Name: Depletion spezifischer Zellpopulationen durch Ergänzung Depletion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Lernen Sie die Komplement-Depletion zur schnellen und kostengünstigen Isolierung spezifischer Immunzellpopulationen wie T-Zellen. Diese Methode erreicht eine Reinheit von 95–100% und ist ideal für verschiedene Bioassays.

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Ich möchte Sreemanti Basu für die Bereitstellung der Daten für die Abbildung 1 zu danken. Diese Arbeit wurde teilweise durch NIH AI069358 und die BloodCenter Research Foundation unterstützt.

A. Kaninchen Komplement <ol><li> Lager Kaninchen-Komplement sollte bei Raumtemperatur aufgetaut werden und dann in 0,5 und / oder 1 ml Volumen aliquotiert und bei -20-80 ° C für eine langfristige Lagerung. </li><li> Jede Menge ergänzen sollten titriert auf die optimale Arbeitsbedingungen Konzentration zu bestimmen. Typischerweise wird eine Verdünnung von 1.10 bis 01.20 Uhr optimal. </li><li> Kaninchen-Komplement nicht immer vor dem Verkauf, steril abhängig von der endgültigen Verwendung der Zellen, sollte die Ergänzung gefiltert sterilisiert werden, wenn aliquotiert und eingefroren oder vor der Zugabe zu den Zellen. </li></ol> B. Antikörper Selection <ol><li> Nicht alle Antikörper sind bei Komplementaktivierung effektiv, so dass die Antikörper muss zuerst für die Aktivität getestet werden. </li><li> Sowohl Maus und Ratte mAb sind Komplementaktivierung effektiv. </li><li> IgM-Antikörper sind in der Regel die effizienteste für den Einsatz in Komplement-induzierte Zelllyse durch IgG gefolgt. Die IgG-Isotypen am besten für die Komplementaktivierung variieren zwischen den Arten. </li><li> Jeder Antikörper ist für die optimale Nutzung bei einer Zelldichte von 10 7 Zellen / ml titriert werden. </li></ol> C. Grundlegende Protocol <ol><li> Stellen Sie die Start-Zell-Population zu 5 x 10 7 Zellen / ml in Medium mit hitzeinaktiviertem FCS. Das endgültige Volumen der Zellen wird die doppelte Startvolumen werden. Denken Sie daran, einige Zellen speichern, so dass der Abbau quantifiziert werden kann. </li><li> Jeder Antikörper sollte die Zellsuspension bei der richtigen vorgegebenen Konzentrations-oder hinzugefügt werden. Mischen Sie die Zellen auch durch Inversion. </li><li> Berechnen Sie die Höhe der Ergänzung erforderlich. Auftauen ergänzen Lager bei Raumtemperatur. Wenn die Ergänzung ist nicht steril, sterilisieren Sie es mit einem niedrigen Protein-Bindung Spritze Filter. Um die Spritze, fügen Sie einige ml Medium vor der Zugabe des Komplementsystems und Filter direkt in die Röhrchen mit den Zellen und Antikörper. </li><li> Passen Sie das Endvolumen in die Röhre, so dass die Zellen bei 1 x 10 7 Zellen / ml sind. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C für eine Stunde, Mischen alle 15 Minuten. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen und den Überstand verwerfen. </li><li> Waschen mit Medium zweimal. Zelltrümmer werden auf die Seite der Polystyrol-Röhrchen kleben. Tote Zellen und Schmutz können eliminiert werden durch Verwendung einer Zelle Sieb oder durch Dichtegradientenzentrifugation werden. </li><li> Überprüfen Sie die Reinheit der Zellen durch den Vergleich der Zellpopulation von Interesse vor und nach der Entleerung. Durchflusszytometrie und Immunhistochemie sind zwei gute Methoden zur Bestimmung der Reinheit der Zellen. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Bei Verwendung eines mAb, der optimal auf die Aktivierung zu ergänzen, Zell-Depletion nach einer Runde ist größer als 95%. Dies ist in Abbildung 1, wo wir mit Maus-Splenozyten von 32,2% αβ T-Zellen zusammen, wie durch die Expression von TCRβ (eBioscience, San Diego, CA) mittels Durchflusszytometrie detektiert begann gezeigt. Wir erschöpft T-Zellen mit einem mAb spezifisch für Thy1, ein Protein, das von allen T-Zellen exprimiert, nicht aber andere Leukozyten. Der Antikörper wir benutzten, war Y-19 eine Ratte IgG2c 2. Nach dem beschriebenen Verfahren wurde die TCRβ Bevölkerung auf 1,56%, einer mehr als 95% Ermäßigung reduziert. <img src="/files/ftp_upload/1487/1487fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Depletion von THY1 + Milz-T-Zellen durch Komplement-Aktivierung. Insgesamt Maus-Splenozyten wurden durch Homogenisierung der Milz und Lyse von RBC erhalten. Anti-Thy1 und Baby Kaninchen-Komplement an vorgegebenen Konzentrationen wurden zu einem einzigen Zellsuspension von Splenozyten, so dass die Endzellkonzentration 1 x 10 7 Zellen / ml aufgenommen. Nach einer Inkubationszeit von 1 Stunde bei 37 ° C wurden die Zellen zweimal gewaschen und ausgewertet durch Trypanblau-Ausschluss für die Lebensfähigkeit der Zellen. Die Effizienz der Depletion wurde mittels Durchflusszytometrie Vergleich des TCRβ + Zellen vor Erschöpfung (links) und nach Erschöpfung (rechtes Bild) beurteilt. Die horizontale Leiste zeigt positive Färbung und die Zahl über der Bar ist das Prozent positiv.

