Depletion spezifischer Zellpopulationen durch Ergänzung Depletion

Die Komplementdepletion ist eine schnelle, effektive und kostengünstige Methode zur Reinigung von Immunzellpopulationen. Die Komplementdepletion beginnt damit, dass monoklonale IGM- oder IgG-Antikörper einer Zellpopulation zugesetzt werden, die eine bestimmte Zellart gezielt ansteuern. In diesem Beispiel werden wir T-Zellen zur Depletion gezielt ansteuern.

Das Komplementsystem wird dann hinzugefügt, wodurch eine proteolytische Kaskade ausgelöst wird, die zum Absterben der T-Zellen führt. Die Zellpopulation wird anschließend zentrifugiert, gewaschen und filtriert, um tote Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Diese Komplementverarmungsmethode führt typischerweise zur Eliminierung von 95 bis 100 % der gezielten Zellpopulation.

Hallo, ich bin Bonnie Dittle. Ich bin Wissenschaftlerin am Blood Research Institute des Blood Center of Wisconsin in Milwaukee. Heute zeige ich Ihnen die Technik der Komplementverarmung, eine schnelle und kostengünstige Methode zur Ausschaltung spezifischer Zellpopulationen.

Wir verwenden diese Technik in meinem Labor, um Immunzellpopulationen stark anzureichern, die anschließend für eine Reihe von Bioassays eingesetzt werden, einschließlich solcher, die Zellaktivierung und Analyse der Proteinausprägung beinhalten. Beginnen wir also. Bevor Sie das Experiment starten, bereiten Sie Aliquots von 0,5 oder einem Milliliter Kaninchen-Komplement vor und lagern Sie diese entweder bei minus 20 oder minus 80 Grad Celsius ein.

Stellen Sie sicher, dass Sie das Komplement auf eine optimale Verdünnung zwischen 1:10 und 1:20 titrieren. Eine hervorragende kommerzielle Quelle für Komplement, die wir routinemäßig für dieses Verfahren verwenden, stammt von Pereze Biologicals. Maus- und Kaninchen-Monoklonale Antikörper sind im Allgemeinen wirksam bei der Aktivierung des Komplements, jedoch eignen sich nicht alle Antikörper dafür. IgM-Antikörper sind im Allgemeinen am effizientesten für die komplementinduzierte Zelllyse.

IgG-Antikörper sind die zweiteffizientesten und werden üblicherweise verwendet, da die meisten monoklonalen Antikörper vom Typ IgG sind. Jeder Antikörper sollte für die optimale Anwendung bei einer Zelldichte von 10^7 Zellen pro Milliliter titriert werden, was empirisch bestimmt wird. Die meisten Antikörper werden im Bereich von 0,1 bis 10 Mikrogramm pro Milliliter eingesetzt. Zur Depletion von T-Zellen aus der Milz verwenden wir einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch für TH1 ist.

Um mit der Komplementdepletion zu beginnen, verdünnen Sie die Zellen in Zellkulturmedium, das 5 % hitzeinaktiviertes fetalen Kälberserum enthält, sodass die anfängliche Zellpopulation zwei mal 10 hoch sieben Zellen pro Milliliter beträgt. Beispielsweise sollten fünf mal 10 hoch sieben Zellen in 2,5 Milliliter Medium verdünnt werden. Dieses Zellvolumen entspricht der halben Endvolumenmenge und daher der doppelten Konzentration an Zellen, die während der Depletion verwendet wird, welche dann ein mal 10 hoch sieben Zellen pro Milliliter betragen soll.

Zu diesem Zeitpunkt bis zu einer Million Zellen einfrieren, damit die Ausschöpfung am Ende des Experiments quantifiziert werden kann. Zusätzlich die benötigte Menge Komplement bei Raumtemperatur auftauen. Wir haben festgestellt, dass eine Verdünnung von 1:15 geeignet ist, wenn pereze biologicals Kaninchenkomplement für 5 × 10⁷ Zellen verwendet wird; 1,5 mL gefrorenes Eloqua sind ausreichend.

Jetzt die geeignete Menge Antikörper zur Zellsuspension hinzufügen und mischen. Um das Komplement zu sterilisieren, verwenden Sie eine Spritzenfilterspitze mit geringer Proteinbindung. Füllen Sie die Spritze mit ein bis zwei Milliliter Medium.

Bevor man das Komplement für fünf mal 10 hoch sieben Zellen hinzufügt, benötigen wir 340 Milliliter Komplement für eine Verdünnung von 1 zu 15. Danach filtrieren Sie das Komplement direkt in das Röhrchen, das die Zellen und den Antikörper enthält. Stellen Sie nun das Endvolumen im Röhrchen so ein, dass die Zellen eine Konzentration von ein mal 10 hoch sieben Zellen pro Milliliter aufweisen.

Als Nächstes lassen Sie die Zellen eine Stunde lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius inkubieren. Denken Sie daran, die Zellen alle 15 Minuten durch vorsichtiges Umstülpen zu mischen. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen mit einer Geschwindigkeit, die die Vitalität nicht beeinträchtigt.

Danach wieder im Abzug das Überstand verwerfen. Anschließend die Zellen zweimal mit je 10 Milliliter Medium waschen. Achten Sie darauf, wie sich das zelluläre Trümmermaterial sammelt und teilweise an den Wänden der Polystyrolgefäße haftet.

Nach der letzten Waschung filtrieren Sie die Zellen durch einen sterilen Nylon-Zellfilter mit 70 Mikron. Überprüfen Sie abschließend die Zellreinheit, indem Sie die Population der Zielzellen vor und nach der Depletion mittels Durchflussanalyse vergleichen.

Die Durchflusszytometrie und die Immunhistochemie sind bevorzugte Methoden, um die Zellreinheit vor der Experimentierung zu bestimmen. Wenn ein monoklonaler Antikörper verwendet wird, der sehr effizient Komplement aktiviert, führt die erste Runde der Komplementverarmung zu einer Verminderung der Zellen um mehr als 95 %. Als Beispiel maßen wir mittels Durchflusszytometrie den Anteil von Alpha-Beta-T-Zellen in einer Maus-Pleura-Zellpräparation und fanden heraus, dass diese nach der Komplementverarmung mit Anti-CD51, das von allen T-Zellen, jedoch nicht von anderen Leukozyten exprimiert wird, 32,2 % Alpha-Beta-T-Zellen enthielt. Die TCR-Beta-Population wurde um 95 % reduziert und betrug abschließend 1,56 %.

Ich habe Ihnen soeben eine schnelle und effektive Methode zur Ausschaltung spezifischer Zellpopulationen mithilfe antigenspezifischer Antikörper in der Komplementverarmung gezeigt. Beachten Sie beim Durchführen dieses Verfahrens, jeden Antikörper auf Wirksamkeit zu testen und Ihr Komplement in einem Vorversuch zu titrieren, bevor Sie beginnen. Das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.