Isolierung von Maus Bauchhöhle Cells
28. Januar 2010
Die Bauchhöhle bei Säugetieren enthält verschiedene Immunzellen Bevölkerung entscheidend für angeborenen Immunantwort. Eine effiziente Isolierung Methode ist für biochemische und funktionelle Analyse dieser Zellen erforderlich ist. Hier bieten wir eine umfassende Methode zur Isolierung von Bauchhöhle Zellen in der Maus.
Die Isolierung von Zellen aus der Bauchhöhle beginnt mit der Befestigung einer euthanasierten Maus auf dem Rücken. Die äußere Haut des Peritoneums wird eingeschnitten und vorsichtig zurückgezogen, um die innere Haut freizulegen. PBS mit 3 % FBS wird in die Bauchhöhle injiziert, und das Peritoneum wird sanft massiert. Die Flüssigkeit, die Peritonealzellen enthält, wird gesammelt und in ein 15-Milliliter-Gefäß auf Eis gegeben.
Die Zellen werden einmal gewaschen und auf einem Hämozytometer gezählt. Hallo, ich bin Oji aus dem Labor von Dr. Bon am Blood Research Institute des Blood Center of Wisconsin. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Isolierung von Zellen aus der Bauchhöhle einer Maus.
Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um Zellen für verschiedene phänotypische, biochemische und immunologische Assays zu gewinnen. Hauptsächlich interessieren wir uns für peritoneale B-Zellpopulationen. Beginnen wir also.
Bevor Sie mit der Isolierung von Immunzellen aus der Bauchhöhle beginnen, bereiten Sie alle notwendigen Materialien vor. Sammeln Sie zunächst einen Eisbehälter, eine Fünf-Milliliter-Spritze mit einer 27-Gauge-Nadel, eine Fünf-Milliliter-Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel, einen Styroporblock und Nadeln zum Fixieren der Maus. Außerdem benötigen Sie ein Tablett zur Aufnahme des Fixierblocks, eine Schere, eine Pinzette sowie Sammelröhrchen vor der Sektion.
Kühlen Sie PBS mit 3 % Fötales Rinderserum im Voraus ab. Halten Sie diese und die Sammelröhrchen während des gesamten Experiments nach Verabreichung des Anästhetikums und der geeigneten Euthanasie auf Eis. Besprühen Sie die Maus mit 70 % Ethanol und befestigen Sie sie auf dem Rücken auf einem Styroporblock oder einem Präparationsbrett. Schneiden Sie mit Pinzette und Schere die äußere Haut des Peritoneums auf.
Ziehen Sie die Haut vorsichtig zurück, um die innere Haut freizulegen, die die Bauchhöhle auskleidet. Achten Sie darauf, keine Organe zu verletzen, und schieben Sie langsam eine 27-Gauge-Nadel in das Peritoneum. Injizieren Sie fünf Milliliter eiskaltes PBS in die Bauchhöhle.
Massieren Sie nun vorsichtig das Peritoneum, um die Zellen vom Peritonealwall zu lösen und in die PBS-Lösung abfallen zu lassen. Befestigen Sie dann an dieser Stelle eine 5-mL-Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel, wobei die Schräge nach oben zeigt, und führen Sie die Nadel in das Peritoneum ein. Sammeln Sie so viel Flüssigkeit wie möglich, um die Zellausbeute zu erhöhen.
Währenddessen die Spitze vorsichtig bewegen, um zu verhindern, dass Fettgewebe oder andere Organe die Nadel verstopfen. Die Nadel entfernen und die Zellsuspension in Sammelröhrchen aus Polypropylen auffangen. Die restliche Flüssigkeit aus der Körperhöhle sammeln, indem ein Schnitt in die innere Haut des Peritoneums gemacht wird.
Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut auseinanderzuhalten, während Sie mit einer Kunststoff-Hintertippette die restliche Flüssigkeit aufsammeln. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension abschließend acht Minuten lang bei 1500 U/min, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in fünf Milliliter PBS. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
Mithilfe der Trypanblau-Ausschlussmethode lässt sich die Bestimmung der Zellanzahl ermöglichen. Typischerweise können fünf bis zehn Millionen Zellen aus der Peritonealhöhle eines nicht manipulierten Mäusen isoliert werden. 50 bis 60 % der gesamten Zellpopulation stellen B-Zellen dar.
Etwa 40 % werden Makrophagen und Granulocyten sein, und fünf bis 10 % werden T-Zellen sein. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Zellen aus der Bauchhöhle einer Maus isoliert. Bei Verwendung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Menge an Blut in der Population der Bauchhöhlenzellen zu begrenzen, indem die Mäuse sorgfältig euthanasiert werden und keine Organe in der Bauchhöhle durchstochen werden.
Stellen Sie sicher, dass Sie alle Proben entsorgen, die mit Blut kontaminiert wurden. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
Übersicht
Dieser Artikel stellt eine detaillierte Methode zur Isolierung von Zellen aus der Bauchhöhle von Mäusen vor, die für die Untersuchung von Immunantworten unerlässlich ist. Das Verfahren ist so konzipiert, dass die Integrität der Zellpopulationen für nachfolgende Analysen gewährleistet bleibt.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Zellbiologie
- Biokemie
Hintergrund
- Die Bauchhöhle beherbergt verschiedene Typen von Immunzellen.
