Name: Assay für Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP)-Triggered Immunity (PTI) in Pflanzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-09T16:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Lernen Sie einen Assay zur Untersuchung der PAMP-getriggerten Immunität (PTI) in Nicotiana benthamiana. Diese Methode nutzt Zelltod-basierte Analysen zur Bewertung von Pflanzenimmunität.

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Wir danken Hye-Sook Oh, Joanne Morello und Alan Collmer, Department of Plant Pathology und Pflanzen-Mikroben-Biologie, Cornell University, für wertvolle Diskussionen. Wir danken Jesse Munkvold für Kommentare zu diesem Artikel. Die Finanzierung wurde von der National Science Foundation Pflanzengenom-Programm bereitgestellt, Vergabe-Nummer DBI-0605059 (GBM).

Teil 1: Pflanzenwachstum und Wartung Nicotiana benthamiana Pflanzen im Assay verwendet werden sollte ca. 7 Wochen alt. Sie sollten getrimmt mindestens 4-5 Tage vor dem Test werden alle axillären Zweige und Blüten entfernen. Es ist eine gute Idee, axilläre Zweige bald entfernen, nachdem sie entstehen, damit die Pflanzen mehr überschaubar. Teil 2: Bakterienkultur TAG 1: <ol><li> Platten oder Kulturen für alle Stämme im Assay verwendet werden zur gleichen Zeit gestartet. Für die Pseudomonas spp. die sind 2-Induktoren und 3 Herausforderung Stämme, Streifen Bakterien auf KBM-Platten mit den entsprechenden Antibiotika aus gefrorenen Glycerin Aktien (Tabelle 2). Eine kleine Menge von Bakterien sollte auf der Mitte der Platte verteilt werden. Die Platte bei 30 ° C für ca. 18-24 Stunden. Für Agrobacterium, starten Sie eine flüssige Kultur in 2 ml LB aus einer frischen Platte und wachsen über Nacht bei 250 rpm, 30 ° C. </li></ol> TAG 2: <ol start="2"><li> Für Pseudomonas, fügen 150-200 ul Flüssigkeit KBM, um die Bakterien und breitete sie über die gesamte Platte mit einem sterilen Glas-Spreader. Legen Sie die Platte wieder in den Inkubator und lassen Sie es für ein anderes 20-24 Stunden wachsen. Es sollte ein Bakterienrasen auf der Platte am nächsten Tag unter Angabe gutes Wachstum. Für Agrobacterium, starten Sie eine zweite Kultur in ca. 5-10 ml LB mit 20 uM Acetosyringon und wachsen lassen über Nacht auf 20 Stunden bei 250 rpm, 30 ° C. </li></ol> Teil 3: Herstellung von Pflanzen für den Test TAG 2: <ol><li> Einen Tag vor dem Test sollten die Pflanzen in einen Raum bei 22-24 ° C bewegt, ~ 35-40% relativer Luftfeuchtigkeit und konstantem Licht. </li><li> Mark Kreise auf den Blättern, die mindestens 1,5 cm im Durchmesser mit einem dicken, schwarzen Marker. Zwei bis vier Kreise können pro Blatt gekennzeichnet werden. Die Kreise sollten gut verteilt und bevorzugt nicht über eine große Vene. Wählen Sie gut entwickelte Blätter. Vermeiden älteren Blättern oder Blätter, die harte oder dicke im Griff und vermeiden Kennzeichnung Kreise auf den unteren Abschnitten des Blattes. </li></ol> Kennzeichnung Kreisen einen Tag vor dem Experiment ist nicht unbedingt erforderlich, um das Protokoll. Allerdings spart Zeit, wenn es eine große Anzahl von Pflanzen, die getestet wird, und macht es einfacher, präzises Timing zwischen der Induktion von PTI und Herausforderung Impfungen zu erreichen. Teil 4: Induktion von PTI TAG 3: <ol><li> Ernten Sie die Zellen von der Platte in 10 mM MgCl 2 für P. fluorescens und P. putida. Für Agrobacterium, Zentrifuge der Kultur, um Zellen zu sammeln und resuspendieren in 10 mM MgCl 2 + 10 mM MES pH 5,6. Wiederholen Sie die Zentrifugation und Resuspendieren in der MgCl 2-MES-Lösung. Die optische Dichte (OD) der Zellen bei 600 nM. Passen Sie die ODS die endgültige geforderten Werte wie in Tabelle 2 beschrieben. In der MgCl Pseudomonas schließlich sollte in 10 mM MgCl 2 und Agrobacterium resuspendiert 2-MES-Lösung. Ein Gesamtvolumen von 25 ml ist ausreichend, um etwa 40-50 Punkte zu impfen. </li><li> Infiltrate der PTI-Induktoren in die vorgezeichneten Kreise auf den Blättern mit einer 1 ml Spritze ohne Nadel. Notieren Sie sich die Reihenfolge, in der die Pflanzen eingeschleust und die genaue Zeit, als die Infiltration begonnen wurde. </li></ol> Teil 5: Challenge Impfung <ol><li> Bereiten P. syringae pv.. Tomaten DC3000, DC3000 Pst Δ hopQ1-1 und Ps pv. tabaci für die Herausforderung, wie in Teil 4.1 und Tabelle 2 beschrieben. </li><li> Sieben