Name: Lentivirus Produktion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-02T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Lernen Sie die Lentivirus-Produktion in humanen 293T-Zellen durch Transfektion, Ultrazentrifugation und Titerbestimmung per Fluoreszenz. Diese Methode ermöglicht effiziente Gendelivery für Forschung und Therapie.

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Sandler Asthma Basic Research Center (SABRE) Sandler Foundation

Teil 1: Transfektion von HEK 293 Zellen zu Lentiviren Produce * 24 Stunden vor der Transfektion Platte 2,5 x 10 6 Zellen in eine 10 cm Schüssel für eine Konfluenz von 50-70% am nächsten Tag. <ol><li> Starten Sie dieses Protokoll durch die Vorbereitung der DNA, mit denen man später transfizieren wird man die Zellen auf Viren zu machen. Zuerst verdünnten FuGENE 6 Transfektionsreagenz Roche, ein Lipid-Reagenz, dass Zellen nehmen DNA zu machen. In einem 1,5 ml Röhrchen, Pipette 30μl FuGENE 6 in 600ul serum-freiem Medium (SFDMEM). Achten Sie darauf, nicht zulassen FuGENE Touch der Seite der Röhre, wie sie in das Medium abgegeben wird. Lassen Sie diese FuGENE und SFDMEM mischen und inkubieren bei Raumtemperatur für 5 Minuten. </li><li> In die Kappe des Röhrchens mischen 4 ug lentiviralen Plasmid mit 4 g je 3 rd Generation viraler Vektoren Verpackung (pMDL, pRSV und pVSV-G). Die lentiviralen Plasmid enthält die DNA des Virus wird in das Genom jeder Zelle infiziert es einzufügen, während die Verpackung Vektoren Gene für alle anderen Proteine ​​benötigt, um ein Lentivirus make enthalten. </li><li> Schließen Sie den Deckel und mischen durch Invertieren des Röhrchens ein paar mal. </li><li> Inkubieren 15-20 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Pipette gesamte Inhalt des Röhrchens in 293 Teller. Vorsichtig mischen durch Kippen Platte hin und her. </li><li> Bringen Sie die Zellen in den Inkubator und ermöglichen virale Produktion für 48-96 Stunden vor der Ernte weiter. </li><li> Während der Inkubation transkribieren die 293-Zellen die DNA von Interesse aus der lentiviralen Plasmid, wodurch eine RNA-Kopie des lentiviralen konstruieren. Sie haben auch transkribieren und übersetzen die Gene in der Verpackung Vektoren in virale Proteine. Diese Proteine ​​gehen, um Viren, die die RNA-Version Ihres lentivirale Konstrukt, das das Virus übertragen umkehren wird und in das Genom aller Zellen, infiziert zu machen. </li></ol> Teil 2: Lentivirale Ernte <ol><li> Nach Inkubationszeit, nehmen Zellen aus dem Inkubator und mit einem Einweg-, 10ml Spritze mit dem Überstand, das nun den Virus zu entfernen. Es wird etwa 10 ml des Überstands werden. </li><li> Bringen Sie ein 0.45 Spritze Filter auf die Spitze und Filter des Virus in einer Beckman Ultrazentrifuge Röhre. Der Filter lässt nur Viren und nicht-Zellen passieren. </li><li> Vor dem Entsorgen, inkubieren alle Virus-produzierenden Zellen, Kultur-Platten, Spritzen und Filter in 10% Bleichmittel für 45 Minuten. </li></ol> Teil 3: Lentivirale Konzentration über Ultrazentrifugation <ol><li> Laden Zentrifugenröhrchen in SW-41Ti oder SW-28 Rotor Eimer. </li><li> Verwenden Sie serumfreiem DMEM für alle Virus-haltigen Gleichgewicht Rohre innerhalb 0.2g. </li><li> Seal geschlossen Laufschaufeln und Haken sie auf den Rotor, bevor Rotor im Inneren der Ultrazentrifuge </li><li> Spin des Virus für 90 Minuten in einer Ultrazentrifuge bei 4 ° C bei 25.000 rpm in einem SW-41Ti Rotor oder 24.000 rpm in einem SW-28 Rotor. </li><li> In einer Gewebekultur Kapuze, invertieren Röhrchen kopfüber an Überstand in einen Behälter mit 10% Bleichmittel gießen. </li><li> Verwenden Sie einen Kimwipe, um überschüssige Flüssigkeit rund um die Pellets zu absorbieren und das Röhrchen in eine bequeme Ablage für nicht mehr als fünf Minuten. </li><li> Zum erneuten Aussetzung der viralen Pellet, einen Filter verwenden, Spitze bis 100 ul sterilem PBS auf das Rohr hinzufügen, dann Pipette auf und ab etwa 20-mal. </li><li> Lassen Sie das Virus bei 4 ° C über Nacht Resuspension abzuschließen. Man kann virale preps bei 4 Grad lagern für ca. 1 Woche und bei -80 Grad bis zu einem Jahr. Denken Sie daran, alle leeren Tuben mit 10% Bleiche vor dem Wegwerfen zu behandeln. </li><li> Wenn man das virale prep länger als die 1 Woche nutzen will, um minimal Aliquots