Name: Isolierung von Maus Bauchhöhle Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-28T16:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Bauchhöhlenzellen aus Mäusen für immunologische Studien. Diese Methode liefert 5 bis 10 Millionen Zellen pro Tier und ermöglicht die Analyse von B-Zellen, Makrophagen und T-Zellen.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch NIH AI069358 und die BloodCenter Research Foundation unterstützt.

<ol><li> Vor Beginn des Prozesses, müssen die folgenden Punkte zu sein, gesammelt und aufbereitet: <ul><li> Eis </li><li> 5ml Spritze mit 27g Nadel </li><li> 5ml Spritze mit 25G-Nadel </li><li> Styropor-Block und Stifte für die Montage der Maus </li><li> Tablett, auf dem der Montageblock platziert werden können </li><li> Schere und Pinzette </li><li> Sammelröhrchen </li><li> 70% Ethanol </li><li> PBS mit 3% fötalem Kälberserum (FCS) (Pre gekühlt und auf Eis gehalten) </li></ul></li><li> Euthanize der Maus, sprühen sie mit 70% Ethanol und montieren Sie ihn auf den Styropor-Block auf den Rücken. </li><li> Mit einer Schere und Pinzette schneiden die Außenhaut des Bauchfells und ziehen Sie es vorsichtig zurück in die Innenhaut Auskleidung der Bauchhöhle aussetzen. </li><li> Inject 5 ml eiskaltem PBS (mit 3% FCS) in die Bauchhöhle mit einer 27g Nadel. Drücken Sie die Nadel langsam in das Bauchfell man aufpassen, nicht zu durchstechen alle Organe. </li><li> Nach der Injektion sanft massieren das Bauchfell an alle angeschlossenen Zellen in der PBS-Lösung zu entfernen. </li><li> Legen Sie eine 25 g Nadel-, Kegel auf, an einer 5 ml Spritze in das Bauchfell und sammeln die Flüssigkeit während der Bewegung die Spitze der Nadel vorsichtig, um ein Verstopfen durch das Fettgewebe oder anderen Organen. Sammeln Sie so viel Flüssigkeit wie möglich und Einzahlung der gesammelten Zellsuspension in Röhrchen auf Eis nach dem Entfernen der Nadel von der Spritze gehalten. Optional: Wiederholen Sie Schritt 4-6 </li><li> Machen Sie einen Schnitt in der inneren Haut des Bauchfells und während hält die Haut mit einer Pinzette einen Kunststoff Pasteurpipette auf die verbleibenden Flüssigkeit aus dem Hohlraum sammeln. </li><li> Wenn in Schritt 6 oder 7 sichtbaren Kontamination mit Blut festgestellt wird dann das verunreinigte Probe zu verwerfen. </li><li> Spin der gesammelten Zellsuspension bei 1500 RPM für 8 Minuten, den Überstand verwerfen und Zellen in das gewünschte Medium oder PBS für das Zählen. </li></ol> Alternative Protokoll Thioglycolat erhalten hervorgerufen Makrophagen: Diese Methode wird verwendet, um eine höhere Ausbeute an Makrophagen zu erhalten. <ol><li> Inject 5 ml 3% (w / v) Brewer Thioglycolat Medium (7) in die Bauchhöhle von jeder Maus. </li><li> Warten Sie 3-5 Tage und fahren bis 1 oben für die Entnahme der Zellen Schritt. </li></ol> Im Vergleich zu den nonelicited Ansatz können etwa 10 mal mehr Makrophagen gesammelt werden. Die einzige Sorge ist, dass Makrophagen durch dieses Verfahren erhalten in einigen ihrer physiologischen Eigenschaften unterscheiden. Repräsentative Ergebnisse: Von einem unmanipulierten Maus können 5 bis 10.000.000 Bauchhöhle Zellen mit einer guten Isolierung Protokoll erreicht werden. Unter allen lebenden Zellen, 50-60% B-Zellen sind, sind ca. 30% Makrophagen und 5-10% T-Zellen (Abb. 1). <img src="/files/ftp_upload/1488/1488fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Phänotyp von Zellen aus der Bauchhöhle getrennt. Nach der Isolierung der Bauchhöhle Zellen wurden mit anti-Maus-FITC TCRβ, B220-PE-Texas-Rot, CD11b-Pazifik blau, CD23-PE-Cy7 und CD5-APC. Vertreter durchflusszytometrischen Plots zeigen Prozentsätze der B-und T-Zellen (a), Makrophagen (b), B1 und B2-Zellen (c) und B1a und B1b-Zellen (d).

