Visualisierung des schlagenden Herzens in Drosophila

Es werden hier zwei Techniken zur Visualisierung eines schlagenden Herzens in Drosophila für die Dissektion des adulten Herzens vorgestellt. Zuerst werden der Kopf und der Thorax durch einen einzigen Schnitt entlang der angegebenen Linie entfernt. Als nächstes werden die Genitalien entfernt und die Bauchhöhle mit einer Pinzette geöffnet, der Darm, und im Falle einer weiblichen Fliege werden die Eierstöcke entfernt.

Der Bauchfettkörper in den Bauchsegmenten drei und vier wird vorsichtig abgesaugt, um das erwachsene Herz für die Ruhigstellung des Larvenherzens freizulegen. Eine einzelne Larve, die in eine Pufferlösung gelegt wird, wird fixiert, indem zuerst histo-akraler Kleber um die Larvenkopfregion aufgetragen wird. Die Larven werden sanft gedehnt und mehr Klebstoff auf das hintere Ende und dann auf die Flanken der Larvenkörperwand aufgetragen.

Hallo, ich bin GI Fler. Hallo, ich bin Karen er. Wir sind beide Mitglieder des Programms "Development and Aging" am Burnham Institute for Medical Research.

Heute zeigen wir Ihnen die Verfahren, die wir entwickelt haben, um das schlagende Herz von Laval und adulten Drosophila sichtbar zu machen. Wir verwenden diese beiden Präparate, um die Herzschlagparameter in der Fruchtfliege zu visualisieren, zu untersuchen und zu quantifizieren. Drosophila. Bevor es losgeht, bereiten wir zunächst eine künstliche Hämolymphlösung vor.

Diese Lösung enthält Saccharoseeintrag, Helo, der der künstlichen Hämolymphe aus gekühlten Stammlösungen kurz vor der Verwendung zugesetzt werden sollte. Um eine bakterielle Kontamination zu vermeiden, bringen Sie die künstliche Hämolymphe auf Raumtemperatur und versorgen Sie die Lösung mindestens 15 Minuten lang mit Sauerstoff, indem Sie die Luft sprudeln lassen. Ziehen Sie anschließend mehrere feine Kapillaren mit einem Standard-Pipettenabzieher, der für die Entfernung von Fettkörpern in der Fliege benötigt wird.

Wenn alles vorbereitet ist, müssen erwachsene Fliegen betäubt werden. Dies kann durch kurzes Einwirken der Fliege für zwei bis fünf Minuten erfolgen, aber achten Sie darauf, die Fliegen nicht länger als fünf Minuten im Fliegenschlaf zu lassen. Eine kurzfristige Kälteeinwirkung kann auch zur Betäubung von Fliegen verwendet werden, aber Kohlendioxid wird nicht empfohlen, da es länger anhaltende Auswirkungen auf die Herzfrequenz und die Herzfrequenz hat.

Als nächstes werden die betäubten Fliegen mit der Rückenseite nach unten in eine Petrischale gelegt, die mit einer dünnen Schicht Vaseline überzogen ist. Die hydrophobe Kutikula an den Flügeln und am Körper sollte reversibel mit dem Gelee haften, die Fliege kann aber bei Bedarf neu positioniert werden. Ein erster Schnitt wird mit einer gebogenen Federschere ausgeführt.

Dies geschieht, indem die Scherenklingen unter die Beine der Fliege gelegt und in Richtung der dorsalen Fläche in der Nähe des Halses abgewinkelt werden. Der Kopf, der ventrale Nervenstrang und die Beine werden nach dem Schnitt mit einem einzigen Schnitt entfernt. Das Präparat wird dann mit einer Federschere in die sauerstoffhaltige künstliche Hämolymphlösung getaucht.

Die hintere Spitze des Abdomens, die aus dem siebten und achten Bauchsegment besteht, wird mit einem einzigen Schnitt entfernt. Dies ermöglicht seitliche Schnitte entlang beider Bauchkanten und dient dazu, die Verbindung zwischen dem hinteren Darm und der Bauchkutikula zu durchtrennen. Führen Sie die Klingen der Schere in die kleine Öffnung in der Bauchspitze ein und schneiden Sie die Nagelhaut seitlich ein.