<ol><li>Janeway, C., Travers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Immune+System+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">The Immune System in Health and Disease.</a> Immunobiology. , Current Biology Limited; Garland Pub. Inc. London; San Francisco; New York. (1994).</li>
<li>Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+activities+of+antibodies+against+brain-associated+T+cell+antigens+II.+Stimulation+of+T+cell-induced+B+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation.</a> Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).</li>
</ol>

Die Reinigung von Zellpopulationen ist ein gemeinsames Verfahren für die Untersuchung ihrer Funktionen erforderlich. Hier beschreiben wir eine schnelle und effektive Methode zum Abbau Zellpopulationen mit Antigen-spezifischen Antikörpern und Komplement Erschöpfung. Die Erschöpfung von Zellpopulation kann erreicht werden, wenn eine Ergänzung aktivierende Antikörper zur Verfügung, um eine Linie spezifischer Marker werden. Hier haben wir die Depletion von T-Zellen unter Verwendung eines mAb spezifisch für Thy1 gezeigt, äußerte ein Protein im Wesentlichen alle T-Zell-Populationen. Wir erschöpft über 95% der αβ T-Zellen und die restlichen Splenozyten wurden von 68% auf 98% erhöht. Dieser Grad an Reinheit der Zellen ist vergleichbar mit anderen Reinigungsverfahren Strategien einschließlich FACS und Magnetic Bead Separation. Ergänzung Erschöpfung ist eine schnelle Technik, die in 1,5 Stunden durchgeführt werden kann, wenn die Start-Zell-Population entsteht. Ein weiterer Vorteil der Ergänzung Erschöpfung ist, dass jedes Labor kann die Technik durchzuführen, weil es nicht erfordern teure Geräte und Reagenzien. Der einzige große Teile der Ausrüstung erforderlich sind, einem Wasserbad und einer Zentrifuge. Kaninchen ergänzen können aus einer Vielzahl von Anbietern zu einem angemessenen Preis erworben werden (siehe Tabelle der Reagenzien) und viele mAb kann von ATTC erworben werden und lokal zur Kostenkontrolle gewachsen. Im Gegensatz dazu erfordert FACS einem Durchflusszytometer mit cell sorting Kapazität, die in den sechs Zahlen und teuer fluoreszenzmarkierten mAb kosten wird. Magnetic Bead Separation ist preisgünstig, sondern erfordert den Kauf eines Magneten und magnetische Kügelchen, die teuer werden kann. Darüber hinaus sind einige Magnetic Bead Separation Strategien erfordern auch den Kauf von Spalten. Das größte Hindernis für die Verwendung von Komplement für Zell-Depletion ist die Verfügbarkeit von Komplement aktivierende mAb mit der Antigen-Spezifität erforderlich. Obwohl von Mensch, Maus und Ratte-Antikörper alle die Fähigkeit, zu ergänzen fix haben, sind einige Isotypen besser als andere. Obwohl IgM aus allen drei Arten ist sehr effektiv bei der Befestigung ergänzen die IgG-Isotypen variieren. So kann jeder mAb muss zunächst in einer Pilotstudie getestet werden, um ihre Wirksamkeit zu bestimmen. Für Antikörper, die nicht sehr effizient, kann zwei Runden ergänzen Erschöpfung ohne Auswirkungen auf die Rentabilität der übrigen Zellpopulationen durchgeführt werden. Als Kosteneinsparungen sollten die Antikörper für eine optimale Wirksamkeit titriert werden. Hinzu kommt, dass die verwendeten Antikörper nicht nötig, gereinigt werden. Hybridomüberstände und Aszites-Flüssigkeit arbeiten genauso effektiv, was besonders praktisch ist, IgM-Antikörper, die schwer zu reinigen sind. Wie mit den Antikörpern, ist es unerlässlich, dass die Ergänzung in einer Pilotstudie titriert werden. Eine zu hohe Konzentration führt zum Verlust der Lebensfähigkeit von nicht gezielten Zellpopulationen führen. Wichtig ist auch, dass die Inkubationszeit nicht mehr als 60 Minuten. In unserem Protokoll haben wir Co-Inkubation der Antikörper und das Komplementsystem zusammen. Allerdings können die Zellen mit dem Antikörper für 15-30 Minuten zu kennzeichnen und gewaschen vor der Zugabe von Komplement. Wenn Sie diese Strategie, stellen Sie sicher an den Antikörper Inkubationen auf Eis, um den Verlust der Zell-Antigen auf der Zelloberfläche zu verhindern durchzuführen, wie dies bei einigen Proteinen durch Patching und Capping oder Rezeptor-Internalisierung. Obwohl hocheffiziente, ist der größte Nachteil bei Erschöpfung Ergänzung zu anderen Methoden verglichen, dass es nicht zur positiven Selektion verwendet werden. So ist es schwierig, Subpopulationen von Zellen zu erhalten. Zum Beispiel würde es schwierig sein, Randzone B-Zellen aus follikulären B-Zellen, die am besten durch FACS erfolgen würde zu reinigen. In dieser Situation könnte die Komplementaktivierung verwendet werden, um T-Zellen führen, um die Anzahl der Zellen, die sortiert reduzieren. Diese Strategie würde die Art der Zeit, die würden Geld sparen und wäre weniger hart auf die Zellen. Da die Aufreinigung von spezifischen Zellpopulationen ist eine häufige Anforderung eine Reihe von Strategien entwickelt worden. Die wichtigsten Vorteile des Komplementsystems Erschöpfung Strategie sind die Erschwinglichkeit, technische Einfachheit und Zeitersparnis.

<table><tbody><tr><td>komplementäres Serum von 3–4 Wochen alten Babykaninchen</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>31061-3</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>verschiedene Hersteller</td><td>verschiedene Artikelnummern</td><td>Ein Inkubator, der auf 37 &amp;#x00B0;C eingestellt ist, kann ebenfalls verwendet werden.</td></tr></tbody></table>