Stunden nach dem Induktor Infiltration, führen Sie die Herausforderung Infiltration in der gleichen Reihenfolge von Pflanzen wie die Induktion wurde. Im Allgemeinen kann ein Punkt auf der Peripherie der ersten Impfung Kreis als Mitte der zweiten Impfung Kreis eingesetzt werden. Wenn es mehrere Punkte auf ein Blatt werden dann sicherstellen, dass die Infiltrationen nicht überschneiden. </li><li> Platte Verdünnungsreihen aller Kulturen in den Assay auf KBM oder LB-Platten mit den entsprechenden Antibiotika verwendet werden, um die genaue CFU Zahl zu bestimmen. </li></ol> Teil 6: Scoring für den Abbau von PTI Tag 5: <ol><li> Achten Sie auf das Auftreten von Zelltod durch ETI in den Spots, die mit Pst DC3000 herausgefordert wurden. Der Zelltod im überlappenden Bereich der Infiltration zeigt eine Aufschlüsselung der PTI und sollte als positive Phänotyp erzielt werden. </li></ol> Tag 7: <ol start="2"><li> Achten Sie auf das Auftreten von Zelltod durch Krankheit in den Flecken, die mit Pst DC3000 Δ hopQ1-1 oder Ps pv in Frage gestellt wurden. Tabaci </em&gt;. Ergebnis für eine positive Phänotyp in der gleichen Weise wie in Teil 6.1 beschrieben. </li></ol> Wenn die Kontroll-Pflanzen (das sollte nicht für PTI beeinträchtigt werden), um den Zelltod in den überlappenden Bereich der Infiltration zeigen beginnen, aufhören, weitere Beobachtungen. Teil 7: Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1 zeigt das Ergebnis eines Tests, wenn P. fluorescens wurde als Induktor und Pst DC3000 als Herausforderung genutzt. <img src="/files/ftp_upload/1442/fig1tmb.jpg" alt="Abbildung 1" border="0" /> Abbildung 1. P. fluorescens wurde auf N. infiltriert benthamiana Blätter (schwarzer Kreis) zu induzieren PTI und 7 Stunden später, vor Ort wurde mit Pst DC3000 (weißer Kreis) in Frage gestellt. Pflanzen für FLS2 Schweigen zeigte eine Aufschlüsselung der PTI in der Region, wo P. fluorescens wurde infiltriert (A), geändert durch Zelltod zu sehen. Control-Anlagen, die nicht zum Schweigen gebracht wurden, zeigten keine Zelltod in dem überlappenden Bereich aufgrund der Induktion von PTI (B). Rote Pfeile zeigen Mangel an oder das Vorhandensein von Zelltod in dem überlappenden Bereich der Infiltration. Fotos wurden 2 Tage nach der Infiltration genommen. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1442/fig1.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen. <table border="1"><tbody><tr><td> PTI-Induktor </td><td> Zelltod-auslösenden Herausforderung </td><td> Natur des Zelltods </td><td> Code </td></tr><tr><td> Pseudomonas fluorescens 55 </td><td> Pseudomonas syringae pv tomato (Pst.) DC3000 6 </td><td> ETI </td><td> Pf / DC </td></tr><tr><td> P. putida KT2440 </td><td> Pst DC3000 </td><td> ETI </td><td> Pp / DC </td></tr><tr><td> P. fluorescens 55 </td><td> Pst DC3000 Δ hopQ1-1 6 </td><td> Krankheit </td><td> Pf/Q1-1 </td></tr><tr><td> Agrobacterium tumefaciens GV2260 </td><td> P. syringae pv.. tabaci 11528R </td><td> Krankheit </td><td> Agro / PTAB </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Kombinationen von PTI induzieren und Zelltod-auslösenden Mikroben in den Zelltod Assay für PTI verwendet. <table border="1"><tbody><tr><td> Bakterienstamm </td><td> Selektionsmedium </td><td> Finale OD verwendet im Experiment </td><td> Entsprechende CFU / ml </td></tr><tr><td> P. fluorescens 55 </td><td> KBM Ampicillin (100 ug / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 1 x 10 9 </td></tr><tr><td> P. putida KT2440 </td><td> KBM Ampicillin (100 ug / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 1 x 10 8 </td></tr><tr><td> A. tumefaciens GV2260 </td><td> LB Rifampicin (100 ug / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 5 x 10 8 </td></tr><tr><td> Pst DC3000 </td><td> KBM Rifampicin (100 ug / ml) </td><td> 0,02 </td><td> 2 x 10 7 </td></tr><tr><td> Pst DC3000 Δ hopQ1-1 </td><td> KBM Rifampicin (100 ug / ml) </td><td> 100-fache Verdünnung von 0,1 </td><td> 1 x 10 6 </td></tr><tr><td> P. syringae pv.. tabaci 11528R </td><td> KBM Rifampicin (100 ug / ml) </td><td> 100-fache Verdünnung von 0,1 </td><td> 1 x 10 6 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Culture Bedingungen und Inokulum Ebenen in den Test eingesetzt. Die OD und die entsprechenden CFU Werte können zwischen verschiedenen Marken von Spektralphotometern variieren.

