Isolierung von Maus Bauchhöhle Cells
January 28th, 2010
Die Bauchhöhle bei Säugetieren enthält verschiedene Immunzellen Bevölkerung entscheidend für angeborenen Immunantwort. Eine effiziente Isolierung Methode ist für biochemische und funktionelle Analyse dieser Zellen erforderlich ist. Hier bieten wir eine umfassende Methode zur Isolierung von Bauchhöhle Zellen in der Maus.
Die Isolierung von Zellen der Bauchhöhle beginnt mit der Montage einer euthanasierten Maus auf ihrem Rücken. Die Außenhaut des Bauchfells wird durchtrennt und um die Innenhaut sanft freizulegen, wird PBS mit 3%FBS in die Bauchhöhle injiziert und das Bauchfell sanft massiert. Die Flüssigkeit mit den Peritonealzellen wird gesammelt und in ein 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis gegeben.
Die Zellen werden einmal gewaschen und auf einem Hämozytometer gezählt. Hallo, ich bin Oji aus Dr. Bons Labor am Blood Research Institute of Blood Center of Wisconsin. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Isolierung von Zellen aus der Bauchhöhle einer Maus.
Dieses Verfahren nutzen wir in unserem Labor, um Zellen für verschiedene phänotypische, biobiochemische und immunologische Assays zu gewinnen. In erster Linie interessieren wir uns für peritoneale B-Zell-Populationen. Also lasst uns loslegen.
Bevor Sie mit der Isolierung von Immunzellen aus der Bauchhöhle beginnen, bereiten Sie alle notwendigen Materialien vor. Beginnen Sie damit, einen Eiskübel, eine Fünf-Milliliter-Spritze mit einer 27-Gauge-Nadel, eine Fünf-Milliliter-Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel, einen Styroporblock und Stecknadeln für die Montage der Maus zu sammeln. Ein Tablett zur Aufnahme des Montageblocks, der Schere und Pinzette sowie der Entnahmeröhrchen vor der Dissektion.
Pre-Chill PBS mit 3% fötalem Kälberserum. Lassen Sie diese und die Entnahmeröhrchen während des gesamten Experiments nach Verabreichung eines Anästhetikums und einer angemessenen Euthanasie auf Eis, besprühen Sie die Maus mit 70%igem Ethanol und montieren Sie sie auf ihrem Rücken auf einen Styroporblock oder ein Sezierkissen. Schneiden Sie mit Pinzette und Schere die Außenhaut des Bauchfells auf.
Ziehen Sie die Haut vorsichtig zurück, um die innere Haut freizulegen, die die Bauchhöhle auskleidet. Achten Sie darauf, keine Organe zu punktieren, und schieben Sie langsam eine 27-Gauge-Nadel in das Bauchfell. Injizieren Sie fünf Milliliter eiskaltes PBS in die Bauchhöhle.
Massieren Sie nun sanft das Bauchfell, um die Zellen zu ermutigen, sich von der Peritonealwand zu lösen und in die PBS-Lösung zu fallen. Setzen Sie dann eine Fünf-Milliliter-Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel mit der abgeschrägten Seite nach oben an dieser Stelle an und führen Sie die Nadel in das Bauchfell ein. Sammle so viel Flüssigkeit wie möglich, um deine Zellausbeute zu steigern.
Bewegen Sie dabei vorsichtig die Spitze, um zu verhindern, dass Fettgewebe oder andere Organe die Nadel verstopfen. Entfernen Sie die Nadel und entleeren Sie die Zellsuspension in Sammelröhrchen aus Polypropylen. Sammeln Sie die restliche Flüssigkeit aus der Kavität, indem Sie einen Schnitt in die Innenhaut des Bauchfells machen.
Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut auseinander zu halten, während Sie eine hintere Plastikpipette verwenden, um die verbleibende Flüssigkeit aufzufangen. Zum Schluss zentrifugieren Sie die Zellsuspension acht Minuten lang bei 1500 U/min, verwerfen den Überstand und resuspendieren die Zellen in fünf Millilitern PBS. Zählung der Zellen auf einem Hämozytometer.
Die Verwendung des trippenblauen Ausschlusses ermöglicht die Bestimmung der Zellzahl. In der Regel können fünf bis 10 Millionen Zellen der Bauchhöhle aus einer unmanipulierten Maus isoliert werden. 50 bis 60 % der gesamten Zellpopulation sind B-Zellen.