<ol><li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. , (2008).</li>
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<li>Mc Daniel, L. S., Benjamin, W. H., Forman, C., Briles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+clearance+by+anti-phosphocholine+antibodies+as+a+mechanism+of+protection+in+experimental+pneumococcal+bacteremia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Blood clearance by anti-phosphocholine antibodies as a mechanism of protection in experimental pneumococcal bacteremia.</a> J. Immunol. 133, 3308-3312 (1984).</li>
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<li>Mercolino, T. J., Arnold, L. W., Hawkins, L. A., Haughton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+mouse+peritoneum+contains+a+large+population+of+Ly-1%2B+%28CD5%29+B+cells+that+recognize+phosphatidyl+choline%3A+relationship+to+cells+that+secrete+hemolytic+antibody+specific+for+autologous+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Normal mouse peritoneum contains a large population of Ly-1+ (CD5) B cells that recognize phosphatidyl choline: relationship to cells that secrete hemolytic antibody specific for autologous erythrocytes.</a> J. Exp. Med. 168, 687-698 (1988).</li>
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<li>Hoover, D. L., Nacy, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+to+kill+Leishmania+tropica%3A+Defective+intracellular+killing+of+amastigotes+by+macrophages+elicited+with+sterile+inflammatory+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation to kill Leishmania tropica: Defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents.</a> J. Immunol. 132, 1487-1491 (1984).</li>
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<li>Baumgarth, N., Herman, O. C., Jager, G. C., Brown, L. E., Herzenberg, L. A., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1+and+B-2+cell-derived+immunoglobulin+M+antibodies+are+nonredundant+components+of+the+protective+response+to+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">B-1 and B-2 cell-derived immunoglobulin M antibodies are nonredundant components of the protective response to influenza virus infection.</a> J. Exp. Med. 192, 271-280 (2000).</li>
<li>Berland, R., Wortis, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+functions+of+B-1+cells+with+notes+on+the+role+of+CD5%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 253-300 (2002).</li>
</ol>

Isolation der Bauchhöhle Zellen ist eine wichtige Technik für die Untersuchung von verschiedenen Immunzellen, vor allem Makrophagen und spezifische B-Zell-Subpopulationen. Obwohl dies ein einfacher Vorgang, es gibt einige wichtige Schritte beteiligt. Vorhandensein von kontaminierenden Blut in den gesammelten Proben sollte vermieden werden, um eine reine Bauchhöhle Zellpopulation zu erhalten. Euthanasie durch Genickbruch sollte sorgfältig durchgeführt werden, um Kontamination mit Blut in der Bauchhöhle zu vermeiden. Alternativ CO 2 eingesetzt werden kann. Darüber hinaus sollte im Laufe des Verfahrens die richtige Pflege genommen, um zu vermeiden Punktion der Blase oder anderer Organe in der Bauchhöhle werden. Wiederherstellen meisten der injizierten Flüssigkeit ist auch wichtig, um die Zelle zu erhalten. Dieses Verfahren ist weit verbreitet, um Makrophagen Biologie seit moderate Zahl der Einwohner studieren, können nicht stimulierten Makrophagen leicht aus der Bauchhöhle gewonnen werden, im Gegensatz zu den mühsamen Aufgabe der Differenzierung myeloischer Vorläuferzellen zu reifen Makrophagen in vitro mit Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (8 , 9). Die Makrophagen-Ausbeute aus der Bauchhöhle kann durch die Verwendung der Thioglycolat Erhebung Methode verbessert werden, obwohl Thioglycolat Nutzung physiologischen Eigenschaften der Makrophagen (7) verändern könnten. B-Zellen sind ein wichtiger Teil unseres Immunsystems spielen eine entscheidende Rolle bei angeborenen und erworbenen Immunität. Unter den verschiedenen B-Zell-Subpopulationen umfassen B1-Zellen eine einzigartige Subpopulation von B-Zellen in der angeborenen Immunität, Autoimmunität und Immunregulation beteiligt. B1-Zellen sind in erster Linie in der Bauchhöhle und sind selbst Nachfüllen. Sie sind einer der wichtigsten Produzenten von natürlichen IgM, die die erste Verteidigungslinie gegen eine Reihe von Viren und Bakterien (10-12) zur Verfügung stellt. B1-Zellen sind auch eine wichtige Quelle von IL-10 (6), die eine wichtige Zytokin in der Immunregulation beteiligt ist. Obwohl mehrere Studien mit dem B1-Zellen ausgeübt worden sein, noch gibt es Spielraum für die weitere Auswertung ihrer gegensätzlichen Funktionen, die speziell ihre regulatorische Rolle. Bauchhöhle Zellisolation Methode bietet die einzigartige Möglichkeit, die Funktionen des B1-Zellen zu studieren.