Dadurch wird ein Rand der ventralen Kutikula frei. Fassen Sie die Klappe mit einer Pinzette und machen Sie einen ähnlichen Schnitt entlang der gegenüberliegenden Seitenkante des Bauches. Der freigelegte Lappen der ventralen Bauchkutikula kann nun entfernt werden.

Der Darm und andere Bauchorgane können in der Regel als eine einzige Masse mit einer Juwelierzange und leichtem Ziehen entnommen werden. Bei der Entnahme der inneren Organe kommt die schlagende Herzröhre zum Vorschein, die noch durch kleine Luftmuskeln mit der dorsalen Kutikula verbunden und von Fettkörpern umgeben ist. Die gezogenen Kapillaren werden in Kunststoff eingeführt, wobei ein 16-Zoll-Schlauch an einer Vakuumquelle befestigt ist.

Die Saugkraft ist proportional zum Spitzendurchmesser, daher sollten Pipetten mit Spitzen mit einem Durchmesser von mehr als 40 Mikrometern nach dem Einrichten nicht verwendet werden. Dieses Saugsystem wird verwendet, um überschüssiges Fett aus der Umgebung des Herzschlauchs abzusaugen. Es kann auch verwendet werden, um Luftblasen, die sich um die Nagelhaut ansammeln, und Ablagerungen zu entfernen.

Es muss äußerste Vorsicht walten gelassen werden, um zu vermeiden, dass das Herz selbst berührt wird, und da der hintere Teil des Herzens sehr zerbrechlich ist, sollte diese Region zusammen vermieden werden. Der adulte Drosophila-Herzschlauch liegt nun frei und sollte bei Bedarf schlagen. Die Nagelhaut und das daran befestigte Herz können neu positioniert werden, indem die Nagelhaut vorsichtig aus der Vaseline gehoben und vorsichtig wieder festgedrückt wird.

Vermeiden Sie jeglichen Kontakt mit dem Herzgewebe. Zu diesem Zeitpunkt sollte die Lösung, in der das Präparat badet, durch frische künstliche Hämolymphe ersetzt werden. Dieses Präparat sollte vor jeder Manipulation 20 bis 30 Minuten lang mit Sauerstoffzufuhr ausgeglichen werden.

Wenn das Präparat länger als 60 Minuten aufrechterhalten werden soll, sollte es mit frischer künstlicher Hämolymphe reperfundiert werden. Dieses Präparat ist nun bereit für die optische Aufzeichnung und kann auch für elektrophysiologische Aufzeichnungen oder für histologische Manipulationen verwendet werden. Eine andere Technik ist erforderlich, um das schlagende Herz innerhalb der Larven sichtbar zu machen.

Bereiten Sie zunächst am Tag vor dem Eingriff Deckgläser vor. Dazu werden mit einem Zahnstocher etwa 50 bis 70 Mikroliter Sard-Lösung auf ein 22 mal 22 Millimeter großes Deckglas übertragen. Lassen Sie den Syl Guard über Nacht bei 65 Grad Celsius aushärten.

Als nächstes den Brody-und-Bates-Puffer herstellen Sobald er vorbereitet ist, können Aliquots bei minus 20 Grad Celsius gelagert und bei Bedarf aufgetaut werden. Bereiten Sie abschließend die Werkzeuge vor, die zum Auftragen des histo-akralen Klebers erforderlich sind. Ziehen Sie zunächst mehrere feine Kapillaren.

Verbinden Sie als Nächstes eine 1,5-Milliliter-Pipettenspitze mit einem kleinen Plastikschlauch mit einem Durchmesser von etwa einem 32. Zoll. Indem Sie das kleinere Ende in das Rohr einführen, führen Sie eine Kapillare mit ihrer breiten Öffnung zum anderen Ende ein. Nach dem Einrichten befüllen Sie die Kapillare mit Histo-Kleber, indem Sie die Kapillare in einen Tropfen Klebstoff tauchen und sanft in die Kunststoffspitze eindrücken.

