Name: Visualisierung des schlagenden Herzens in Drosophila /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-28T21:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Lernen Sie die Visualisierung des schlagenden Herzens bei Drosophila für Entwicklungsbiologie und Herzphysiologie. Diese Methode ermöglicht Forschern die Untersuchung der Herzfrequenz bei Larven und adulten Fliegen.

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KO wird durch einen Zuschuss von der American Heart Association unterstützt.

Bevor Sie beginnen Adult Herzen <ol><li> Frisch vorzubereiten künstliche Hämolymphe (AH) Lösung mit 108mm Na +, 5 mM K +, 2 mM Ca 2 +, 8mm MgCl 2, 1 mM NaH 2 PO 4, 4mm NaHCO 3, 10 mM Saccharose, 5 mM Trehalose, 5 mM HEPES (pH 7,1, alle Reagenzien von Sigma Chemicals). Die Saccharose und Trehalose sollte auf die AH aus dem Kühlschrank Stammlösungen hinzugefügt gerade vor Gebrauch, um bakterielle Verunreinigungen zu verhindern. </li><li> Bringen AH auf Raumtemperatur und mit Sauerstoff die Lösung durch Luft-Blasen für mindestens 15 min. </li><li> Ziehen Sie mehrere feine Kapillaren (z. B. Glaskapillaren, 100 ul, VWR) zur Entfernung von Fett benötigt. </li></ol> Larven Herzen <ol><li> Sylgard-beschichtete Deckgläser: mit einem Zahnstocher, Transfer über 50-70μl der Sylgard Lösung auf eine 22x22mm Deckglas. Lassen Sie die Sylgard härten bei 65 ° C über Nacht. </li><li> Bereiten Sie die Broadie und Bate-Puffer (135mm NaCl, 5 mM KCl, 4mm MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM TES, 36mm Sucrose;. PH 7,15 Siehe Broadie und Bate, 1993). </li><li> Bereiten Sie die notwendigen Tools, um die Histoacryl Klebstoff anwenden. Ziehen Sie zunächst mehrere feine Kapillaren (zB Science Products GB100T8P). Schließen Sie ein 1,5 ml Pipettenspitze mit einem kleinen Plastikschlauch (Tygon, 1 / 32 &quot;), indem Sie das kleinere Ende in die Röhre. Legen Sie eine Kapillare mit der weiten Öffnung am anderen Ende. Laden Sie die Kapillare mit Histoacryl Kleber durch Eintauchen der Kapillare in einem Tropfen Klebstoff und sanfte Saugwirkung in die Spitze aus Kunststoff. Bei der Arbeit mit dem Klebstoff sollte man eine zweite Glaskapillare zur Hand haben, um übermäßige Kleber von der Spitze des Klebers Kapillare zu entfernen. Der Kleber ist flüssig, bis es in Kontakt mit Kochsalzlösung, wo es härtet innerhalb von ein paar Sekunden. Aber es bleibt in der Regel aus Kunststoff lange genug, um aus dem Leim Kapillarspitze oder während ihrer Anwendung auf die Probe entfernt werden. </li></ol> Semi-intakt Drosophila Herz aus dem Adult Fly <ol><li> Adult Drosophila-Fliegen werden anästhesiert mit Fly Nap (Carolina Biological Supply Co.) für 2-5 Minuten. Vorsicht ist geboten, um die Fliegen in der Fly Nap für längere Belichtungszeiten zu verlassen. Kurzfristige Exposition gegenüber Kälte kann auch verwendet werden, um Fliegen zu betäuben, aber CO 2 wird nicht empfohlen, da es länger hat nachhaltige Auswirkungen auf die Herzfrequenz und Rhythmik. </li><li> Narkotisierten fliegt platziert sind, dorsalen Seite nach unten in eine Petrischale mit einer dünnen Schicht Vaseline beschichtet. Die hydrophoben Cuticula in den Flügeln und Körper reversibel &quot;kleben&quot; an das Gelee, aber die fliegen können neu positioniert, wenn nötig. Dies wird besonders wichtig bei der späteren Manipulationen. </li><li> Eine erste Schnitt erfolgt mit einer gebogenen Feder Schere (Roboz # 5611). Die Scherenblätter sind unter die Beine gelegt und nach unten in Richtung der dorsalen Fläche des Brustkorbes in der Nähe des Halses abgewinkelt. Der Kopf, Bauchmark und Beine sind mit einem einzigen Schnitt entfernt. Das Präparat wird dann in ein mit Sauerstoff angereichertes, künstliche Hämolymphe (AH)-Lösung getaucht. </li><li> Mit Feder Schere der hinteren Spitze des Bauches (bestehend aus Abdominalsegmente 7 und 8) ist mit einem einzigen Schnitt entfernt. Dies ermöglicht den Zugang zur Herstellung von seitlichen Einschnitte an den beiden Rändern des Bauches und dient dazu, die Verbindung zwischen dem hinteren Bauch und der Bauch Nagelhaut zu durchtrennen. Die befreiten Klappe ventral abdominal Nagelhaut wird dann entfernt. </li><li> In den Schritten 3 und 4 des vorderen und hinteren Anschlüsse des Darms werden durchtrennt, so dass die Bauchorgane sind jetzt an Stelle nur durch tracheols statt. Der Darm und andere Bauchorgane können in der Regel als eine einzige Masse mit Juwelier Zange (Roboz, # 55) und sanft