<ol><li>Abramovitch, R. B., Anderson, J. C., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+elicitation+and+evasion+of+plant+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial elicitation and evasion of plant innate immunity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 601-60 (2006).</li>
<li>Jones, J. D., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The plant immune system.</a> Nature. 444 (7117), 323-323 (2006).</li>
<li>Zipfel, C., Robatzek, S., Navarro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+disease+resistance+in+Arabidopsis+through+flagellin+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception.</a> Nature. 428 (6984), 764-764 (2004).</li>
<li>Oh, H. S., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+resistance+against+bacteria+in+Nicotiana+benthamiana+leaves+is+accompanied+by+reduced+vascular+staining+and+suppressed+by+multiple+Pseudomonas+syringae+type+III+secretion+system+effector+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Basal resistance against bacteria in Nicotiana benthamiana leaves is accompanied by reduced vascular staining and suppressed by multiple Pseudomonas syringae type III secretion system effector proteins.</a> Plant J. 44 (2), 348-348 (2005).</li>
<li>Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotiana+benthamiana%3A+its+history+and+future+as+a+model+for+plant-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Nicotiana benthamiana: its history and future as a model for plant-pathogen interactions.</a> Mol Plant Microbe Interact. 21 (8), 1015-1015 (2008).</li>
<li>Wei, C. F., Kvitko, B. H., Shimizu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+mutant+lacking+the+type+III+effector+HopQ1-1+is+able+to+cause+disease+in+the+model+plant+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 mutant lacking the type III effector HopQ1-1 is able to cause disease in the model plant Nicotiana benthamiana.</a> Plant J. 51 (1), 32-32 (2007).</li>
</ol>

