Name: Ein In-vitro- FluoroBlok Tumor Invasion Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Tumorzell-Invasion mit dem FluoroBlok-Assay quantitativ messen. Diese Methode nutzt fluoreszenzbasierte Detektion, um das invasive Verhalten von Krebszellen durch Matrigel zu analysieren.

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Post-Kennzeichnung und Messung mittels BD Calcein AM Fluoreszenzfarbstoff Die Zellen sind für die Quantifizierung bezeichnet, nachdem sie durch die BD Matrigel Matrix eingedrungen sind und durch die BD FluoroBlok Membran. Als Ergebnis kann nur Endpunkt Messung der Zell-Invasion erreicht werden. <ol><li> Wachsen Zellen auf ~ 80% Konfluenz. </li><li> Vorbereiten und rehydrieren die Insert-System. <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Entfernen Sie das Paket von -20 ° C Lagerung und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur kommen. </li><li> Öffnen Sie die Folienverpackung und fügen 500 mL warmen (37 ° C) Medien in das Innere des Einsatzes Brunnen. Lassen Sie die Platte für 2 Stunden bei 37 rehydrieren ° C, 5% CO 2. Hinweis: Es ist nicht notwendig, die unbeschichteten BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert-System, das als Zellmigration Steuerung verwendet werden rehydrieren. </li><li> Nach Rehydrierung, entfernen Sie vorsichtig das Medium aus dem Einsatz Brunnen, ohne die Schicht der BD Matrigel Matrix auf der Membran. Das System ist nun einsatzbereit. </li></ol></li><li> Bereiten Zellsuspensionen von trypsinizing Zellmonoschichten und Resuspendieren der Zellen in serumfreiem DMEM mit 5 x 10 4 Zellen / ml. Hinweis: Wenn Sie einen anderen Zelltyp sind, müssen Sie die optimale Aussaatdichte bestimmen. Zur Bestimmung der optimalen Aussaatdichte für Ihren Zelltyp auf einer porösen Oberfläche Wachstum, nutzen eine Reihe von Aussaatdichten (Zellen / cm 2), dass die Träger der Aussaatdichte auf porösen Oberflächen verwendet (dh Flaschen, Schüsseln und Teller). Zum Beispiel, wenn Sie derzeit Samen bei 2,5 x 10 5 Zellen / cm 2, Saatgut an verschiedenen Zell-Konzentrationen zwischen 5 x 10 4 und 5 x 10 5 Zellen / cm 2, um die optimale anfängliche Aussaatdichte bestimmen. </li><li> Add 500 ul Zellsuspension (2,5 x 10 4 Zellen) zur apikalen Kammern. </li><li> Add 750 ul von Lockstoff (5% FBS in DMEM) auf jeden der basalen Kammern, mit der Probe-Ports für den Zugriff. </li><li> Inkubieren Sie die BD BioCoat Tumor Invasion System und die unbeschichtete BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Einlegeplatte für 20-22 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2-Atmosphäre. </li><li> Nach der Inkubation vorsichtig Medium aus dem apikalen Kammern. Dies kann durch flicking den Inhalt in einen Abfallbehälter erreicht werden. Berühren Sie nicht die Unterseite des Einsatzes System. </li><li> Übertragen Sie die Insert-System in einen zweiten 24-Well-Platte mit 500 ul / Vertiefung von 4 pg / mL Calcein AM in HBSS. Inkubation für 1 Stunde bei 37 ° C, 5% CO 2. Die Calcein AM-Lösung ist nicht von der unteren Kammer vor dem Lesen Fluoreszenz entfernt werden, da es sich um eine nicht-fluoreszierenden Vitalfarbstoffs, die in grün fluoreszierendes Calcein durch cytosolische Esterasen umgewandelt wird. </li><li> Fluoreszenz der befallenen Zellen ist bei Wellenlängen von 494/517 nm (Ex / Em) auf einem Bottom-Lektüre fluoreszierenden Platte gelesen. Der Gain-Einstellung müssen empirisch ermittelt werden, aber einen Mittelpunkt erhalten sollten eine ausreichende Ausgangspunkt sein. Ein Gain-Einstellung, die zu hoch ist, kann bis zur Sättigung des Detektors mit stark fluoreszierenden Probe führen, dies kann die Übernahme von aussagekräftigen Ergebnissen zu verhindern. Verwendung von Autogain (falls auf Ihrem Leser unterstützt) wird nicht empfohlen. Eine invertierte Fluoreszenzmikroskop können Sie Ihre Ergebnisse zu überprüfen, ist es besonders hilfreich, dies zu tun das erste Mal, wenn Sie diesen Test. Hinweis: Es ist von größter Bedeutung, dass der Insert-Systeme lesen Sie den richtigen Platte Karte. Informationen zum Einlegen Platte Karten siehe BD Technical Bulletin Nr. 436 auf www.bdbiosciences.com oder kontaktieren BD Technical Support (labware@bd.com). Proper Platte Orientierung ist mit gut A1 in der linken oberen Ecke und die BD Flacon Logo orientiert sich an der rechten Seite, die Platte in das Lesegerät eingelegt wird. </li></ol> Data Reduction Die Daten werden wie in der folgenden Gleichung ausgedrückt: <img src="/files/ftp_upload/1475/1475eqa.jpg" alt="Gleichung" /> Hintergrund kann vor der Berechnung der prozentualen Zellinvasion abgezogen werden RFU = relative Fluoreszenz-Einheiten.