zerren entfernt werden. Das Entfernen der inneren Organe zeigt das schlagende Herz Rohr noch an der dorsalen Kutikula durch Fettkörper umgeben befestigt. </li><li> Die Fettkörper sind ziemlich undurchsichtig im Lichtmikroskop folglich ist es oft notwendig, um etwas von diesem Fett zu entfernen, um das Herz Rohr deutlich zu sehen. Dies wird durch eine Fettabsaugung Technik mit fein gezeichneten Glaskapillaren durchgeführt. Kapillaren werden mit einer Standard-Pipette Abzieher (zB Sutter P-97 Pipette Puller) und werden dann in Kunststoff-Schlauch (Tygon, 1 / 16 &quot;) befestigt, um ein Vakuum Quelle eingefügt. Dieses System ist zur Absaugung von überschüssigem Fett um das Herz Rohr eingesetzt. Saugkraft ist proportional zur Spitze Durchmesser so Pipetten mit Spitzen von mehr als 40 Mikrometer im Durchmesser nicht verwendet werden sollte. Extreme Vorsicht ist zu vermeiden, berühren das Herz selbst und werden, weil der hintere Teil des Herzens ist sehr zerbrechlich dieser Region insgesamt sollte vermieden werden. </li><li> Die erwachsenen Drosophila Herzen Röhre ist nun frei und sollte zu schlagen. Bei Bedarf kann die Nagelhaut und befestigt Herz kann durch leichtes Anheben der Oberhaut aus der Vaseline und sorgfältig Stopf es wieder nach unten, wieder jeglichen Kontakt mit dem Herzgewebe neu positioniert werden. Bei tseine Stelle die Lösung Baden der Zubereitung sollte mit frischem AHL ersetzt werden. Dieses Präparat sollte gestattet werden, für 20-30 Minuten mit Sauerstoffanreicherung vor Manipulationen Gleichgewicht sein. Wenn die Zubereitung nicht länger als 60 Minuten gehalten werden, sollte es mit frischen AHL perfundiert werden. </li></ol> Immobilisierung Drosophila-Larven für die optische Aufzeichnung <ol><li> Geben Sie einen Tropfen Histoacryl Kleber in der Nähe von jeder Ecke des Sylgard Deckgläser. Add 50 ul B &amp; B-Puffer auf den Leim Tropfen, die sich verhärten sofort. Füllen Sie den Raum zwischen den geklebten Stellen mit B &amp; B - der Leim der Puffer auf der Folie halten. </li><li> Nehmen Sie eine Wanderung L3 Larve und legen Sie es auf ein Stück nasse Seidenpapier auf Eis für 2 min. Dies verlangsamt die Bewegung. Übertragen Sie anschließend die Larve in den Puffer und richten Sie ihn mit dem Rücken nach oben (dies ist die Seite der Larve, die denticle Gürtel fehlt). Schnell mit Leim zwischen dem Kopfbereich und dem Sylgard. Der Kleber härtet sehr schnell und verhindern, dass der Kopf der Larve von bewegten. </li><li> Mit einer Pinzette vorsichtig packen das Tier von der hinteren Luftlöcher und sanft dehnen. Fix die Larve in dieser Position durch die Anwendung des Klebers auf beiden Seiten der Larve an der hinteren Hälfte. Um eine weitere Bewegung der Kutikula durch die Wand des Körpers Muskeln zu verringern, fügen Sie mehr Leim an den Flanken des Tieres. Die Larve ist nun in dieser Position fixiert. Das Deckglas kann in eine kleine Petrischale mit AHL oder PBS gefüllt platziert werden. Herzschläge können nun ohne Einmischung von Körper Wand Bewegungen aufgezeichnet werden. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Die semi-intakten, erwachsenen Drosophila Herz rhythmisch schlagen für Stunden nach Dissektion, wenn in frischen, sauerstoffreichen AH gepflegt (siehe Ergänzende Daten, Ocorr, et al., 2007). Ein repräsentatives Beispiel ist in Movie 1 dargestellt. Herz vom 3. Larvenstadium Larve und jungen Fliegen (1 bis 3 Wochen nach Schlüpfen) weisen in der Regel eine regelmäßige Herzschlag mit Raten zwischen 1 bis 3 Hz. Flies älter als 3 Wochen in der Regel mehr Arrhythmie, dennoch sind diese Herzen noch in der Lage, spontan zu schlagen über Stunden in Sauerstoff AHL. Hearts in erwachsenen Fliegen, die als Folge der Dissektion Verfahren beschädigt sind in der Regel zeigen lokalisierten Regionen extreme Verengung, die nicht in der Lage zu entspannen. Damit solche Präparate gelten als beschädigt werden und werden verworfen; Heartbeat Preise langsamer als 1 Hz sind nur selten in Fliegen jünger als 3 Wochen alt beobachtet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1425/MOVIE1.avi">Klicken Sie hier, um Movie 1 herunterladen.</a> - A eine Woche alt erwachsenen Wildtyp fly (w 1118 Labor-Stamm), die den exponierten Bauch-Herz Rohr (anterior nach links). Beachten Sie regelmäßige, rhythmische Kontraktionen. Opaque Regionen in der oberen rechten Ecke werden die restlichen Bauchfett Stellen; runde Zellen auf beiden Seiten des Herzens sind pericardial Zellen.

