Assay für Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP)-Triggered Immunity (PTI) in Pflanzen

Hallo, ich bin Suma TI aus dem Labor von Greg Martin am Voice Thompson Institute for Plant Research. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für einen auf Zelltod basierenden Assay für PAM-getriggerte Immunität oder PTI. Mit diesem Verfahren suchen wir in unserem Labor nach der Beteiligung eines Gens an der PTI.

Also lasst uns loslegen. Beginnen Sie das Verfahren mit dem Anbau von Nicotiana ANA, bis sie etwa sieben Wochen alt sind. Vier bis fünf Tage vor dem Start.

Der PAM-getriggerte Immunitäts- oder PTI-Assay. Schneiden Sie die Pflanzen zurück, um alle Achselzweige und Blüten zu entfernen. Versuchen Sie, die Achselzweige kurz nach dem Schlüpfen zu entfernen, um die Pflanzen besser handhabbar zu machen.

Nachdem Sie die Pflanzen vorbereitet haben, fahren Sie mit dem Wachstum der Bakterien fort. Bei diesem Verfahren werden nicht-pathogene Bakterien zur Induktion der Pflanzenimmunität vor einer zweiten Inokulation mit Provokationsbakterien verwendet, um das Wachstum aller im Assay verwendeten Bakterien zu initiieren. Verwenden Sie gleichzeitig gefrorene Glycerinstängel der Pseudomonas-Bakterien für jeden Pseudomonas-Bakterienstiel.

Verteilen Sie eine kleine Menge Bakterien auf der Mitte einer KBM-Platte, die das entsprechende Antibiotikum enthält, und inkubieren Sie die Platte etwa 18 bis 24 Stunden lang bei 30 Grad Celsius. Verwenden Sie für das Agrobakterium eine zuvor vorbereitete frische Platte, um eine Flüssigkultur in zwei Millilitern Pfund zu starten. Anbau über Nacht bei 30 Grad Celsius mit Schütteln am nächsten Tag.

Geben Sie 150 bis 200 Mikroliter flüssiges KBM auf die Platten der Pseudomonas-Bakterien. Verteilen Sie die Bakterien auf der gesamten Platte. Mit einem sterilen Greter.

Legen Sie die Platten für weitere 20 bis 24 Stunden in den Inkubator. Vier Agrobakterien. Beginnen Sie eine Sekundärkultur in etwa fünf bis 10 Millilitern LB mit 20 mikromolaren Acetonen.

Züchten Sie die Kultur über Nacht bei 30 Grad Celsius unter Schütteln. Nachdem Sie die Bakterien vorbereitet haben, bereiten Sie die Pflanzen am Tag vor der Durchführung des PTI-Assays auf den Assay vor. Nachdem Sie die Bakterien vorbereitet haben, bringen Sie die Pflanzen in einen 22 bis 24 Grad Celsius warmen Raum mit etwa 35 bis 40 % relativer Luftfeuchtigkeit und konstantem Licht.

Markiere dann mit einem dicken schwarzen Marker Kreise auf den Blättern. Wählen Sie gut expandierte Blätter und vermeiden Sie ältere Blätter oder Blätter, die sich hart oder dick anfühlen. Vermeiden Sie es, die unteren Teile des Blattes zu markieren.

Die Kreise haben einen Durchmesser von mindestens 1,5 Zentimetern und pro Blatt können zwei bis vier Kreise markiert werden. Die Kreise sollten gut auseinander liegen und am besten keine große Ader kreuzen. Beginnen Sie den PTI-Assay, indem Sie die Bakterien ernten, die bei der Induktion von PTI verwendet werden.

Die verwendete Pseudomonas-Art sollte einen Bakterienrasen gebildet haben, der auf ein gutes Wachstum hindeutet. Ernten Sie sie von der Platte, indem Sie sie mit einem sterilen langen Holzstäbchen abkratzen und in etwa 20 bis 25 Millilitern 10 Millimolar resuspendieren. Magnesiumchlorid-Lösung für die Agrobacterium-Zentrifuge.

Die Kultur zum Sammeln der Zellen und zur Wiederbelebung suspendiert in etwa 20 bis 25 Millilitern 10 Millimolar Magnesiumchlorid plus 10 Millimolar. MES pH 5,6, Zentrifugation wiederholen und erneut Reanimation In etwa 20 bis 25 Millilitern Magnesiumchlorid plus MES-Lösung suspendieren. Jetzt, da die induzierenden Pseudomonas- und Agrobacterium-Bakterien resuspendiert sind.