<table><tbody><tr><td>Thioglykollat-Medium, Brewer modifiziert</td><td>BD Biosciences</td><td>211716</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von maus bauchhöhle cells

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

Die Bauchhöhle ist eine Membran-gebundene und mit Flüssigkeit gefüllte Bauchhöhle von Säugetieren, die die Leber, die Milz, die meisten von den Magen-Darm-Trakt und anderen Innereien enthält. Es birgt eine Reihe von Immunzellen einschließlich Makrophagen, B-Zellen und T-Zellen. Die Anwesenheit einer großen Zahl von naiven Makrophagen in die Bauchhöhle macht es zu einem bevorzugten Standort für die Sammlung von naiven Gewebe Makrophagen (1). Die Bauchhöhle ist auch wichtig, die Studie von B-Zellen durch die Anwesenheit eines einzigartigen Bauchhöhle ansässige B-Zell-Untergruppe als B1-Zellen zusätzlich zur konventionellen B2-Zellen bekannt. B1-Zellen werden in B1a und B1b-Zellen, die durch die Oberflächenexpression von CD11b und CD5 unterschieden werden können unterteilt. B1-Zellen sind eine wichtige Quelle der natürlichen IgM frühzeitige Schutz vor einer Vielzahl von Erregern (2-4). Diese Zellen sind autoreaktive in der Natur (5), sondern wie sie kontrolliert werden, um Autoimmunität zu verhindern, ist noch nicht vollständig verstanden. Im Gegenteil, CD5<sup&gt; +</sup&gt; B1a-Zellen besitzen einige regulatorische Eigenschaften durch ihre IL-10 produzieren Kapazität (6). Daher sind Bauchhöhle B1-Zellen eine interessante Zellpopulation aufgrund ihrer unterschiedlichen Funktion und viele unadressierte Fragen mit ihrer Entwicklung und Regulierung verbundenen studieren. Die Isolierung der Bauchhöhle ansässigen Immunzellen ist wegen des Fehlens einer definierten Struktur im Inneren der Bauchhöhle tricky. Unser Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung von lebensfähigen Immunzellen aus der Bauchhöhle von Mäusen, die dann für phänotypische Analyse mittels Durchflusszytometrie und für verschiedene biochemische und immunologische Tests eingesetzt werden kann.

Die Bauchhöhle bei Säugetieren enthält verschiedene Immunzellen Bevölkerung entscheidend für angeborenen Immunantwort. Eine effiziente Isolierung Methode ist für biochemische und funktionelle Analyse dieser Zellen erforderlich ist. Hier bieten wir eine umfassende Methode zur Isolierung von Bauchhöhle Zellen in der Maus.

Isolierung von Maus Bauchhöhle Cells

Die Peritonealhöhle ist ein membranbegrenzter und flüssigkeitsgefüllter Bauchraum von Säugetieren, der die Leber, die Milz und den größten Teil des Gastrointestinaltraktus enthält ...