<ol><li>Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCNQ+potassium+channel+mutations+cause+cardiac+arrhythmias+in+Drosophila+that+mimic+the+effects+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).</li>
<li>Broadie, K. S., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+embryonic+neuromuscular+synapse+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster.</a> J Neurosci. 13, 144-166 (1993).</li>
</ol>

Die Drosophila-Modell hat sich als ein leistungsfähiges Tool, das genetische verwendet wurde, um eine Vielzahl von wissenschaftlichen Fragestellungen reichen von embryonalen Entwicklung, Lernen und Gedächtnis-Adresse sein. Kürzlich dieses vielseitige Modell-Organismus wurde verwendet, um die Genetik der Herzfunktion in-the-fly zu untersuchen. Eine Reihe von Versuchen, Herz Physiologie bei erwachsenen Drosophila zu quantifizieren sind auf Beobachtungen in intakten fliegt durch die Bauchdecke Nagelhaut, gelten. Die meiste...

<table><tbody><tr><td>Feine chirurgische Feder-Schere (gebogen)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5611</td><td>Geeignet für grobe Schnitte (Schritt 3)</td></tr><tr><td>Feine chirurgische Feder-Schere (gerade)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5620</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Kapillaren, 100 µl</td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Kapillaren, fein</td><td>Science Products</td><td>GB100T8P</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenzieher</td><td>Sutter Equipment</td><td>P-97</td><td>Sowohl horizontale als auch vertikale Pipettenzieher sind geeignet</td></tr><tr><td>Kunststoffschlauch</td><td>Tygon</td><td>1/16&amp;#8221; Innendurchmesser</td><td>für 100&amp;#x03BC;l-Kapillaren</td></tr><tr><td>Kunststoffschlauch</td><td>Tygon</td><td>1/32&amp;#8221; Innendurchmesser</td><td>für kleine Kapillaren</td></tr><tr><td>Histoacryl&amp;#174; Gewebekleber</td><td>B. Braun Medical</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung des schlagenden herzens in drosophila</em

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Die<em&gt; Drosophila</em&gt; Herz hat vor kurzem als ein gutes Modellsystem für die Untersuchung der genetischen, zellulären und molekularen Mechanismen, die Funktion in myogene Herzen entstanden. Ein wichtiger Schritt bei der Untersuchung der Herzfunktion in-the-fly ist, einen Weg in das Herz in einer Weise, dass seine myogene Funktion bewahrt, solange noch die schlagenden Herzen Organ beobachtet und protokolliert werden zugreifen. Zwei verschiedene Methoden zur Beobachtung und Aufzeichnung des schlagenden Herzens in beiden Larven und erwachsenen<em&gt; Drosophila</em&gt; Werden hier beschrieben. Unsere semi-intakten Präparat mit adulten Fliegen ermöglicht die übersichtliche Visualisierung der abdominalen Herz ohne Störung durch die pigmentierte Haut-und darüberliegenden Fettkörper. Zur Aufnahme Larven Herz schlägt, ist es notwendig, die Larve, die Körperwand Bewegungen wodurch Herz Bewegungen, die nicht mit myokardialen Kontraktionen verbunden sind minimiert immobilisieren. Unsere Methoden, stabile Erwachsene und Larven Herzen Zubereitungen, die stundenlang mit Raten von 1-3 Hz schlagen können.