von 5-20 &amp;mgr; l für zukünftige Experimente und 1 Aliquot von 3 bis 5μl für die Titration. Freeze und speichern Sie die Aliquots bei minus 80. </li></ol> Teil 4: Lentivirale Titration mittels Durchflusszytometrie <ol><li> Der nächste Schritt ist, um das virale Titer mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Diese Methode funktioniert nur in Fällen, in denen die lentiviralen Plasmid enthält einen fluoreszierenden Reporter-Gen. Die Idee ist, dass, wenn das Virus eine Zelle infiziert, es dem lentiviralen Plasmid-DNA führt in die Zelle das Genom. Die infizierte Zelle wird dann transkribieren und übersetzen die Gene die Sie in der lentiviralen Plasmid, und wenn Sie einen fluoreszierenden Reporter-Gen enthalten, infizierte Zellen fluoreszieren. Die Höhe der Fluoreszenz repräsentiert die Potenz oder Titer des Virus. </li><li> Für jeden viralen Bestand an titriert werden, verdünnte 3 ul konzentrierter Virus in 1,5 ml komplettem Medium (DMEM, Pen-Strep, Glutamin, FBS). </li><li> In Brunnen 1-6 in einer einzigen Zeile einer 96-Well-Platte, die folgenden Verdünnungsreihen: alle 6 Vertiefungen werden 100 ul von kompletten DMEM-Medien. Um die erste und fügen 100 &amp;mgr; von Medien ohne Virus (dies Ihr ungefärbten Kontrolle), die zweite und mit 100 ul der verdünnten Virus (das entspricht to1 ml unverdünnter Virus), den dritten und mit 100 ulder Mischung aus der zweiten und zur vierten gut 100 ml ab dem 3. gut, in den fünften und fügen 100 &amp;mgr; vom 4. gut, und die sechste und mit 100 ul aus dem 5. gut. Schließlich nehmen 100 ul aus dem 6. und und entsorgen in Bleichmittel. Eine Verdünnungsreihe wurde durchgeführt, wo jeder gut die Hälfte des Volumens des Virus im Vergleich zu dem davor. </li><li> Bringen Sie das Gesamtvolumen in alle Vertiefungen zu 200 ul. Beachten Sie, dass diese nur angedeutet Verdünnungen, die gut funktionieren sollte Titrierung konzentriertesten Viren sind. Wenn der Virus ist gering im Titer oder unkonzentriert, den Sie benötigen, um die Verdünnungen anzupassen. </li><li> Gönnen Sie unbenutzte verdünnten Virus mit 10% Bleichmittel für 45 Minuten vor dem Wegwerfen in eine biohazard Abfallbehälter. </li><li> Add ~ 15.000 gesunde, sich aktiv teilenden 293-Zellen zu jedem der 6 Vertiefungen. Ein einziger 96-Well-Platte kann auf 16 virale Titer preps werden. </li><li> Return-Zellen bis 37 Grad Inkubator mit 5% CO 2 und damit Infektion für mindestens 48 Stunden vor. </li><li> Nach der Inkubation werden die Zellen für Reporter Ausdruck (in unserem Fall Fluoreszenz) mit einem Durchflußzytometer analysiert. Virale Partikel werden durch die Prozent der fluoreszierenden Zellen pro Vertiefung quantifiziert. </li></ol> Berechnen Sie die Anzahl der infektiösen Einheiten pro ml nach folgender Formel: <div style="text-align:center;"> (Anzahl der Zellen pro Vertiefung am Tag der Infektion X-Reporter positive Zellen) X 1000 ______________________________________________________ ml Vektor hinzugefügt, um auch </div> Teil 5: Repräsentative Ergebnisse: Nach einer 48-stündigen Inkubationszeit nach der Transfektion sollten die Platte von 293 Zellen bei etwa 90% fluoreszierende werden. Ein hoher Prozentsatz der fluoreszierenden Zellen ist ein Hinweis auf einen hohen Anteil an Virus-produzierenden Zellen. Nach Zentrifugation wird das virale Pellet kaum sichtbar, wenn Resuspendieren. Dies ist normal, da das Pellet ist klar und sehr klein. Bei der Interpretation Durchflusszytometer Ergebnisse, beachten Sie, dass kann man nur erreichen, genaue Titer Berechnungen, wenn infizierte (Fluoreszenz)-Zellen haben nicht mehr als eine virale Integration pro Zelle aufgenommen. Um sicherzustellen, dass dies der Fall ist, verwenden Sie Zellen mit &lt;15% Infektionsrate für die Berechnungen. Zellen mit höheren Infektionsraten wahrscheinlich mehrere virale Integranten pro Zelle aufgenommen. Die Verdünnungen in Schritt 2 vorgeschlagen sollten mehrere Proben in diesem Bereich der Infektion ergeben. Idealerweise sollten mehrere Proben auf eine Titration Grundstück (linear-Linie), von dem Sie das letzte Titer berechnen erzeugen können, aber Sie können Titer berechnen mit Hilfe einer einzigen Probe, wenn nötig. Man kann erwarten, Titer von 1,0 x 10 7 TU / ml für un-konzentriert Virus und 1,0 x 10 8 TU / ml für konzentriertes Virus.