depletion spezifischer zellpopulationen durch ergänzung depletion

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

Die Reinigung des Immunsystems Zellpopulationen ist oft erforderlich, um ihre einzigartigen Funktionen zu studieren. Insbesondere molekulare Ansätze wie real-time PCR und Microarray-Analysen erfordern die Isolierung von Zellpopulationen mit hoher Reinheit. Häufig verwendete Reinigung Strategien beinhalten fluoreszierende activated cell sorting (FACS), Magnetic Bead Separation und ergänzen Erschöpfung. Von den drei Strategien, Angebote ergänzen Erschöpfung die Vorteile der schnell, kostengünstig, schonend für die Zellen und eine hohe Zellausbeute. Das Komplementsystem besteht aus einer großen Anzahl von Plasmaproteinen, die, wenn aktiviert initiieren einer proteolytischen Kaskade die ihren Höhepunkt in der Bildung einer Membran-Angriffs-Komplex, eine Pore auf einer Zelloberfläche führt zum Zelltod bildet zusammen<sup&gt; 1</sup&gt;. Der klassische Weg wird durch IgM-und IgG-Antikörper aktiviert und wurde zunächst als ein Mechanismus zur Abtötung von Bakterien beschrieben. Mit der Erzeugung von monoklonalen Antikörpern (mAb), kann der Komplement-Kaskade verwendet werden, um eine beliebige Zelle der Bevölkerung in eine Antigen-spezifische Weise zu lysieren werden. Depletion von Zellen durch das Komplement-Kaskade wird durch die Zugabe von Komplement Befestigung Antigen-spezifischen Antikörpern und Kaninchen-Komplement an den Start Zellpopulation erreicht. Die Zellen werden für 1 Stunde bei 37 ° C und die lysierten Zellen werden anschließend durch zwei Runden Waschen entfernt. MAb mit einem hohen Wirkungsgrad für Komplementbindungsreaktion in der Regel führen 95-100% des angestrebten Zellpopulation. Je nach der Reinigung Strategie für die gezielte Zellpopulation, kann eine sinnvolle Ergänzung Erschöpfung für die Zell-Reinigung oder zur Anreicherung von Zellpopulationen, die dann durch eine anschließende Verfahren gereinigt werden können verwendet werden.

Um effektiv zu studieren die Funktion des Immunsystems Zellpopulationen ihre Reinigung oft erforderlich ist. Ergänzung Erschöpfung ist eine schnelle und kostengünstige Technik zur Isolierung von Immunzellen Populationen mit hoher Reinheit.

Depletion spezifischer Zellpopulationen durch Ergänzung Depletion

Die Reinigung von Immunzellpopulationen ist häufig erforderlich, um deren spezifische Funktionen zu untersuchen. Insbesondere molekulare Ansätze wie ...

