsere Methoden, stabile Erwachsene und Larven Herzen Zubereitungen, die stundenlang mit Raten von 1-3 Hz schlagen können.

Technik für die Visualisierung des schlagenden Herzens in Larven und erwachsene erforderlich<em&gt; Drosophila</em&gt; Präsentiert werden. Jede Lebensphase erfordert eine andere Methodik.

Visualisierung des schlagenden Herzens in Drosophila</em

Das Drosophila-Herz hat sich vor Kurzem als ein geeignetes Modellsystem erwiesen, um die genetischen, zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der Funktion in ... zugrunde liegen.

Hier werden zwei Techniken zur Visualisierung eines schlagenden Herzens bei Drosophila für die Dissektion des adulten Herzens vorgestellt. Zuerst werden Kopf und Thorax durch einen einzigen Schnitt entlang der angegebenen Linie entfernt. Anschließend werden die Genitalien entfernt und die Bauchhöhle mit einer Pinzette geöffnet; dabei werden der Darm und im Fall einer weiblichen Fliege auch die Ovarien entfernt.Der abdominale Fettk&ouml;rper in den Bauchsegmenten drei und vier wird vorsichtig abgesaugt, um das erwachsene Herz freizulegen und so das Larvenherz zu fixieren. Eine einzelne Larve, die in Pufferl&ouml;sung platziert wurde, wird fixiert, indem zuerst Histo-Acral-Kleber im Kopfbereich der Larve aufgetragen wird. Die Larve wird sanft gestreckt, und weiterer Kleber wird am hinteren Ende sowie an den Flanken der Larvenk&ouml;rperwand aufgetragen.Hallo, ich bin GI Fler. Hallo, ich bin Karen er. Wir sind beide Mitglieder des Entwicklungs- und Alternsprogramms am Burnham Institut für Medizinische Forschung.Heute zeigen wir Ihnen die Verfahren, die wir entwickelt haben, um das schlagende Herz von Larven und erwachsenen Drosophila sichtbar zu machen. Beide Präparationen nutzen wir, um Herzschlagparameter bei der Fruchtfliege Drosophila zu visualisieren, zu untersuchen und zu quantifizieren. Bevor wir beginnen, bereiten wir zunächst eine künstliche Hämolymphe-Lösung vor.Diese Lösung enthält den Saccharose-Zusatz Helo, der kurz vor der Verwendung der künstlichen Hämolymphe aus gekühlten Stammlösungen zugesetzt werden sollte. Um bakterielle Kontaminationen zu vermeiden, bringen Sie die künstliche Hämolymphe auf Raumtemperatur und oxygenieren Sie die Lösung durch Einleiten von Luft mindestens 15 Minuten lang. Ziehen Sie anschließend mehrere feine Kapillaren mit einem standardmäßigen Pipettenzieher, die zum Entfernen der Fettkörper in der Fliege benötigt werden.Nachdem alles vorbereitet wurde, müssen erwachsene Fliegen anästhesiert werden. Dies kann durch kurze Exposition gegenüber Fly Nap für zwei bis fünf Minuten erfolgen, wobei jedoch darauf geachtet werden muss, die Fliegen nicht länger als fünf Minuten dem Fly Nap auszusetzen. Eine kurzzeitige Kälteexposition kann ebenfalls zur Anästhesie der Fliegen verwendet werden, Kohlendioxid wird jedoch nicht empfohlen, da es länger anhaltende Auswirkungen auf die Herzfrequenz und die ity hat.Anschließend werden die anesthetisierten Fliegen mit der dorsalen Seite nach unten in eine Petrischale gelegt, die mit einer dünnen Schicht aus Vaseline beschichtet ist. Die hydrophobe Cuticula an Flügeln und Körper sollte reversibel an der Vaseline haften, doch die Fliege kann bei Bedarf neu positioniert werden. Ein erster Schnitt wird mit einer gebogenen Schere mit Feder ausgeführt.Dies erfolgt, indem die Scherenklingen unter die Beine der Fliege gelegt und in Richtung der dorsalen Oberfläche nahe dem Halsbereich geneigt werden. Kopf, ventraler Nervenstrang und Beine werden mit einem einzigen Schnitt entfernt. Die Präparation wird anschließend mit Federbändchen-Scheren