Assay für Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP)-Triggered Immunity (PTI) in Pflanzen

Hallo, ich bin Suma TI aus dem Labor von Greg Martin am Voice Thompson Institute for Plant Research. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für einen zellbasierten Assay zur Untersuchung der durch PAM ausgelösten Immunität oder PTI. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Beteiligung eines Gens an der PTI zu untersuchen.

Beginnen wir also. Starten Sie das Verfahren, indem Sie Nicotiana ANA züchten, bis sie etwa sieben Wochen alt sind. Vier bis fünf Tage vor Beginn.

Der PAM-ausgelöste Immunitäts- oder PTI-Test. Schneiden Sie die Pflanzen zurück, um alle achselständigen Seitentriebe und Blüten zu entfernen. Entfernen Sie die achselständigen Seitentriebe möglichst kurz nach ihrem Auftreten, um die Pflanzen besser handhabbar zu machen.

Nach der Vorbereitung der Pflanzen fahren Sie mit dem Anzüchten der Bakterien fort. Dieses Verfahren verwendet nicht-pathogene Bakterien zur Induktion der Pflanzenimmunität vor einer zweiten Inokulation mit Herausforderungsbakterien; initiieren Sie das Wachstum aller im Assay verwendeten Bakterien. Gleichzeitig verwenden Sie gefrorene Glycerin-Stäbchen der Pseudomonas-Bakterien für jedes Pseudomonas-Bakterienstäbchen.

Verteilen Sie eine kleine Menge Bakterien in der Mitte einer KBM-Platte, die das geeignete Antibiotikum enthält, und inkubieren Sie die Platte bei 30 Grad Celsius für etwa 18 bis 24 Stunden. Verwenden Sie für Agrobacterium eine zuvor vorbereitete, frische Platte, um eine Flüssigkultur in zwei Milliliter LB anzusetzen. Kultivieren Sie über Nacht bei 30 Grad Celsius unter Schütteln am folgenden Tag.

Geben Sie 150 bis 200 Mikroliter flüssiges KBM auf die Platten mit Pseudomonas-Bakterien. Verteilen Sie die Bakterien gleichmäßig über die gesamte Platte. Verwenden Sie dazu einen sterilen Spatel.

Stellen Sie die Platten erneut für 20 bis 24 Stunden in den Inkubator. Vier Agrobacterium. Beginnen Sie eine Sekundärkultur in etwa fünf bis 10 Milliliter LB, das 20 Mikromolar Aceton enthält.

Züchten Sie die Kultur über Nacht bei 30 Grad Celsius unter Schütteln. Nach der Vorbereitung der Bakterien bereiten Sie die Pflanzen am Tag vor der Durchführung des PTI-Assays für den Assay vor. Nach der Vorbereitung der Bakterien stellen Sie die Pflanzen in einen Raum mit 22 bis 24 Grad Celsius, einer relativen Luftfeuchtigkeit von etwa 35 bis 40 % und konstantem Licht.

Verwenden Sie anschließend einen dicken schwarzen Marker, um Kreise auf den Blättern zu markieren. Wählen Sie gut entfaltete Blätter aus und vermeiden Sie ältere Blätter oder solche, die sich alt oder dick anfühlen. Markieren Sie nicht die unteren Abschnitte des Blattes.

Die Kreise haben einen Durchmesser von mindestens 1,5 Zentimetern, und pro Blatt können zwei bis vier Kreise markiert werden. Die Kreise sollten gut verteilt sein und vorzugsweise keine großen Blattadern kreuzen. Beginnen Sie den PTI-Assay mit der Gewinnung der Bakterien, die zur Induktion von PTI verwendet werden.

Die verwendeten Pseudomonas-Arten sollten einen bakteriellen Rasen gebildet haben, der auf ein gutes Wachstum hinweist. Gewinnen Sie sie von der Platte, indem Sie sie mit einem sterilen langen Holzstäbchen abkratzen, und resuspendieren Sie sie in etwa 20 bis 25 Milliliter einer 10 Millimolar Magnesiumchloridlösung für Agrobacterium-Zentrifugation.

Die Kultur, um die Zellen zu sammeln und in etwa 20 bis 25 Milliliter 10 Millimolar Magnesiumchlorid plus 10 Millimolar MES, pH 5,6, erneut zu resuspendieren. Wiederholen Sie die Zentrifugation und resuspendieren Sie erneut in etwa 20 bis 25 Milliliter der Magnesiumchlorid- plus MES-Lösung. Nun, da die induzierenden Pseudomonas- und Agrobacterium-Bakterien resuspendiert sind.