Das Zelltod-basierte Test kann verwendet werden, um die Beteiligung eines Gens in PTI bestimmen. Zum Beispiel kann loss-of-function-Mutanten für ein Gen von Interesse unter Verwendung dieses Tests sein. Von den 4 Kombinationen von Induktor und Herausforderung Impfungen in Tabelle 1 angegeben, ist es möglich, dass nur eine Kombination kann in einem Phänotyp in Ihrer Anlage Hintergrund führen. Wir haben beobachtet, dass Pflanzen für FLS2 Schweigen eine Aufschlüsselung der PTI in der Pf / DC und Pf/Q1-1 Kombinationen von Induktor und Herausforderung Impfungen (Tabelle 1) zeigen. Es ist wichtig, dass die ökologischen Bedingungen für die Tests sind so nah wie möglich an die in Teil 3.1 beschrieben. Zu trockene Luft führt zum Zelltod, zu schnell zu fahren, so dass der Test nur schwer zu punkten. Wenn die Bedingungen in unserem Protokoll beschrieben werden, nicht in Ihrem Labor funktionieren, dann versuchen Sie die Änderung der Höhe der Induktor oder Herausforderung Impfung. Ein weiterer Parameter, die geändert werden können, ist die zeitliche Lücke zwischen Induktion und der Provokation, obwohl wir festgestellt, dass kürzere Zeitabstände der Test zu brechen zu schnell unter Kontrolle Pflanzen verursacht haben. Wir empfehlen, dass mindestens 4-5 Pflanzen in einem Experiment getestet werden und eine positive Phänotyp sollte mindestens 3-4 unabhängigen Experimenten wiederholt werden.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP300-100</td><td>Als 1 M-Stammlösung herstellen, pH-Wert einstellen und filtrieren, um Sterilität zu gewährleisten. Bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>Life Science UV/Vis-Spektrophotometer</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>DU 730</td><td></td></tr></tbody></table>

assay für pathogen-associated molecular pattern (pamp)-triggered immunity (pti) in pflanzen

Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP)-Triggered Immunity (PTI) in Plants

Um wahrnehmen potenzielle Krankheitserreger in ihrer Umwelt, verwenden Pflanzen pattern recognition receptors (PRR), die auf ihrer Plasmamembran. PRRs erkennen konservierte mikrobielle Eigenschaften genannt pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) und diese Erkennung führt zu PAMP ausgelöste Immunität (PTI), das verhindert, Kolonisierung Pflanzengewebe durch Nicht-Erreger 1,2. Die gut untersuchte System in PTI ist die FLS2-abhängige Pfad 3. FLS2 erkennt die PAMP flg22, dass eine Komponente des bakteriellen Flagellin ist. Erfolgreiche Krankheitserreger besitzen Virulenzfaktoren oder Effektoren, die PTI unterdrücken und damit die Erreger Krankheit 1 führen kann. Einige Pflanzen wiederum besitzen Resistenzgene, die Effektoren oder ihre Tätigkeit, die Effektor-triggered Immunität (ETI) 2 führt zu erkennen. Wir beschreiben ein Zelltod-basierter Assay für PTI von Oh und Collmer 4 modifiziert. Der Assay wurde standardisiert in N. benthamiana, die verwendet wird zunehmend als ein Modellsystem für die Untersuchung von Pflanzen-Pathogen Interaktionen 5. PTI ist durch Infiltration eines nicht-pathogenen Bakterienstamm in den Blättern. Sieben Stunden später, ein Bakterienstamm, der entweder krank macht oder welche aktiviert ETI in einen Bereich ohne Zwischenraum über die ursprüngliche Infiltration Zone infiltriert. PTI vom ersten Infiltration induziert der Lage ist, verzögern oder verhindern das Auftreten von Zelltod durch die zweite Herausforderung Infiltration. Umgekehrt zeigt das Aussehen des Zelltods in den überlappenden Bereich der Impfung eine Aufschlüsselung der PTI. Vier verschiedene Kombinationen von Induktoren von PTI und Herausforderung Impfungen wurden standardisiert (Tabelle 1). Der Test wurde auf Nicht-Schweigen N. getestet benthamiana Pflanzen, wie die Kontrolle und Anlagen für FLS2 zum Schweigen, die voraussichtlich in ihrer Fähigkeit, PTI entwickeln beeinträchtigt werden serviert wurden.

Ein Zelltod-basierter Assay für PTI in Nicotiana benthamiana Pflanzen beschrieben.

Assay für Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP)-Triggered Immunity (PTI) in Pflanzen

Um potenzielle Pathogene in ihrer Umgebung wahrzunehmen, nutzen Pflanzen Mustererkennungsrezeptoren (Pattern Recognition Receptors, PRRs), die sich auf ihren Plasmamembranen befinden. PRRs erkennen ...