Technik für die Visualisierung des schlagenden Herzens in Larven und erwachsene erforderlich<em&gt; Drosophila</em&gt; Präsentiert werden. Jede Lebensphase erfordert eine andere Methodik.

Visualisierung des schlagenden Herzens in Drosophila</em

Das Drosophila-Herz hat sich vor Kurzem als ein geeignetes Modellsystem erwiesen, um die genetischen, zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der Funktion in ... zugrunde liegen.

Hier werden zwei Techniken zur Visualisierung eines schlagenden Herzens bei Drosophila für die Dissektion des adulten Herzens vorgestellt. Zuerst werden Kopf und Thorax durch einen einzigen Schnitt entlang der angegebenen Linie entfernt. Anschließend werden die Genitalien entfernt und die Bauchhöhle mit einer Pinzette geöffnet; dabei werden der Darm und im Fall einer weiblichen Fliege auch die Ovarien entfernt.Der abdominale Fettk&ouml;rper in den Bauchsegmenten drei und vier wird vorsichtig abgesaugt, um das erwachsene Herz freizulegen und so das Larvenherz zu fixieren. Eine einzelne Larve, die in Pufferl&ouml;sung platziert wurde, wird fixiert, indem zuerst Histo-Acral-Kleber im Kopfbereich der Larve aufgetragen wird. Die Larve wird sanft gestreckt, und weiterer Kleber wird am hinteren Ende sowie an den Flanken der Larvenk&ouml;rperwand aufgetragen.Hallo, ich bin GI Fler. Hallo, ich bin Karen er. Wir sind beide Mitglieder des Entwicklungs- und Alternsprogramms am Burnham Institut für Medizinische Forschung.Heute zeigen wir Ihnen die Verfahren, die wir entwickelt haben, um das schlagende Herz von Larven und erwachsenen Drosophila sichtbar zu machen. Beide Präparationen nutzen wir, um Herzschlagp

visualizing-the-beating-heart-in-drosophila

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir eine grundlegende Protokoll für die Fluoreszenzmarkierung der verschiedenen Elemente des Herzens Rohre von Larven und...

Fluoreszenzmarkierung Drosophila Herz Structures

Wir haben eine Semi-automatische optische Heartbeat Analysemethode (SOHA) für die Analyse von optischen Hochgeschwindigkeits-Aufnahmen aus den...

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Überwachung Herzfunktion Larven Drosophila melanogaster Für physiologische Untersuchungen

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Vorbereitung der Embryonen für Elektronenmikroskopie der Drosophila Embryonale Herz Rohr

Drosophila Blutzellen über die Gesamtheit des sich entwickelnden Embryos zu zerstreuen. Dieses Protokoll zeigt, wie die Montage und Bild dieser Migrationen Verwendung von Embryonen mit fluoreszenzmarkierten Blutzellen.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

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Präparation des Drosophila-Herzens: eine Technik zur Untersuchung der Herzphysiologie bei der erwachsenen Fliege

Dieses Protokoll Details eine optimierte Methode verwendet, um Live-Cell-Imaging im Rahmen eines intakten Larven Gehirn durchzuführen. Live-Cell-Imaging Ansätze sind von unschätzbarem Wert für die Erforschung der neuronalen Stamm asymmetrische Zellteilungen sowie andere neurogene und Entwicklungsprozesse konsequent aufzudecken Mechanismen, die bisher übersehen wurden.

Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuroblasten

Hier werden die experimentellen Protokolle für die Vorbereitung von Drosophila in verschiedenen Entwicklungsstadien und die Durchführung einer optischen Längsschnittbildgebung von Drosophila-Herzschlägen mit einem speziellen optischen Kohärenzmikroskopie-System (OCM) beschrieben. Die morphologischen und dynamischen Veränderungen des Herzens können durch die Analyse der strukturellen und funktionellen Parameter des Herzens aus OCM-Bildern quantitativ charakterisiert werden.

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Lichtblattmikroskopie der schnellen Herzdynamik in Zebrafischembryonen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Erzeugung von Drosophila melanogaster , die eNpHR2.0 oder ReaChR-Opsine im Herzen exprimieren, für die OCT-Bildgebung und die optogenetische Herzschrittbildung. Detaillierte Anweisungen für die Drosophila OCT-Bildgebung und Herzschlagmodulation, einschließlich der Simulation von wiederherstellbarem Herzstillstand, Bradykardie und Tachykardie bei lebenden Tieren in verschiedenen Entwicklungsstadien, werden berichtet.

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Neuartige und effiziente Methode zur Fluoreszenzfärbung von Drosophila-Herzen mit Kryosektion

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Visualisierung des schlagenden Herzens in Drosophila

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