<ol><li>Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+concentration+of+pseudotyped+HIV-1-based+gene+transfer+vectors.%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors.</a> Gene Therapy. , 72-7211 (2000).</li>
<li>Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>DMEM HEK 293T-Zellen Penicillin-Streptomycin Glutamin Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung FBS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6-Transfektionsreagenz pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorbleiche</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10-cm-Zellkulturschalen 96-Well-Zellkulturschalen </td><td>Falcon BD</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Mehrkanalpipette</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gefilterte Pipettenspitzen</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen Spritze Spritzenfilter (0,45-&amp;mu;m)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brutschrank für Zellkultur mit 5 % CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman SW41T.I-Rotor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman-Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Array</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lentivirus produktion

Lentivirus Production

RNA-Interferenz (RNAi) ist ein System von Gen-Silencing in lebenden Zellen. In RNAi, homologe Gene in der Reihenfolge auf short interfering RNAs (siRNA) sind in der post-transkriptionellen Staat zum Schweigen gebracht. Kurze Haarnadel-RNAs, Vorstufen von siRNA, kann mit Hilfe Lentivirus, so dass für RNAi in einer Vielzahl von Zelltypen werden. Lentiviren, wie das Human Immunodeficiency Virus, sind in der Lage zu infizieren sowohl teilende und nicht-teilenden Zellen. Wir beschreiben ein Verfahren, das zum Paket Lentiviren. Verpackung bezieht sich auf die Vorbereitung der zuständige Virus aus der DNA-Vektoren. Lentiviralen Vektor Produktion Systeme basieren auf einer &#39;split&#39; System, wo die natürlichen viralen Genoms in einzelne Helfer Plasmid-Konstrukte wurde spaltet. Diese Aufspaltung der verschiedenen viralen Elementen in vier getrennten Vektoren vermindert die Gefahr der Schaffung von ein Replikations-fähig Virus durch zufällige Rekombination des lentiviralen Genoms. Hier sind ein Vektor, der die shRNA von Interesse und drei Verpackung Vektoren (p-VSVG, pRSV, pMDL) transient in humane 293-Zellen transfiziert. Nach mindestens einer 48-stündigen Inkubationszeit wird das Virus enthaltende Überstand geerntet und aufkonzentriert. Schließlich ist Virustiter von Reporter (fluoreszierend) Ausdruck mit einem Durchflußzytometer bestimmt.