- Diese Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei angeborenen Immunantworten.
- Isolationsmethoden sind entscheidend für funktionelle und biochemische Untersuchungen.
- Das Verständnis dieser Zellen kann der immunologischen Forschung zugutekommen.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Isolierung von Zellen aus der Bauchhöhle bereitstellen.
- Die Untersuchung von Immunzellpopulationen bei Mäusen erleichtern.
- Die Genauigkeit nachfolgender immunologischer Assays verbessern.
Verwendete Methoden
- Das Maus euthanisieren und für die Sektion vorbereiten.
- PBS mit 3 % FBS in die Bauchhöhle injizieren.
- Die Flüssigkeit mit den Peritonealzellen sammeln.
- Die isolierten Zellen zentrifugieren und zählen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreich 5 bis 10 Millionen Zellen aus der Bauchhöhle isoliert.
- Festgestellt, dass 50–60 % der Zellen B-Zellen sind.
- Etwa 40 % sind Makrophagen und Granulozyten.
- 5 bis 10 % der Zellen sind T-Zellen.
Schlussfolgerungen
- Die Methode ist wirksam zur Isolierung von Immunzellen aus der Bauchhöhle.
- Sorgfältige Tötung und Sektion sind entscheidend, um eine Kontamination mit Blut zu vermeiden.
- Dieses Verfahren kann auf verschiedene immunologische Studien angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Isolierung von Immunzellen aus der Bauchhöhle ermöglicht eine Validierung von Zielstrukturen im Frühstadium, indem sie Zugang zu phänotypisch definierten B-Zell- und Makrophagen-Subpopulationen bietet. Dies trägt zur mechanistischen Risikominderung in Entdeckungspipelines bei, indem reproduzierbare primäre Zellpräparationen für funktionelle Assays bereitgestellt werden. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Identifizierung von Leitstrukturen durch standardisierte Gewinnung immunologisch relevanter Zellpopulationen für die immunmodulatorische Wirkstoffscreening.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von B1a- und B1b-Zellsubpopulationen zur Überprüfung therapeutischer Hypothesen in Modellen der Autoimmunität und Infektion.
- Wissenschaftlicher Wert: Stellt naive, im Gewebe residente Makrophagen für die Aufklärung von Signalwegen in Studien zur angeborenen Immunantwort bereit.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch die konsistente Isolierung von Immunzellpopulationen für die Target-Engagement-Screenings.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für die phänotypische Analyse mittels Durchflusszytometrie und biochemischen Assays vor.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch kontrollierte Zellausbeute (5–10 Millionen Zellen pro Maus).
- Operativer Wert: Ermöglicht zuverlässige Wirkstoffevaluierung durch quantitative Rückgewinnung von B-Zellen (50–60 %), Makrophagen (40 %) und T-Zellen (5–10 %).
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Modellierung krankheitsrelevanter Systeme durch die Isolierung autoreaktiver B1-Zellen und regulatorischer, IL-10-produzierender Subpopulationen.
- Operationaler Wert: Erleichtert die translationale Biomarker-Abstimmung durch die Isolierung natürlicher IgM-sekretierender B1-Zellen.
- Operationaler Wert: Ermöglicht präklinische Kontinuität, indem primäre Immunzellen für mechanistische Nachuntersuchungen in Krankheitsmodellen bereitgestellt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows, indem sie primäre Immunzellen für die Zielvalidierung, Assay-Entwicklung und präklinische mechanistische Studien bereitstellt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch die Isolierung definierter B-Zell- und Makrophagen-Subpopulationen.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch standardisierte Zellisolierung und Gewinnung lebensfähiger Immunpopulationen.
- Analytik: Ermöglicht den quantitativen Vergleich von Zellsubpopulationen mittels Zellzählung mit dem Hämozytometer und Methoden zur Bestimmung der Lebensfähigkeit durch Ausschlussfarbstoffe.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Validierung durch die Isolierung von B1-Zellen, die mit natürlicher Immunität und Regulation assoziiert sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Kapazität zur Beschaffung von Immunzellen für immunologische und onkologische Entdeckungsprogramme.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Target-Validierung durch Zugang zu phänotypisch charakterisierten Immunzellsubpopulationen.
- Operationaler Wert: Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch definierte Zellausbeute und Verteilung der Subpopulationen.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen durch Verringerung mechanistischer Unschärfen bei der Immunmodulator-Screening.
- Portfolio-Implikation: Risikoadjustierte Priorisierung durch zuverlässige primäre Zellpräparationen für funktionelle Testpanels.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der murinen Dissektion und aseptischer Technik, um Organperforationen und Blutkontaminationen zu vermeiden.
- Benötigt Instrumente wie Spritzen, Nadeln, Zentrifuge und Hämozytometer für die Zellverarbeitung und -zählung.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Herstellung von PBS/FBS und der Kühlkette voraus, um Konsistenz zu gewährleisten.
- Erfordert Anpassungen, wenn das Verfahren auf Krankheitsmodelle angewendet wird, die die Zellzusammensetzung der Peritonealhöhle verändern.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit einer sorgfältigen Tötung und Dissektion, um Blutkontaminationen zu vermeiden, die die Probenintegrität beeinträchtigen könnten.