<ol><li>Sethi, G., Ahn, K. S., Pandey, M. K., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celastrol%2C+a+novel+triterpene%2C+potentiates+TNF-induced+apoptosis+and+suppresses+invasion+of+tumor+cells+by+inhibiting+NF-%CE%BAB-regulated+gene+products+and+TAK1-mediated+NF-%CE%9AB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Celastrol, a novel triterpene, potentiates TNF-induced apoptosis and suppresses invasion of tumor cells by inhibiting NF-κB-regulated gene products and TAK1-mediated NF-ΚB activation.</a> Blood. 109, 2727-2735 (2007).</li>
<li>Takada, Y., Kobayashi, Y., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evodiamine+Aboloishes+Constitutive+and+Inducible+NF-%CE%BAB+Activation+by+Inhibiting+I%CE%BAB%CE%B1+Kinase+Activation%2C+Thereby+Suppressing+NF-%CE%BAB-regulated+Antiapoptotic+and+Metastatic+Gene+Expression%2C+Up-regulating+Apoptosis%2C+and+Inhibiting+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evodiamine Aboloishes Constitutive and Inducible NF-κB Activation by Inhibiting IκBα Kinase Activation, Thereby Suppressing NF-κB-regulated Antiapoptotic and Metastatic Gene Expression, Up-regulating Apoptosis, and Inhibiting Invasion.</a> J. Biol. Chem. 280, 17203-17212 (2005).</li>
<li>Harikumar, K. B., Kunnumakkara, A. B., Ahn, K. S., Anand, P., Krishnan, S., Guha, S., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+cysteini+residues+in+I%CE%BAB%CE%B1+kinase+and+NF-%CE%BAB+%28p65%29+by+xanthohumol+leads+to+suppression+of+NF-%CE%BAB-regulated+gene+products+and+potentiation+of+apoptosis+in+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Modification of the cysteini residues in IκBα kinase and NF-κB (p65) by xanthohumol leads to suppression of NF-κB-regulated gene products and potentiation of apoptosis in leukemia cells.</a> Blood. , 113-2003 (2009).</li>
<li>Nair, A. S., Sishodia, S., Ahn, K. S., Kunnumakkara, A. B., Sethi, G., Aggarwal, B. B. D. eguelin <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((an+Akt+Inhibitor%2C+Suppresses+I%CE%9AB%CE%B1+Kinase+Activation+Leading+to+Suppression+of+NF-%CE%BAB-Regulated+Gene+Expression%2C+Potentiation+of+Apoptosis%2C+and+Inhibition+of+Cellular+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">an Akt Inhibitor, Suppresses IΚBα Kinase Activation Leading to Suppression of NF-κB-Regulated Gene Expression, Potentiation of Apoptosis, and Inhibition of Cellular Invasion.</a> J. Immunol. , 177-5612 (2006).</li>
<li>Partridge, J., Qian, S. Quantitative and High-Throughput Screening of Tumor Cell Invasion using a Cell-based Model. Society for Biomolecular Screening 2005 Conference. 2005 Sept 11-15, Geneva, Switzerland, , (2005).</li>
<li>An Improved In Vitro Device For Measuring Cell Invasion and Method for its Formation. US patent. , 6,740,501,B2 (2004).</li>
<li>Flaherty, P., Goldberger, A., Dery, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Fluorescent+Cell+Labeling+on+Tumor+Invasion+and+Screening+of+Anti-Metastatic+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Mole.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Effect of Fluorescent Cell Labeling on Tumor Invasion and Screening of Anti-Metastatic Compounds.</a> Mole. Biol. Cell. 12, 46a-46a (2001).</li>
<li>Flaherty, P., Mannuzza, F., Ilsley, S., Maliakal, J., Wu, M. Screening of Anti-Metastatic Compounds by a Fluorescence Based Tumor Invasion Assay. Screentech 2001 Conference. 2005 Mar 12-16, San Diego, CA, , (2005).</li>
<li>Mannuzza, F., Flaherty, P., Wu, M., Ilsley, S. Development of a Quantitative, High-Throughput Assay System for the Discovery of Anti-Cancer Drugs. Proceedings of the Society for Biomolecular Screening. 1999 Sept 13-16, Edinburgh, SC, UK, , (1999).</li>
</ol>