Die Isolierung von Zellen aus der Bauchhöhle beginnt mit der Befestigung einer euthanasierten Maus auf dem Rücken. Die äußere Haut des Peritoneums wird eingeschnitten und vorsichtig zurückgezogen, um die innere Haut freizulegen. PBS mit 3 % FBS wird in die Bauchhöhle injiziert, und das Peritoneum wird sanft massiert. Die Flüssigkeit, die Peritonealzellen enthält, wird gesammelt und in ein 15-Milliliter-Gefäß auf Eis gegeben.Die Zellen werden einmal gewaschen und auf einem Hämozytometer gezählt. Hallo, ich bin Oji aus dem Labor von Dr. Bon am Blood Research Institute des Blood Center of Wisconsin. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Isolierung von Zellen aus der Bauchhöhle einer Maus.Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um Zellen für verschiedene phänotypische, biochemische und immunologische Assays zu gewinnen. Hauptsächlich interessieren wir uns für peritoneale B-Zellpopulationen. Beginnen wir also.Bevor Sie mit der Isolierung von Immunzellen aus der Bauchhöhle beginnen, bereiten Sie alle notwendigen Materialien vor. Sammeln Sie zunächst einen Eisbehälter, eine Fünf-Milliliter-Spritze mit einer 27-Gauge-Nadel, eine Fünf-Milliliter-Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel, einen Styroporblock und Nadeln zum Fixieren der Maus. Außerdem benötigen Sie ein Tablett zur Aufnahme des Fixierblocks, eine Schere, eine Pinzette sowie Sammelröhrchen vor der Sektion.Kühlen Sie PBS mit 3 % Fötales Rinderserum im Voraus ab. Halten Sie diese und die Sammelröhrchen während des gesamten Experiments nach Verabreichung des Anästhetikums und der geeigneten Euthanasie auf Eis. Besprühen Sie die Maus mit 70 % Ethanol und befestigen Sie sie auf dem Rücken auf einem Styroporblock oder einem Präparationsbrett. Schneiden Sie mit Pinzette und Schere die äußere Haut des Peritoneums auf.Ziehen Sie die Haut vorsichtig zurück, um die innere Haut freizulegen, die die Bauchhöhle auskleidet. Achten Sie darauf, keine Organe zu verletzen, und schieben Sie langsam eine 27-Gauge-Nadel in das Peritoneum. Injizieren Sie fünf Milliliter eiskaltes PBS in die Bauchhöhle.Massieren Sie nun vorsichtig das Peritoneum, um die Zellen vom Peritonealwall zu lösen und in die PBS-Lösung abfallen zu lassen. Befestigen Sie dann an dieser Stelle eine 5-mL-Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel, wobei die Schräge nach oben zeigt, und führen Sie die Nadel in das Peritoneum ein. Sammeln Sie so viel Flüssigkeit wie möglich, um die Zellausbeute zu erhöhen.Währenddessen die Spitze vorsichtig bewegen, um zu verhindern, dass Fettgewebe oder andere Organe die Nadel verstopfen. Die Nadel entfernen und die Zellsuspension in Sammelröhrchen aus Polypropylen auffangen. Die restliche Flüssigkeit aus der Körperhöhle sammeln, indem ein Schnitt in die innere Haut des Peritoneums gemacht wird.Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut auseinanderzuhalten, während Sie mit einer Kunststoff-Hintertippette die restliche Flüssigkeit aufsammeln. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension abschließend acht Minuten lang bei 1500 U/min, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in fünf Milliliter PBS. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.Mithilfe der Trypanblau-Ausschlussmethode lässt sich die Bestimmung der Zellanzahl ermöglichen. Typischerweise können fünf bis zehn Millionen Zellen aus der Peritonealhöhle eines nicht manipulierten Mäusen isoliert werden. 50 bis 60 % der gesamten Zellpopulation stellen B-Zellen dar.Etwa 40 % werden Makrophagen und Granulocyten sein, und fünf bis 10 % werden T-Zellen sein. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Zellen aus der Bauchhöhle einer Maus isoliert. Bei Verwendung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Menge an Blut in der Population der Bauchhöhlenzellen zu begrenzen, indem die Mäuse sorgfältig euthanasiert werden und keine Organe in der Bauchhöhle durchstochen werden.Stellen Sie sicher, dass Sie alle Proben entsorgen, die mit Blut kontaminiert wurden. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

isolation-of-mouse-peritoneal-cavity-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Ein hoch gereinigte Präparation von Mauslunge dendritischen Zellen beschrieben wird. Besonderer Nachdruck wird auf die Isolierung von konventionellen dendritischen Zellen Teilmenge gegeben.