in die mit Sauerstoff angereicherte künstliche Hämolymphe-Lösung getaucht.Die Hinterseite des Abdomens, die aus dem siebten und achten Abdominalsegment besteht, wird mit einem einzigen Schnitt entfernt. Dies ermöglicht seitliche Schnitte entlang beider Kanten des Abdomens und durchtrennt die Verbindung zwischen dem hinteren Darm und der abdominellen Cuticula. Führen Sie die Scherenklingen in die kleine Öffnung an der Spitze des Abdomens ein und schneiden Sie die Cuticula seitlich entlang.Dadurch wird eine Kante der ventralen Kutikula freigelegt. Greifen Sie die Lasche mit einer Pinzette und führen Sie einen ähnlichen Schnitt entlang der gegenüberliegenden lateralen Bauchkante durch. Die freigelegte Lasche der ventralen Bauchkutikula kann nun entfernt werden.Der Darm und andere Bauchorgane können normalerweise als einheitliche Masse mithilfe einer feinen Pinzette und vorsichtigem Ziehen entfernt werden. Das Entfernen der inneren Organe legt das schlagende Herzröhrchen frei, das noch über kleine Herzmuskeln mit der dorsalen Cuticula verbunden ist und von Fettkörpern umgeben ist. Die herausgezogenen Kapillaren werden in einen Kunststoffschlauch mit einem Sechzehntel-Zoll-Durchmesser eingeführt, der an eine Vakuumquelle angeschlossen ist.Die Saugkraft ist proportional zum Tip-Durchmesser, daher sollten Pipetten mit Spitzen, deren Durchmesser größer als 40 Mikrometer ist, nach der Einrichtung nicht verwendet werden. Dieses Saugsystem dient dazu, überschüssiges Fett um die Herzröhre herum abzusaugen. Es kann auch genutzt werden, um Luftblasen, die sich an der Kutikula sammeln, sowie jeglichen Schmutz zu entfernen.Es ist äußerste Vorsicht geboten, um das Herz selbst nicht zu berühren, und da der hintere Bereich des Herzens sehr empfindlich ist, sollte auch dieser Bereich insgesamt gemieden werden. Die Herzzelle der erwachsenen Drosophila ist nun freigelegt und sollte gegebenenfalls schlagen. Das Cuticula-Stück mit dem daran befestigten Herzen kann umpositioniert werden, indem man die Cuticula vorsichtig aus dem Vaseline heraushebt und sie dann sorgfältig wieder andrückt.Vermeiden Sie jeglichen Kontakt mit dem Herdgewebe. Zu diesem Zeitpunkt sollte die die Präparation umgebende Lösung durch frische künstliche Hämolymphe ersetzt werden. Die Präparation sollte vor weiteren Eingriffen 20 bis 30 Minuten unter Sauerstoffversorgung equilibrieren.Wenn die Präparation länger als 60 Minuten aufrechterhalten werden soll, sollte sie mit frischem künstlichem Hämolymphe nachperfundiert werden. Diese Präparation ist nun bereit, für optische Ableitungen verwendet zu werden, und kann auch für elektrophysiologische Ableitungen oder histologische Bearbeitungen genutzt werden. Für die Visualisierung des schlagenden Herzens innerhalb der Larven ist eine andere Technik erforderlich.Bereiten Sie zunächst die Deckgläser am Tag vor dem Eingriff vor. Dazu werden mit einem Zahnstocher etwa 50 bis 70 Mikroliter Sard-Lösung auf ein 22 mal 22 Millimeter großes Deckglas gegeben. Lassen Sie den Syl-Guard bei 65 Grad Celsius über Nacht aushärten.Als Nächstes stellen Sie den Brody- und Bates-Puffer her; einmal hergestellt, können Aliquots bei minus 20 Grad Celsius gelagert und bei Bedarf aufgetaut werden. Schließlich bereiten Sie die Werkzeuge vor, die zum Auftragen des histoakryl-Klebers benötigt werden. Ziehen Sie zunächst mehrere feine Kapillaren. Als Nächstes verbinden Sie eine 1,5-Milliliter-Pipettenspitze mit einem kleinen Kunststoffschlauch mit einem Durchmesser von etwa einem Zweiunddreißigstel Zoll. Stecken Sie das kleinere Ende in den Schlauch und führen Sie eine Kapillare mit ihrer