Die Autoren sind Mitarbeiter von BD Biosciences, dass Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel verwendet produziert.

<table><tbody><tr><td>BD BioCoat Tumorauswanderungssystem</td><td>BD Biosciences</td><td>354165 oder 354166</td><td></td></tr><tr><td>HT-1080- und NIH/3T3-Zellen</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modifiziertes Eagle-Medium (DMEM; serumfrei)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium (DPBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell-Einlegeplatten-System zur Verwendung als Kontrolle der Zellmigration</td><td>BD Biosciences</td><td>351157 oder 351158</td><td></td></tr><tr><td>5 % Fötales Rinderserum in DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Calcein AM Fluoreszenzfarbstoff</td><td>BD Biosciences</td><td>354216 oder 354217</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; ausgeglichene Salzlösung (HBSS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 24-Loch-Platten zur Nachfärbung nach Zellinvasion</td><td>BD Biosciences</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Plattenreader mit Messung von der Unterseite</td><td>PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein in-vitro- fluoroblok tumor invasion assay

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

Das Markenzeichen von metastatischen Zellen ist ihre Fähigkeit, durch die Basalmembran dringen und wandern in andere Teile des Körpers. Die Zellen müssen in der Lage, sowohl sezernieren Proteasen, die zum Abbau der Basalmembran sowie wandern, um zu invasiv. BD BioCoat Tumor Invasion System bietet Zellen mit Bedingungen, die Bewertung ihrer invasive Eigenschaft erlauben<em&gt; In-vitro-</em<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Es besteht aus einem BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Einlegeplatte mit einem 8,0 Mikron Porengröße PET-Membran, die gleichmäßig mit BD Matrigel Matrix beschichtet. Diese einheitliche Schicht von BD Matrigel Matrix dient als rekonstituierte Basalmembran<em&gt; In-vitro-</em&gt; Vermittlung eines den tatsächlichen Hindernis für non-invasive Zellen während der Präsentation eine entsprechende Protein-Struktur, die Invasion zu studieren. Die Beschichtung verschließt die Poren der Membran, blockiert nicht-invasive Zellen aus der Migration durch die Membran. Im Gegensatz dazu sind invasive Zellen in der Lage, sich aus zu lösen und wandern durch die beschichtete Membran. Die Quantifizierung der Zellinvasion kann entweder durch Pre-oder Post-Zell-Invasion Markierung mit einem fluoreszierenden Farbstoff wie DiIC erreicht werden<sub&gt; 12</sub&gt; (3) oder Calcein AM, bzw., und die Messung der Fluoreszenz der eindringenden Zellen. Da die BD FluoroBlok Membran effektiv blockiert den Durchgang von Licht von 490 bis 700 nm bei&gt; 99% Wirkungsgrad, fluoreszenzmarkierte Zellen, die nicht besetzt haben, sind nicht durch einen Boden-reading-Fluoreszenz-Reader erkannt. Allerdings sind Zellen, die an der Unterseite der Membran eingedrungen sind nicht mehr von der Lichtquelle abgeschirmt und sind mit den jeweiligen Platten-Lesegerät erkannt werden. Dieses Video zeigt einen Endpunkt Zellinvasion Assay, mit Calcein AM zu befallenen Zellen zu erkennen.