Die Komplementdepletion ist eine schnelle, effektive und kostengünstige Methode zur Reinigung von Immunzellpopulationen. Die Komplementdepletion beginnt damit, dass monoklonale IGM- oder IgG-Antikörper einer Zellpopulation zugesetzt werden, die eine bestimmte Zellart gezielt ansteuern. In diesem Beispiel werden wir T-Zellen zur Depletion gezielt ansteuern.Das Komplementsystem wird dann hinzugefügt, wodurch eine proteolytische Kaskade ausgelöst wird, die zum Absterben der T-Zellen führt. Die Zellpopulation wird anschließend zentrifugiert, gewaschen und filtriert, um tote Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Diese Komplementverarmungsmethode führt typischerweise zur Eliminierung von 95 bis 100 % der gezielten Zellpopulation.Hallo, ich bin Bonnie Dittle. Ich bin Wissenschaftlerin am Blood Research Institute des Blood Center of Wisconsin in Milwaukee. Heute zeige ich Ihnen die Technik der Komplementverarmung, eine schnelle und kostengünstige Methode zur Ausschaltung spezifischer Zellpopulationen.Wir verwenden diese Technik in meinem Labor, um Immunzellpopulationen stark anzureichern, die anschließend für eine Reihe von Bioassays eingesetzt werden, einschließlich solcher, die Zellaktivierung und Analyse der Proteinausprägung beinhalten. Beginnen wir also. Bevor Sie das Experiment starten, bereiten Sie Aliquots von 0,5 oder einem Milliliter Kaninchen-Komplement vor und lagern Sie diese entweder bei minus 20 oder minus 80 Grad Celsius ein.Stellen Sie sicher, dass Sie das Komplement auf eine optimale Verdünnung zwischen 1:10 und 1:20 titrieren. Eine hervorragende kommerzielle Quelle für Komplement, die wir routinemäßig für dieses Verfahren verwenden, stammt von Pereze Biologicals. Maus- und Kaninchen-Monoklonale Antikörper sind im Allgemeinen wirksam bei der Aktivierung des Komplements, jedoch eignen sich nicht alle Antikörper dafür. IgM-Antikörper sind im Allgemeinen am effizientesten für die komplementinduzierte Zelllyse.IgG-Antikörper sind die zweiteffizientesten und werden üblicherweise verwendet, da die meisten monoklonalen Antikörper vom Typ IgG sind. Jeder Antikörper sollte für die optimale Anwendung bei einer Zelldichte von 10^7 Zellen pro Milliliter titriert werden, was empirisch bestimmt wird. Die meisten Antikörper werden im Bereich von 0,1 bis 10 Mikrogramm pro Milliliter eingesetzt. Zur Depletion von T-Zellen aus der Milz verwenden wir einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch für TH1 ist.Um mit der Komplementdepletion zu beginnen, verdünnen Sie die Zellen in Zellkulturmedium, das 5 % hitzeinaktiviertes fetalen Kälberserum enthält, sodass die anfängliche Zellpopulation zwei mal 10 hoch sieben Zellen pro Milliliter beträgt. Beispielsweise sollten fünf mal 10 hoch sieben Zellen in 2,5 Milliliter Medium verdünnt werden. Dieses Zellvolumen entspricht der halben Endvolumenmenge und daher der doppelten Konzentration an Zellen, die während der Depletion verwendet wird, welche dann ein mal 10 hoch sieben Zellen pro Milliliter betragen soll.Zu diesem