Messen Sie die optische Dichte aller drei Kulturen bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern. Stellen Sie die ODS-Werte ein, indem Sie die Zellen mit Magnesiumchlorid für Pseudomonas bzw. mit MES plus Magnesiumchlorid für Agrobacterium verdünnen. Die erforderlichen Endwerte für die OD sind im beigefügten schriftlichen Protokoll angegeben.

Ein Gesamtvolumen von 25 Millilitern Bakterienkultur reicht aus, um etwa 40 bis 50 Stellen zu beimpfen. Beginnen Sie nun den Assay, indem Sie die PTI-Induktoren mit einer Ein-Milliliter-Spritze ohne Nadel in die vorab markierten Kreise auf den Blättern infiltrieren. Notieren Sie die Reihenfolge, in der die Pflanzen infiltriert wurden, sowie den genauen Zeitpunkt, zu dem die Infiltration nach der Induktion begonnen wurde.

Führen Sie die Challenge-Inokulation mehrere Stunden nach der Induktionsinokulation durch. Gewinnen Sie die für die Challenge-Inokulation erforderlichen Bakterienstämme, wie zuvor für die induzierenden Pseudomonas-Stämme gezeigt. Messen Sie erneut den OD-Wert und stellen Sie die Konzentration der Kulturen gemäß dem beiliegenden GR-Protokoll ein.

Beginnen Sie die Herausforderungsinokulation sieben Stunden nach der Induktoreinschleusung. Verwenden Sie die folgenden Kombinationen aus Induktor und Herausforderungsorganismus. Wählen Sie einen Punkt am Rand des ersten Inokulationskreises als Mittelpunkt des zweiten Inokulationskreises.

Führen Sie die Challenge-Infiltration in der gleichen Reihenfolge der Pflanzen durch wie die Induktion. Falls sich mehrere Stellen auf einem Blatt befinden, achten Sie darauf, dass sich die Infiltrationen nicht überlappen. Abschließend werden serielle Verdünnungen aller in dem Assay verwendeten Kulturen auf KBM- oder LB-Platten mit den geeigneten Antibiotika ausplattiert.

Zwei Tage nach der Herausforderungsinokulation kann man die PTI-Antwort beginnen zu bewerten. Zwei Tage nach der Induktions- und Herausforderungsinokulation auf das Auftreten von Zelltod infolge der durch Effektoren ausgelösten Immunität oder ETI an den Stellen achten, die mit PST DC 3000 herausgefordert wurden. Zelltod innerhalb des überlappenden Infiltrationsbereichs weist auf einen Zusammenbruch der PTI hin und sollte als positives Phänotyp gewertet werden. Vier bis fünf Tage nach der Induktions- und Herausforderungsinokulation auf das Auftreten von krankheitsbedingtem Zelltod an den Stellen achten, die mit dem DC 3000 hopQ1-Mutanten oder PS back high erneut herausgefordert wurden. Auf einen Zusammenbruch der PTI achten, der durch krankheitsbedingten Zelltod im überlappenden Infiltrationsbereich angezeigt wird. Die Pflanzen weiter beobachten, bis jene, die nicht in ihrer PTI beeinträchtigt sind, beginnen, Zelltod im überlappenden Infiltrationsbereich zu zeigen.

Pflanzen, bei denen FLS2 stillgelegt wurde, weisen zwei Tage nach der Inokulation mit der PFDC-Kombination eine beeinträchtigte PTI auf. Im überlappenden Bereich ist Zelltod zu beobachten, was auf einen Zusammenbruch der PTI hindeutet. Kontrollpflanzen, bei denen kein Gen stillgelegt wurde, wurden ebenfalls mit der PFDC-Kombination inokuliert und zwei Tage nach Durchführung des Assays untersucht. Zelltod infolge der Herausforderung ist außerhalb, jedoch nicht innerhalb des überlappenden Bereichs sichtbar, was auf eine normale PTI-Antwort hinweist.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man einen auf Zelltod basierenden Assay für die durch Pant ausgelöste Immunität oder PTI während dieses Verfahrens durchführt. Es ist wichtig, daran zu denken, die Pflanzen unter den von uns empfohlenen Umweltbedingungen zu halten. Höhere Feuchtigkeitsniveaus würden die Pflanzen negativ beeinflussen und dazu führen, dass der Assay schneller abläuft.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.