Dieses Video zeigt, wie man Zellen Invasion durch Zellkultur-Einsätze mit einem Fluoreszenz-basierten Methoden zu messen.

Ein In-vitro- FluoroBlok Tumor Invasion Assay

Das Kennzeichen metastasierender Zellen ist ihre Fähigkeit, die Basalmembran zu durchdringen und in andere Körperregionen zu migrieren. Zellen müssen in der Lage sein, ...

Die Zellinvasion ist ein wichtiger Schritt bei der Krebsprogression und der Angiogenese. In-vitro-Invasionsassays bewerten typischerweise die Fähigkeit von Zellen, eine rekonstituierte Basalmembran wie BD-Matrix oder Gelmatrix abzubauen und durch Zellkulturinserts zu migrieren. Der Tumorinvasionsassay beginnt, wenn Zellen Fluorblock-Inserts hinzugefügt werden, die mit Matri-Gel beschichtet sind.Ein rekonstituiertes Basalmembran-Chemoattractans wird der basalen Kammer hinzugefügt und das System inkubiert. Über Nacht können invasive Zellen die Matri-Gel-Barriere abbauen und durch die Flora-Block-Membran hindurchtreten, eine spezialisierte Membran, die Fluor vor Umgebungslicht schützt. Der Inhalt der apikalen Kammer wird verworfen und der Multiwell-Einsatz in eine zweite Platte mit einem Fluor gegeben.Nach der Inkubation werden lebensfähige Zellen angefärbt und können sowohl visuell als auch mit einem Mikroplatten-Reader detektiert werden. Hallo, ich bin Jeff Partridge von BD Biosciences Discovery LabWare. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für den Floor Block-Tumor-Invasionsassay.Wir verwenden dieses Verfahren, um die Invasion von Tumorzellen durch eine Basalmembran in Richtung des Chemoattractans zu untersuchen. Beginnen wir. Kultivieren Sie die Zellen für den Tumorzell-Invasionsassay bis zu einer Konfluenz von etwa 80 %.In diesem Experiment verwenden wir die Zelllinien HT 10 80 und N NIH three T three. HT 10 80-Zellen weisen eine nachgewiesene Migrations- und Invasionsfähigkeit gegenüber der Matrigel-Barriere im System auf und eignen sich daher gut als positive Kontrollen für den Assay. NIH three T three-Zellen sind nicht invasiv, zeigen jedoch Migrationsverhalten und eignen sich somit gut als negative Kontrollen für dieses Verfahren.Zunächst hydratisieren Sie das System wieder, indem Sie das BD BioCoat Tumor-Invasionssystem-Paket aus der Lagerung bei minus 20 Grad Celsius entnehmen und es auf Raumtemperatur anwärmen lassen. Da der Assay sterile Technik erfordert, lassen Sie den Insert im Zellkulturwerk auf Raumtemperatur kommen. Sobald das Paket Raumtemperatur erreicht hat, öffnen Sie es, um die Basalmembran, durch die Ihre Zellen von Interesse migrieren können, wieder mit Flüssigkeit zu versorgen.Geben Sie 500 Mikroliter warmes Medium in die Innenseite der Insert-Vertiefungen und lassen Sie die Platte zwei Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid rehydrieren. Es ist nicht erforderlich, die unbehandelte BD Falcon Flora Block 24-Mehrfach-Insertplatte zu rehydrieren, da sie als Kontrolle für die Zellmigration verwendet wird, um die Zellen für den Invasionstest vorzubereiten. Behandeln Sie die Zellmonolagen mit Trypsin und resuspendieren Sie die Zellen in serumfreiem DMEM mit einer Dichte von fünf mal 10 hoch vier Zellen pro Milliliter.Wenn ein anderer Zelltyp verwendet wird, muss die optimale Aussaatdichte empirisch bestimmt werden. Nach der Wiederbefeuchtung der beschichteten Platte vorsichtig das Medium aus den Insert-Vertiefungen entfernen, ohne die Schicht aus MA-Gel auf der Membran zu stören. Das System ist nun gebrauchsfertig.Lassen Sie die MA-Gelschicht nicht austrocknen. Um den Zellinvasionsassay zu beginnen, geben Sie 500&nbsp;Mikroliter jeder Zellsuspension in die apikalen Kammern des Tumorinvasionssystems sowohl in den mit Matrigel beschichteten als auch in den unbeschichteten Konfigurationen. Fügen Sie anschließend über die Probeneinlassöffnungen 750&nbsp;Mikroliter Chemoattractans in die basalen Kammern sowohl der beschichteten als auch der unbeschichteten Platten hinzu.Es ist äußerst wichtig, beim Befüllen der basalen Kammern keine Bläschen einzuführen. Als Migrationskontrolle jeweils die Zellsuspension sowie das Chemoattractans in die nicht beschichtete BD Falcon Flora Block 24 Multi WA Insert-Platte geben. Am folgenden Tag das Tumor-Invasions-System und die nicht beschichtete Falcon Flora Block 24 Multi WA Insert-Platte 20 bis 22 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid-Atmosphäre inkubieren.Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, können die Zellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff für Calcium belabelt werden. Entfernen Sie vorsichtig das Medium aus den apikalen Kammern, indem Sie den Inhalt in einen Abfallbehälter abschütteln. Übertragen Sie das Insert-System dann unverzüglich in eine zweite 24-Loch-Platte, die pro Loch 500 Mikroliter einer Lösung mit vier Mikrogramm pro Milliliter enthält.Calcium am in Hank's Balanced Salt Solution. Wiederholen Sie diese Schritte mit dem Migrationskontrollansatz. Inkubieren Sie die Platten eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.Berühren Sie die untere Oberfläche des Insert-Systems nicht. Am Ende der einstündigen Inkubation mit Calcium kann die Fluoreszenz der eindringenden Zellen gemessen werden. Es ist äußerst wichtig, dass die Insert-Systeme unter Verwendung der korrekten Plattenkarte ausgewertet werden.Die korrekte Plattenorientierung sieht vor, dass sich die Vertiefung A1 in der oberen linken Ecke befindet und das BD Falcon-Logo nach rechts ausgerichtet ist, während die Platte in das Gerät eingesetzt wird. Die Fluoreszenz wird bei Wellenlängen von 494 und 517 Nanometern auf einem fluoreszenzbasierten Plattenreader mit Messung von der Unterseite aus gelesen. Sie sollten Ihre Ergebnisse mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop überprüfen, um sicherzustellen, dass die Daten des Plattenreaders mit den visuellen Ergebnissen übereinstimmen. Dies sind typische Daten eines Plattenreaders von einer beschichteten Platte und einer unbeschichteten Kontrollplatte, die aus Zellinvasionsassays der beiden Zelllinien HT 10 80 und NIH 3T3 stammen.Daten aus Wells ohne Zellen stellen den Hintergrund dar, der vor der Berechnung der prozentualen Zellinvasion subtrahiert werden kann. Berechnen Sie die Prozentinvasion mit der folgenden Gleichung. Die Prozentinvasion entspricht dem mittleren Wert der relativen Fluoreszenzeinheiten oder rfu der Zellen, die durch die mit Matrigel beschichtete Membran in Richtung des Chemoattractans gewandert sind.Dieser Wert wird dividiert durch den mittleren RFU von Zellen, die durch die nicht beschichtete VD-Flua-Block-Membran in Richtung des Chemoattractans migriert sind. Anschließend wird dieser Wert mit 100 multipliziert. Dieses Diagramm zeigt den Vergleich der prozentualen Zellinvasion zwischen HT 10 80- und NIH 3T3-Zellen; wie Sie sehen können, sind HT 10 80-Zellen invasiv, während NIH 3T3-Zellen es nicht sind.Wenn die Zellen unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop überprüft werden, stimmen die Ergebnisse mit denen des Plattenlesegeräts überein. Die invasiven HT 10 80-Zellen drangen durch das Matrigel sowie durch die nicht beschichtete Membran ein. Im Gegensatz dazu drangen die nicht-invasiven NIH 3T3-Zellen nicht durch das Matrigel ein, migrierten jedoch durch die nicht beschichtete Membran.Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man einen floralen Block-Tumor-Invasionsassay durchführt. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, die Platten waagerecht zu halten und die Bildung von Blasen so gering wie möglich zu halten. Diese könnten Ihre Ergebnisse beeinflussen.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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