Um Lentiviren, sind DNA-Vektoren in humanen 293-Zellen transfiziert. Nach der Ernte und die Konzentration der Überstand wird Virustiter mittels Fluoreszenz-Ausdruck mit einem Durchflußzytometer bestimmt.

Lentivirus Produktion

Die RNA-Interferenz (RNAi) ist ein System zum Gene Silencing in lebenden Zellen. Bei der RNAi werden Gene, die in ihrer Sequenz homolog zu kurzen interferierenden RNAs (siRNA) sind, ...

Dieses Verfahren beginnt mit der Transduktion von 293T-Zellen mit Lentivirus, Plasmid und viralen Verpackungsvektoren; das virale Überstand wird nach einer Inkubationszeit von mindestens 48 Stunden gewonnen. Der Überstand wird filtriert und mittels Ultrazentrifugation konzentriert. Das virale Pellet wird mit PBS resuspendiert, um die Virus-Titer zu erhalten: verdünnen Sie zunächst das konzentrierte Virus in komplettem Medium und führen Sie anschließend eine serielle Verdünnung durch, um Zellen mit Lentivirus zu infizieren.Hallo, ich bin Shein Wong aus dem Labor von Michael McManus am Diabetes-Zentrum der University of California San Francisco. Ich bin Michael McManus. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung von Lentiviren.Wir verwenden dieses Verfahren im Labor, um Lentiviren für die RNA-Interferenz herzustellen. Beginnen wir also. Um mit diesem Protokoll zu starten, bereiten Sie die DNA vor, mit der die 2 9 3 T-Zellen transfiziert werden sollen.Vermischen Sie zunächst das FU-Gen-Sechs-Transfektionsreagenz in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen, indem Sie 30 Mikroliter Fuji Sechs mit 600 Mikrolitern serumfreiem Medium versetzen. Achten Sie darauf, dass Fuji beim Zugabevorgang die Röhrchenwand nicht berührt. Inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie anschließend im Röhrchenverschluss vier Mikrogramm lentivirales Plasmid mit 1,33 Mikrogramm zusammen.Jeder Vektor zur Verpackung von Viren der dritten Generation. Das Lentiviralplasmid enthält die DNA. Das Virus wird sich in das Genom jeder Zelle einfügen, die es infiziert, während die Verpackungsvektoren die Gene für alle anderen Proteine enthalten, die zur Herstellung eines Lentivirus erforderlich sind. Schließen Sie den Deckel und mischen Sie durch mehrmaliges Umstülpen des Röhrchens.Die DNA und das Transfektionsreagenz 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nun ist es an der Zeit, 293-Zellen mit der vorbereiteten DNA zu transfizieren. Verwenden Sie Zellen, die Sie 24 Stunden zuvor angesät haben und die eine Konfluenz von 50 bis 70 % erreicht haben. Geben Sie im Gewebekulturwerk alle vorbereitete DNA auf die 293-Platte und mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Platte sanft hin und her kippen. Stellen Sie die Zellen anschließend in den Inkubator zurück und lassen Sie die virale Produktion vor der Ernte 48 bis 96 Stunden lang weiterlaufen. Während der Inkubation produzieren die 293-Zellen Lentiviren, deren Genome eine RNA-Kopie Ihrer DNA des Interesses enthalten.Jetzt ist es an der Zeit, das Virus zu sammeln. Nehmen Sie Ihre Zellen aus dem Inkubator. Halten Sie im Gewebekulturhaubenbereich einen 0,4- oder Fünf-Mikrometer-Spritzenfilter, eine Einweg-10-Milliliter-Spritze und ein UltraClear-Beckman-Zentrifugenröhrchen bereit.Entfernen Sie mit der Einwegspritze den Überstand, der nun das Virus enthält. Bringen Sie einen 0,45-Mikron-Spritzenfilter an der Spitze an und filtrieren Sie das Virus in ein UltraClear-Beckman-Zentrifugenröhrchen. Der Filter lässt nur Viren und keine Zellen durch. Inkubieren Sie anschließend alle virusproduzierenden Zellen, bevor