Etwa 40 % sind Makrophagen und Granulastellen, und fünf bis 10 % sind T-Zellen. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Zellen der Bauchhöhle von einer Maus isolieren können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Blutmenge in der Zellpopulation der Bauchhöhle zu begrenzen, indem die Mäuse vorsichtig eingeschläfert werden und keine Organe in der Bauchhöhle punktiert werden.
Achten Sie darauf, alle Proben zu entsorgen, die mit Blut kontaminiert werden. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
Überblick
Dieser Artikel stellt eine detaillierte Methode zur Isolierung von Peritonealhöhlenzellen aus Mäusen vor, die für die Untersuchung von Immunantworten unerlässlich ist. Das Verfahren ist so konzipiert, dass die Integrität der Zellpopulationen für nachfolgende Analysen gewährleistet wird.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Immunologie
- Zellbiologie
- Biochemie
Hintergrund
- Die Peritonealhöhle beherbergt verschiedene Immunzelltypen.
- Diese Zellen spielen eine wichtige Rolle bei angeborenen Immunantworten.
- Isolierungsmethoden sind entscheidend für funktionelle und biochemische Studien.
- Das Verständnis dieser Zellen kann die immunologische Forschung unterstützen.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Isolierung von Peritonealhöhlenzellen bereitzustellen.
- Die Untersuchung von Immunzellpopulationen bei Mäusen zu erleichtern.
- Die Genauigkeit nachfolgender immunologischer Assays zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Euthanasieren der Maus und Vorbereitung auf die Dissektion.
- Injektion von PBS mit 3% FBS in die Peritonealhöhle.
- Sammeln der Flüssigkeit mit den Peritonealzellen.
- Zentrifugieren und Zählen der isolierten Zellen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von 5 bis 10 Millionen Peritonealhöhlenzellen.
- Es wurde festgestellt, dass 50-60% der Zellen B-Zellen sind.
- Ungefähr 40% sind Makrophagen und Granulozyten.
- 5 bis 10% der Zellen sind T-Zellen.
Schlussfolgerungen
- Die Methode ist effektiv zur Isolierung von Immunzellen aus der Peritonealhöhle.
- Sorgfältige Euthanasie und Dissektion sind entscheidend, um Blutkontamination zu vermeiden.
- Dieses Verfahren kann auf verschiedene immunologische Studien angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Isolation of peritoneal cavity immune cells enables early-stage target validation by providing access to phenotypically defined B-cell and macrophage subsets. This supports mechanistic de-risking in discovery pipelines by supplying reproducible primary cell inputs for functional assays. The method enhances predictive confidence in lead identification through standardized recovery of immune populations relevant to immunomodulatory drug screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of B1a and B1b cell subsets for therapeutic hypothesis testing in autoimmunity and infection models.
- Scientific Value: Provides naïve tissue-resident macrophages for pathway clarification in innate immune response studies.
- Operational Value: Supports biological de-risking through consistent isolation of immune cell populations for target engagement screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for phenotypic analysis by flow cytometry and biochemical assays.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via controlled cell yield (5–10 million cells per mouse).
- Operational Value: Enables reliable compound evaluation through quantitative recovery of B cells (50–60%), macrophages (40%), and T cells (5–10%).
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by isolating autoreactive B1 cells and regulatory IL-10-producing subsets.
- Operational Value: Facilitates translational biomarker alignment through isolation of natural IgM-secreting B1 cells.
- Operational Value: Enables preclinical continuity by providing primary immune cells for mechanistic follow-up in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by supplying primary immune cells for target validation, assay development, and preclinical mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through isolation of defined B-cell and macrophage subsets.
- Screening: Delivers assay readiness via standardized cell isolation and recovery of viable immune populations.
- Analytics: Enables quantitative comparison of cell subsets using hemocytometer counting and viability exclusion methods.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical validation through isolation of B1 cells linked to natural immunity and regulation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for immune cell sourcing across immunology and oncology discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through access to phenotypically characterized immune subsets.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined cell yield and subset distribution.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in immunomodulator screening.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through reliable primary cell inputs for functional assay panels.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dissection and aseptic technique to prevent organ puncture and blood contamination.
- Dependent on instrumentation including syringes, needles, centrifuge, and hemocytometer for cell processing and counting.
- Necessitates cross-team standardization of PBS/FBS preparation and cold-chain handling to ensure consistency.
- Involves adaptation considerations when applying to disease models that alter peritoneal cavity cellularity.
- Limited by the need for careful euthanasia and dissection to avoid blood contamination, which compromises sample integrity.