weit geöffneten Seite in das andere Ende ein. Nach dem Zusammenbau füllen Sie die Kapillare mit Histo-Kleber, indem Sie die Kapillare in einen Tropfen Kleber eintauchen und vorsichtig Saugkraft über die Kunststoffspitze ausüben.Beim Arbeiten mit dem Kleber sollte man eine zweite Glaskapillare bereithalten, um überschüssigen Kleber von der Spitze der Kleberkapillare zu entfernen. Der Kleber ist flüssig, bis er mit gepufferter Salzlösung in Kontakt kommt, wodurch er innerhalb weniger Sekunden aushärtet. Normalerweise bleibt er jedoch ausreichend lange plastisch, um von der Spitze der Kleberkapillare entfernt oder während des Auftragens auf die Probe verarbeitet werden zu können.Um nun mit der Immobilisierung der Larven zu beginnen, geben Sie einen Tropfen Histo-Acral-Kleber nahe jeder Ecke des Syl-Guards auf. Decken Sie die Objektträger mit jeweils 50 Mikrolitern B-und-B-Puffer ab, der sofort in den Klebetropfen aushärtet. Füllen Sie den Raum zwischen den geklebten Stellen mit B und B. Der Kleber hält den Puffer auf dem Objektträger.Nehmen Sie eine wandernde Larve im dritten Larvenstadium und legen Sie sie für zwei Minuten auf ein Stück feuchtes Filterpapier auf Eis. Dies verlangsamt ihre Bewegung. Anschließend überführen Sie die Larve in den Puffer und positionieren sie mit der dorsalen Seite nach oben.Dies ist die Seite der Larven, die nicht über identische Gurte verfügt. Tragen Sie schnell etwas Klebstoff zwischen den Kopfbereich und die Türschwelle auf. Der Klebstoff härtet sehr schnell aus und verhindert, dass sich der Kopf der Larve bewegt.Mit einer Pinzette vorsichtig das Tier an den hinteren Glanzstellen fassen und sanft dehnen. Die Larven in dieser Position fixieren, indem der Kleber entlang beider Seiten der Larven in der hinteren Hälfte aufgetragen wird. Um weitere Bewegungen der Cuticula durch die Muskulatur der Körperwand zu reduzieren, mehr Kleber an den Flanken des Tieres hinzufügen.Die Larve ist nun in dieser Position fixiert. Der Deckglaser kann in eine kleine Petrischale, gefüllt mit künstlichem Hämolymphe oder PBS, gegeben werden; nun können Herzschläge ohne Störung durch Bewegungen der Körperwand aufgezeichnet werden. Das halbintakte Herz von erwachsenen Drosophila schlägt rhythmisch über mehrere Stunden nach der Präparation, sofern es in frischem, mit Sauerstoff angereichertem künstlichem Hämolymphe gehalten wird.Ein repräsentatives Beispiel ist hier und im ergänzenden Film eins dargestellt: Herzen von dritten Instar-Larven, die hier gezeigt werden, sowie junge Fliegen im Alter von ein bis drei Wochen nach der Elosion zeigen im Allgemeinen einen regelmäßigen Herzschlag mit Frequenzen zwischen ein und drei Hertz. Fliegen, die älter als drei Wochen sind, zeigen im Allgemeinen eine stärkere Arrhythmie. Dennoch sind diese Herzen weiterhin in der Lage, stundenlang in oxygeniertem künstlichem Hämolymphe spontan zu schlagen. Herzen und erwachsene Fliegen, die infolge des Präparationsverfahrens beschädigt wurden, weisen typischerweise lokal begrenzte Bereiche starker Kontriktion auf, die sich nicht entspannen können und oft unkontrollierbar sind. Herzschlagfrequenzen unter einem Hertz werden bei Fliegen, die jünger als drei Wochen sind, selten beobachtet.Daher gelten derartige Präparationen als beschädigt und werden verworfen. Wir haben soeben gezeigt, wie man ebene und adulte Fruchtfliegenherzen für die optische Bildgebung vorbereitet. Denken Sie daran, beim Anfertigen der halbintakten Präparation das Herz selbst niemals zu berühren.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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