Sie sie verwerfen.Behandeln Sie Kulturplatten, Spritzen und Filter 45 Minuten lang in 10 % Bleichlauge. Nachdem Sie das Virus gesammelt und filtriert haben, ist es nun an der Zeit, das Virus zunächst durch Ultrazentrifugation zu konzentrieren. Verwenden Sie serumfreies DMEM, um alle virushaltigen Röhrchen auf ein Gewicht innerhalb von 0,2 Gramm zueinander auszugleichen.Laden Sie anschließend die ausgewogenen Zentrifugenröhrchen in die Eimer des SW 41 TI- oder SW 28-Rotors. Verschließen Sie die Rotoreimer und hängen Sie sie am Rotor ein. Stellen Sie dann den Rotor in die Ultrazentrifuge.Zentrifugieren Sie das Virus etwa 90 Minuten bei vier Grad Celsius mit 25.000 U/min im SW 41 TI-Rotor oder mit 24.000 U/min im SW 28-Rotor. Nach der Zentrifugation kehren Sie zur Gewebekulturhaube zurück, drehen das Röhrchen um und gießen das SNAT in einen Behälter, der 10 % Bleiche enthält. Benutzen Sie ein Kim-Tuch, um überschüssige Flüssigkeit um das Pellet herum aufzusaugen, und stellen Sie das Röhrchen für nicht länger als fünf Minuten verkehrt herum in ein geeignetes Gestell, bis Sie bereit sind, das Pellet erneut aufzususpenderen.Um das virale Pellet erneut aufzuschwemmen, verwenden Sie eine Filterpipettenspitze, um 100 Mikroliter sterilem, vorgefiltertem PBS zu Ihrem Röhrchen hinzuzufügen. Pipettieren Sie dann etwa 20 Mal auf und ab. Lassen Sie das Virus über Nacht bei vier Grad zur vollständigen Resuspension stehen.Sie können virale Präparationen etwa eine Woche lang bei vier Grad lagern und bis zu einem Jahr bei minus 80 Grad. Denken Sie daran, alle leeren Röhrchen vor dem Entsorgen mit 10 % Bleichmittel zu behandeln. Wenn Sie die virale Präparation länger als eine Woche verwenden möchten, bewahren Sie sie im Kühlschrank auf.Stellen Sie minimale Aliquote von fünf bis 20 Mikrolitern für zukünftige Experimente sowie ein Aliquot von drei bis fünf Mikrolitern für die Titrierung her, gefrieren Sie diese ein und lagern Sie die Aliquote bei etwa minus 80. Der nächste Schritt besteht darin, die virale Titerbestimmung durchzuführen. Wenn Sie ein fluoreszierendes Reportergen in Ihr lentivirales Plasmid eingefügt haben, fluoreszieren die infizierten Zellen, und Sie können den viralen Titer mittels Durchflusszytometrie bestimmen.Beginnen Sie damit, drei Mikroliter konzentriertes Virus in 1,5 Milliliter komplettem Medium in den Vertiefungen eins bis sechs eines 96-Loch-Plättchens zu verdünnen. Führen Sie anschließend folgende serielle Verdünnungen in allen sechs Vertiefungen mit jeweils 100 Mikrolitern komplettem DM durch. Geben Sie in die erste Vertiefung 100 Mikroliter Medium ohne Virus.Dies ist Ihre ungefärbte Kontrolle. Geben Sie zum zweiten, verdünnten Virus 100 Mikroliter in die dritte Vertiefung. Geben Sie 100 Mikroliter der Mischung aus der zweiten Vertiefung in die vierte.Wir geben 100 Mikroliter aus dem dritten Bohrloch in das fünfte. Wir geben 100 Mikroliter aus dem vierten Bohrloch in das sechste. Wir geben 100 Mikroliter aus dem fünften Bohrloch.Nehmen Sie schließlich 100 Mikroliter aus dem sechsten Well heraus und entsorgen Sie diese, bleichen Sie und ergänzen Sie das Gesamtvolumen in allen Wells auf 200 Mikroliter mit DMEM. Bei jeder Verdünnung halbiert sich die Virus-Konzentration. Beachten Sie, dass dies nur empfohlene Verdünnungen sind, die sich gut zur Titrierung der meisten konzentrierten Viren eignen.Wenn Ihr Virus einen niedrigen Titer aufweist oder nicht angereichert ist, müssen Sie möglicherweise Ihre Verdünnungen anpassen. Behandeln Sie nicht verwendeten verdünnten Virus