Zeitpunkt bis zu einer Million Zellen einfrieren, damit die Ausschöpfung am Ende des Experiments quantifiziert werden kann. Zusätzlich die benötigte Menge Komplement bei Raumtemperatur auftauen. Wir haben festgestellt, dass eine Verdünnung von 1:15 geeignet ist, wenn pereze biologicals Kaninchenkomplement für 5 × 10⁷ Zellen verwendet wird; 1,5 mL gefrorenes Eloqua sind ausreichend.Jetzt die geeignete Menge Antikörper zur Zellsuspension hinzufügen und mischen. Um das Komplement zu sterilisieren, verwenden Sie eine Spritzenfilterspitze mit geringer Proteinbindung. Füllen Sie die Spritze mit ein bis zwei Milliliter Medium. Bevor man das Komplement für fünf mal 10 hoch sieben Zellen hinzufügt, benötigen wir 340 Milliliter Komplement für eine Verdünnung von 1 zu 15. Danach filtrieren Sie das Komplement direkt in das Röhrchen, das die Zellen und den Antikörper enthält. Stellen Sie nun das Endvolumen im Röhrchen so ein, dass die Zellen eine Konzentration von ein mal 10 hoch sieben Zellen pro Milliliter aufweisen.Als Nächstes lassen Sie die Zellen eine Stunde lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius inkubieren. Denken Sie daran, die Zellen alle 15 Minuten durch vorsichtiges Umstülpen zu mischen. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen mit einer Geschwindigkeit, die die Vitalität nicht beeinträchtigt.Danach wieder im Abzug das Überstand verwerfen. Anschließend die Zellen zweimal mit je 10 Milliliter Medium waschen. Achten Sie darauf, wie sich das zelluläre Trümmermaterial sammelt und teilweise an den Wänden der Polystyrolgefäße haftet.Nach der letzten Waschung filtrieren Sie die Zellen durch einen sterilen Nylon-Zellfilter mit 70&nbsp;Mikron. Überprüfen Sie abschließend die Zellreinheit, indem Sie die Population der Zielzellen vor und nach der Depletion mittels Durchflussanalyse vergleichen.Die Durchflusszytometrie und die Immunhistochemie sind bevorzugte Methoden, um die Zellreinheit vor der Experimentierung zu bestimmen. Wenn ein monoklonaler Antikörper verwendet wird, der sehr effizient Komplement aktiviert, führt die erste Runde der Komplementverarmung zu einer Verminderung der Zellen um mehr als 95 %. Als Beispiel maßen wir mittels Durchflusszytometrie den Anteil von Alpha-Beta-T-Zellen in einer Maus-Pleura-Zellpräparation und fanden heraus, dass diese nach der Komplementverarmung mit Anti-CD51, das von allen T-Zellen, jedoch nicht von anderen Leukozyten exprimiert wird, 32,2 % Alpha-Beta-T-Zellen enthielt. Die TCR-Beta-Population wurde um 95 % reduziert und betrug abschließend 1,56 %.Ich habe Ihnen soeben eine schnelle und effektive Methode zur Ausschaltung spezifischer Zellpopulationen mithilfe antigenspezifischer Antikörper in der Komplementverarmung gezeigt. Beachten Sie beim Durchführen dieses Verfahrens, jeden Antikörper auf Wirksamkeit zu testen und Ihr Komplement in einem Vorversuch zu titrieren, bevor Sie beginnen. Das war's.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

JoVE Journal

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