Hallo, ich bin Suma TI aus dem Labor von Greg Martin am Voice Thompson Institute for Plant Research. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für einen zellbasierten Assay zur Untersuchung der durch PAM ausgelösten Immunität oder PTI. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Beteiligung eines Gens an der PTI zu untersuchen.Beginnen wir also. Starten Sie das Verfahren, indem Sie Nicotiana ANA züchten, bis sie etwa sieben Wochen alt sind. Vier bis fünf Tage vor Beginn.Der PAM-ausgel&ouml;ste Immunit&auml;ts- oder PTI-Test. Beschneiden Sie die Pflanzen, um alle Nebentriebe und Bl&uuml;ten zu entfernen. Entfernen Sie die Nebentriebe m&ouml;glichst bald nach ihrem Auftreten, um die Pflanzen besser handhabbar zu machen.Nach der Vorbereitung der Pflanzen fahren Sie mit dem Anzüchten der Bakterien fort. Dieses Verfahren verwendet nicht-pathogene Bakterien zur Induktion der Pflanzenimmunität vor einer zweiten Inokulation mit Herausforderungsbakterien; initiieren Sie das Wachstum aller im Assay verwendeten Bakterien. Gleichzeitig verwenden Sie gefrorene Glycerin-Stäbchen der Pseudomonas-Bakterien für jedes Pseudomonas-Bakterienstäbchen.Verteilen Sie eine kleine Menge Bakterien in der Mitte einer KBM-Platte, die das geeignete Antibiotikum enthält, und inkubieren Sie die Platte bei 30 Grad Celsius für etwa 18 bis 24 Stunden. Verwenden Sie für Agrobacterium eine zuvor vorbereitete, frische Platte, um eine Flüssigkultur in zwei Milliliter LB zu starten. Kultivieren Sie über Nacht bei 30 Grad Celsius unter Schütteln am folgenden Tag.Geben Sie 150 bis 200 Mikroliter flüssiges KBM auf die Platten mit Pseudomonas-Bakterien. Verteilen Sie die Bakterien über die gesamte Platte mithilfe eines sterilen Spatels.Stellen Sie die Platten erneut für 20 bis 24 Stunden in den Inkubator. Vier Agrobacterium. Beginnen Sie eine Sekundärkultur in etwa fünf bis 10 Milliliter LB, das 20 Mikromolar Aceton enthält.Züchten Sie die Kultur über Nacht bei 30 Grad Celsius unter Schütteln. Nach der Vorbereitung der Bakterien bereiten Sie die Pflanzen am Tag vor der Durchführung des PTI-Assays für den Assay vor. Nach der Vorbereitung der Bakterien stellen Sie die Pflanzen in einen Raum mit 22 bis 24 Grad Celsius, einer relativen Luftfeuchtigkeit von etwa 35 bis 40 % und konstantem Licht.Verwenden Sie anschließend einen dicken schwarzen Marker, um Kreise auf den Blättern zu markieren. Wählen Sie gut entfaltete Blätter aus und vermeiden Sie ältere Blätter oder solche, die sich alt oder dick anfühlen. Markieren Sie nicht die unteren Abschnitte des Blattes.Die Kreise haben einen Durchmesser von mindestens 1,5 Zentimetern, und pro Blatt können zwei bis vier Kreise markiert werden. Die Kreise sollten gut verteilt sein und vorzugsweise keine größere Ader kreuzen. Beginnen Sie den PTI-Assay mit der Gewinnung der Bakterien, die zur Induktion von PTI verwendet werden.Die verwendeten Pseudomonas-Arten sollten einen bakteriellen Rasen gebildet haben, der auf ein gutes Wachstum hinweist. Gewinnen Sie sie von der Platte, indem Sie sie mit einem sterilen langen Holzstäbchen abkratzen, und resuspendieren Sie sie in etwa 20 bis 25 Milliliter einer 10 Millimolar Magnesiumchloridlösung für Agrobacterium-Zentrifugation.Die Kultur, um die Zellen zu sammeln und in etwa 20 bis 25 Milliliter 10 Millimolar Magnesiumchlorid plus 10 Millimolar MES, pH 5,6, erneut zu resuspendieren, die Zentrifugation wiederholen und anschließend erneut in etwa 20 bis 25 Milliliter der Magnesiumchlorid plus MES-Lösung zu resuspendieren. Nun sind die induzierenden Pseudomonas- und Agrobacterium-Bakterien resuspendiert.Messen Sie die optische Dichte aller drei Kulturen bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern. Stellen