vor dem Entsorgen in einem Bioabfallbehälter 45 Minuten lang mit 10 % Bleiche. Geben Sie etwa 15.000 gesunde, aktiv teilende 293T-Zellen in jedes der sechs Löcher.Sie können eine einzelne 96-Well-Platte verwenden, um 16 virale Präparationen zu titrieren, die Wells auf 200 Mikroliter auffüllen, die Zellen in den Inkubator zurückbringen und die Infektion mindestens 48 Stunden lang fortschreiten lassen. Nach der Inkubation analysieren Sie die Zellfluoreszenz mittels Durchflusszytometrie. Sie können den Prozentsatz der fluoreszierenden Zellen pro Well verwenden, um die Titer oder die Anzahl infektiöser Viruspartikel pro Milliliter zugegebenen Virus zu bestimmen.Berechnen Sie die Anzahl infektiöser Einheiten pro Milliliter anhand der folgenden Formel bei der Interpretation der Durchflusszytometer-Ergebnisse. Beachten Sie, dass genaue Titer-Berechnungen nur dann möglich sind, wenn infizierte Zellen nicht mehr als eine virale Integration pro Zelle erhalten haben.Um sicherzustellen, dass dies der Fall ist, verwenden Sie Zellen mit einer Infektionsrate von weniger als 15 % für die Berechnungen. Zellen mit höheren Infektionsraten haben wahrscheinlich mehrere virale Integrationen pro Zelle erhalten. Die in Schritt zwei vorgeschlagene Verdünnung sollte mehrere Proben in diesem Infektionsbereich liefern.Verwenden Sie idealerweise mehrere Proben, um eine Titrationskurve zu erstellen, aus der Sie den endgültigen Titer berechnen können. Mithilfe der berechneten Formel aus der angepassten linearen Geraden kann der virale Titer bestimmt werden, aber falls nötig, ist die Berechnung des Titers auch anhand einer einzelnen Probe möglich. Für nicht angereicherten Virus erwartet man einen Titer von einem Mal 10 hoch sieben transduzierenden Einheiten pro Milliliter und für angereicherten Virus einen Titer von einem Mal 10 hoch acht transduzierenden Einheiten pro Milliliter.Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Lentiviren erzeugt, wenn man dieses Verfahren durchführt. Es ist wichtig, alle Vorschriften zur Biosicherheit einzuhalten und Abfälle ordnungsgemäß zu entsorgen. Damit ist alles gesagt.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Lentivirale Expressionsvektoren sind die wirksamsten Fahrzeuge für verschiedene stabil exprimieren Effektormoleküle oder Reporter-Konstrukte in Teilen auch sich nicht teilende Säugerzellen und ganzen Organismen. Hier stellen ein Protokoll, wie lentivector Expressionskonstrukte in pseudoviral Teilchen zu verpacken und Zielzellen unter Verwendung der pseudoviral Teilchen zu transduzieren.

Verpackung HIV-oder FIV-basierten Lentivector Expressionskonstrukte und Transduktion von VSV-G-pseudotypisierte Viruspartikel

In diesem Protokoll beschreiben wir Produktion, Reinigung und Titration von lentiviralen Vektoren. Wir bieten ein Beispiel für lentiviralen Vektor-vermittelte Gentransfer in primär kultivierten Neuronen und Astrozyten. Unsere Verfahren können auch auf andere Bauarten...

Die Produktion von lentiviralen Vektoren für die Transduktion von Zellen aus dem Zentralen Nervensystems

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Herstellung und Verwendung von Lentivirus, um selektiv zu transduzieren Primäre Oligodendrozyten Vorläuferzellen für In-vitro- Myelinisierung Assays

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Visualisierung und quantitative Analyse der durch Genotoxin induzierten PARP1/PARP2-Aktivierung in Zellen mit einem fluoreszierenden Fusionsprotein-basierten Reporter

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