Isolierung von Maus Lung Dendritischen Zellen

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung von Lymphozyten aus einem entnommenen Peyer-Pflaster der Maus. Die isolierten Lymphozyten können für weitere Analysen verwendet werden.

Isolierung von Lymphozyten aus einem Peyer-Pflaster der Maus

Dieses Video zeigt eine Peritonealspülungsmethode zur Isolierung reifer Bindegewebs-Mastzellen aus der Bauchhöhle erwachsener Mäuse. Nach der Isolierung einer Mischung aus primären Immunzellen aus der Bauchhöhle erfolgt die selektive Proliferation von Mastzellen unter geeigneten Kulturbedingungen.

Eine Technik zur Isolierung primärer Mastzellen aus einer Peritonealhöhle der Maus

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung von zerebralen Perizyten aus einem Mäusegehirn. Die isolierten Zellen werden in perizytenspezifischen Medien kultiviert, um die Perizytenproliferation zu fördern.

Isolierung und Kultivierung von zerebralen Perizyten der Maus

Es gibt ein wachsendes Interesse für das Verständnis der immunologischen Funktionen von bestimmten Subpopulationen von Zellen in Peyer-Plaques (PP), die primären induktiven Seiten des Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe. Hier beschreiben wir parallele Protokolle zur Herstellung PP Einzelzelle Zubereitungen für die durchflusszytometrische Analyse und PP Kryoschnitten für Immunfärbung.

Isolierung und Immunfärbung Lymphozyten und dendritische Zellen aus Murine Peyer-Plaques

Wir beschreiben hier ein einfaches Protokoll zur Isolierung von Maus-Peritonealmakrophagen. Diesem Verfahren folgt eine RNA-Extraktion, um eine Genexpressionsanalyse bei der Stimulation von Toll-like-Rezeptoren durchzuführen.

Isolierung von Murine Peritonealmakrophagen zur Durchführung Genexpressionsanalyse Nach Toll-like Rezeptoren Stimulation

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu isolieren und kultivieren murinen peritonealen Mastzellen. Wir beschreiben auch zwei Protokolle für ihre funktionelle Charakterisierung: eine fluoreszierende Imaging der intrazellulären freien Ca2 + Konzentration und eine Degranulation Assay anhand der kolorimetrischen Quantifizierung der veröffentlichten β-Hexosaminidase.

Isolierung von Mastzellen Bauchfell abgeleitet und deren funktionelle Charakterisierung mit Ca2 +-imaging und Degranulation Assays

Enterochromaffinen (EG) Zellen umfassen eine kleine Teilmenge der Magen-Darm-Epithelzellen. EG-Zellen elektrisch erregbar sind und Serotonin, noch Schwierigkeiten bei der Kultivierung und Identifizierung von EG-Zellen physiologische Studien beschränkt haben. Die hier vorgestellte Methode stellt eine Primärkultur Modell zur Untersuchung von Einzelzellen EG zugänglich durch Elektrophysiologie.

Ganze Zelle Elektrophysiologie des primären kultivierten murinen Enterochromaffinen Zellen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung des murinen intestinalen Mesenchyms, einschließlich Telozyten, vor. Diese können für verschiedene Anwendungen verwendet werden, z. B. für die Kokultur mit Organoiden aus der Maus oder vom Menschen, um das Wachstum zu unterstützen und die Situation im ursprünglichen Gewebe besser widerzuspiegeln.

Isolierung des murinen intestinalen Mesenchyms, was zu einer hohen Ausbeute an Telozyten führt

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultivierung von aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen aus Mäusen.

Isolierung und Kultivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark aus Mäusen

In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur magnetischen Bead-basierten Isolierung von murinen Endothelzellen aus dermalen lymphatischen Kapillaren beschrieben. Die isolierten lymphatischen Endothelzellen können für nachgelagerte In-vitro-Experimente und Proteinexpressionsanalysen verwendet werden.

Isolierung von dermalen lymphatischen Endothelzellen der Maus

Lernen Sie die Isolierung von Bauchhöhlenzellen aus Mäusen für immunologische Studien. Diese Methode liefert 5 bis 10 Millionen Zellen pro Tier und ermöglicht die Analyse von B-Zellen, Makrophagen und T-Zellen.

Isolierung von Maus Bauchhöhle Cells

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