Sie die ODS-Werte ein, indem Sie die Zellen mit Magnesiumchlorid für Pseudomonas bzw. mit MES plus Magnesiumchlorid für Agrobacterium verdünnen. Die erforderlichen Endwerte für die OD sind im beigefügten schriftlichen Protokoll angegeben.Ein Gesamtvolumen von 25 Millilitern Bakterienkultur reicht aus, um etwa 40 bis 50 Stellen zu beimpfen. Beginnen Sie nun den Assay, indem Sie die PTI-Induktoren mit einer Ein-Milliliter-Spritze ohne Nadel in die vorab markierten Kreise auf den Blättern einspritzen. Notieren Sie die Reihenfolge, in der die Pflanzen infiltriert wurden, sowie den genauen Zeitpunkt, zu dem die Infiltration nach der Induktion begonnen wurde.Führen Sie die Challenge-Inokulation einige Stunden nach der Induktionsinokulation durch. Gewinnen Sie die für die Challenge-Inokulation erforderlichen Bakterienstämme, wie zuvor für die induzierenden Pseudomonas-Stämme gezeigt. Messen Sie erneut den OD-Wert und stellen Sie die Konzentration der Kulturen gemäß dem beiliegenden GR-Protokoll ein.Beginnen Sie die Challenge-Inokulation sieben Stunden nach der Inducer-Infiltration. Verwenden Sie die folgenden Kombinationen aus Inducer und Challenger. Wählen Sie einen Punkt am Rand des ersten Inokulationskreises als Mittelpunkt des zweiten Inokulationskreises.Führen Sie die Challenge-Infiltration in der gleichen Reihenfolge der Pflanzen durch wie die Induktion. Wenn sich mehrere Stellen auf einem Blatt befinden, achten Sie darauf, dass sich die Infiltrationen nicht überlappen. Abschließend werden serielle Verdünnungen aller in dem Assay verwendeten Kulturen auf KBM- oder LB-Platten mit den geeigneten Antibiotika ausplattiert.Zwei Tage nach der Herausforderungsinokulation kann man die PTI-Antwort beginnen zu bewerten. Zwei Tage nach der Induktions- und Herausforderungsinokulation auf das Auftreten von Zelltod infolge der durch Effektoren ausgelösten Immunität oder ETI an den Stellen achten, die mit PST DC 3000 herausgefordert wurden. Zelltod innerhalb des überlappenden Infiltrationsbereichs weist auf einen Zusammenbruch der PTI hin und sollte als positives Phänotyp gewertet werden. Vier bis fünf Tage nach der Induktions- und Herausforderungsinokulation auf das Auftreten von krankheitsbedingtem Zelltod an den Stellen achten, die mit dem DC 3000 hopQ1-Mutanten oder PS back high erneut herausgefordert wurden. Auf einen Zusammenbruch der PTI achten, der durch krankheitsbedingten Zelltod im überlappenden Infiltrationsbereich angezeigt wird. Die Pflanzen weiter beobachten, bis jene, die nicht in ihrer PTI beeinträchtigt sind, beginnen, Zelltod im überlappenden Infiltrationsbereich zu zeigen.Pflanzen, bei denen FLS2 stillgelegt wurde, weisen zwei Tage nach der Inokulation mit der PFDC-Kombination eine beeinträchtigte PTI auf. Im überlappenden Bereich ist Zelltod zu beobachten, was auf einen Zusammenbruch der PTI hindeutet. Kontrollpflanzen, bei denen kein Gen stillgelegt wurde, wurden ebenfalls mit der PFDC-Kombination inokuliert und zwei Tage nach Durchführung des Assays untersucht. Aufgrund der Herausforderung ist Zelltod außerhalb, jedoch nicht innerhalb des überlappenden Bereichs zu sehen, was auf eine normale PTI-Antwort hinweist.Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man einen auf Zelltod basierenden Test für die durch Pant ausgelöste Immunität oder PTI während dieses Verfahrens durchführt. Es ist wichtig, daran zu denken, die Pflanzen unter den von uns empfohlenen Umweltbedingungen zu halten. Höhere Luftfeuchtigkeit würde die Pflanzen negativ beeinflussen und dazu führen, dass der Test schneller abläuft.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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