Bei der Arbeit mit dem Kleber sollte man eine zweite Glaskapillare zur Hand haben, um überschüssigen Kleber von der Spitze der Leimkapillare zu entfernen. Der Kleber ist flüssig, bis er mit gepufferter Kochsalzlösung in Berührung kommt, wo er innerhalb weniger Sekunden aushärtet. In der Regel bleibt es jedoch lange genug plastisch, um von der Leimkapillarspitze oder beim Auftragen auf die Probe entfernt zu werden.

Um nun mit der Immobilisierung der Larven zu beginnen, geben Sie einen Tropfen histo-akralen Kleber in die Nähe jeder Ecke des Syl-Guards. Deckgläser fügen den Leimtropfen 50 Mikroliter B- und B-Puffer hinzu, der sofort aushärtet und den Raum zwischen den Klebestellen mit b und b füllt. Der Kleber hält den Puffer auf der Folie.

Nehmen Sie eine wandernde L drei Larven und legen Sie sie für zwei Minuten auf ein Stück nasses Seidenpapier auf Eis. Dadurch wird seine Bewegung verlangsamt. Als nächstes setzen Sie die Larven in den Puffer um und richten ihn mit der Rückenseite nach oben aus.

Dies ist die Seite der Larven, der die identischen Gürtel fehlen. Tragen Sie schnell etwas Kleber zwischen dem Kopfbereich und dem Schwellerschutz auf. Der Kleber härtet sehr schnell aus und verhindert, dass sich der Kopf der Larven bewegt.

Fassen Sie das Tier vorsichtig mit einer Pinzette am hinteren Glitzer und dehnen Sie es sanft. Fixieren Sie die Larven in dieser Position, indem Sie den Kleber auf beide Seiten der Larven in der hinteren Hälfte auftragen. Um die weitere Bewegung der Nagelhaut durch die Körperwandmuskulatur zu reduzieren, tragen Sie mehr Klebstoff auf die Flanken des Tieres auf.

In dieser Position ist die Larve nun fixiert. Das Deckglas kann in eine kleine Petrischale gelegt werden, die mit künstlicher Hämolymphe gefüllt ist, oder PBS-Herzschläge können nun ohne Beeinträchtigung durch Bewegungen der Körperwand aufgezeichnet werden. Das halb intakte erwachsene Drosophila-Herz schlägt nach der Dissektion stundenlang rhythmisch, wenn es in frischer, sauerstoffreicher künstlicher Hämolymphe gehalten wird.

Ein repräsentatives Beispiel wird hier gezeigt und in einem ergänzenden Film sind ein Herz aus dem dritten in Sternlarven zu sehen, und junge Fliegen, die ein bis drei Wochen nach Elo im Allgemeinen einen regelmäßigen Herzschlag aufweisen, bei Raten zwischen einem und drei Hertz, Fliegen, die älter als drei Wochen sind, sind im Allgemeinen arrhythmischer. Nichtsdestotrotz sind diese Herzen in sauerstoffhaltigen künstlichen Hämolymphherzen immer noch in der Lage, stundenlang spontan zu schlagen, und erwachsene Fliegen, die durch die Dissektion geschädigt werden, zeigen typischerweise lokalisierte Regionen extremer Verengung, die sich nicht entspannen können und oft unkontrolliert sind. Herzschläge von weniger als einem Hertz werden bei Fliegen, die jünger als drei Wochen sind, selten beobachtet.

Folglich gelten solche Präparate als beschädigt und werden verworfen. Wir haben gerade gezeigt, wie man waagerechte und adulte Fruchtfliegenherzen für die optische Bildgebung vorbereitet. Denken Sie daran, wenn Sie das halb intakte Präparat zubereiten, berühren Sie niemals das Herz selbst.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.