Messen Sie die optische Dichte aller drei Kulturen bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern. Passen Sie die ODS an, indem Sie die Zellen mit Magnesiumchlorid für die Pseudomonas und MES plus Magnesiumchlorid für das Agrobakterium verdünnen. Die endgültigen erforderlichen OD-Werte sind im beigefügten schriftlichen Protokoll zu finden.

Ein Gesamtvolumen von 25 Millilitern Bakterienkultur reicht aus, um etwa 40 bis 50 Spots zu beimpfen. Beginnen Sie nun den Assay, indem Sie die PTI-Induktoren mit einer Ein-Milliliter-Spritze ohne Nadel in die vormarkierten Kreise auf den Blättern infiltrieren. Notieren Sie sich die Reihenfolge, in der die Pflanzen infiltriert wurden, und den genauen Zeitpunkt, zu dem mit der Infiltration nach der Induktion begonnen wurde.

Fahren Sie einige Stunden nach der Induktionsimpfung mit der Challenge-Impfung fort. Ernten Sie die Bakterienstämme, die für die Challenge-Inokulation erforderlich sind, wie zuvor für die induzierenden Pseudomonas-Stämme gezeigt. Messen Sie erneut den OD und passen Sie die Konzentration der Kulturen gemäß dem begleitenden GR-Protokoll an.

Beginnen Sie die Challenge-Inokulation sieben Stunden nach der Infiltration des Induktors. Verwenden Sie die folgenden Induktor-Herausforderer-Kombinationen. Wählen Sie einen Punkt an der Peripherie des ersten Impfkreises als Mittelpunkt des zweiten Impfkreises.

Führen Sie die Challenge-Infiltration in der gleichen Pflanzenreihenfolge wie bei der Induktion durch. Wenn es mehrere Stellen auf einem Blatt gibt, stellen Sie sicher, dass sich die Infiltrationen nicht überlappen. Schließlich Platten-Reihenverdünnung aller im Assay verwendeten Kulturen auf KBM- oder LB-Platten, die die entsprechenden Antibiotika enthalten.

Zwei Tage nach der Challenge-Impfung kann man mit der Auswertung der PTI-Reaktion beginnen; zwei Tage nach der Induktion und der Challenge-Inokulation sucht man nach dem Auftreten von Zelltod aufgrund von Effektor-ausgelöster Immunität oder ETI an den Stellen, die mit PST DC 3000 herausgefordert wurden; der Zelltod innerhalb des überlappenden Bereichs der Infiltration deutet auf einen Zusammenbruch von PTI hin und sollte vier bis fünf Tage nach der Induktion und Provokation als positiver Phänotyp bewertet werden. Bei der Inokulation wird nach dem Auftreten von Zelltod aufgrund von Krankheiten an den Stellen gesucht, die mit der DC 3000-Hop-Q1-Mutante oder PS wieder hoch herausgefordert wurden. Achten Sie auf einen Abbau von PTI, der durch den Zelltod aufgrund einer Krankheit im überlappenden Bereich der Infiltration angezeigt wird. Beobachten Sie die Pflanzen so lange, bis diejenigen, die nicht für PTI kompromittiert sind, beginnen, Zelltod im überlappenden Bereich der Infiltration zu zeigen.

für FLS zwei stummgeschaltet wurden, sind zwei Tage nach der Inokulation mit der PFDC-Kombination für PTI kompromittiert. Der Zelltod ist im überlappenden Bereich zu sehen, was auf den Abbau von PTI-Kontrollpflanzen hinweist, die für kein Gen stillgelegt wurden. Wurden ebenfalls mit der PFDC-Kombination geimpft und zwei Tage nach der Durchführung des Assays untersucht, so ist der Zelltod aufgrund der Provokation außerhalb des überlappenden Bereichs, aber nicht innerhalb des überlappenden Bereichs aufgrund einer normalen PTI-Reaktion zu beobachten.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie bei diesem Verfahren einen auf Zelltod basierenden Assay für pant triggered immunity (PTI) durchführen können. Es ist wichtig, daran zu denken, die Pflanzen unter den von uns empfohlenen Umgebungsbedingungen zu halten. Eine höhere Luftfeuchtigkeit würde sich negativ auf die Pflanzen auswirken und den Assay schneller voranbringen.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.