Lentivirus Produktion

Dieses Verfahren beginnt mit der Durchtrennung von 2 9 3 T-Zellen mit Lentivirus-, Plasmid- und viralen Verpackungsvektoren, der Virusüberstand wird nach einer Inkubationszeit von mindestens 48 Stunden geerntet. Die Snat wird filtriert, um nach der Ultrazentrifugation mit einer Ultrazentrifuge konzentriert zu werden. Das Viruspellet wird mit PBS resuspendiert, um einen Virustiter zu erhalten, zuerst das konzentrierte Virus in vollständigen Medien zu verdünnen und dann eine serielle Verdünnung durchzuführen, um die Zellen mit Lentivirus zu infizieren.

Hallo, ich bin Shein Wong aus dem Labor von Michael McManus am Diabetes Center der University of California San Francisco. Ich bin Michael McManus. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung von Lentiviren.

Wir verwenden dieses Verfahren im Labor, um Lentiviren für die RNA-Interferenz herzustellen. Also lasst uns loslegen. Um dieses Protokoll zu beginnen, bereiten Sie die DNA vor, mit der die 2 9 3 T-Zellen transfiziert werden sollen.

Verdünnen Sie zunächst das Transfektionsreagenz des sechsten FU-Gens in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen, indem Sie 30 Mikroliter Fuji sechs mit 600 Mikrolitern freiem Serummedium mischen. Achten Sie darauf, dass Fuji die Seite des Röhrchens nicht berührt, wenn Sie es fünf Minuten lang in den mittleren Inkubationsraum mit mittlerer Inkubationstemperatur geben. Mischen Sie anschließend in der Kappe des Röhrchens vier Mikrogramm lentivirales Plasmid mit 1,33 Mikrogramm.

Jede dritte Generation virale Verpackungsvektoren. Das lentivirale Plasmid enthält die DNA. Das Virus fügt sich in das Genom jeder infizierten Zelle ein, während die Verpackungsvektoren Gene für alle anderen Proteine enthalten, die erforderlich sind, um ein Linsenvirus dazu zu bringen, den Deckel zu schließen und sich zu mischen, indem es die Tube einige Male umdreht.

Inkubieren Sie die DNA und das Transfektionsreagenz 15 bis 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Jetzt ist es an der Zeit, 2 9 3 Zellen mit der DNA zu transfizieren, die Sie vorbereitet haben, verwenden Sie Zellen, die Sie 24 Stunden im Voraus plattiert haben und die in der Gewebekultur eine Flüssigkeit von 50 bis 70 % erreicht haben. Pipettieren Sie die gesamte vorbereitete DNA auf die 2 9 3 Platte, die vorsichtig gemischt wird, indem Sie die Platte hin und her kippen. Bringen Sie die Zellen wieder in den Inkubator zurück und lassen Sie die Virusproduktion 48 bis 96 Stunden vor der Ernte weiterlaufen. Während der Inkubation produzieren die 2 9 3 Zellen Lentiviren, deren Genome eine RNA-Kopie Ihrer DNA von Interesse enthalten.

Jetzt ist es an der Zeit, das Virus einzusammeln. Nehmen Sie Ihre Zellen aus dem Inkubator. Halten Sie in der Gewebekulturhaube einen 0,4- oder Fünf-Mikron-Spritzenvorsatzfilter, eine 10-Milliliter-Einwegspritze und ein UltraClear Beckman-Zentrifugenröhrchen bereit.

Verwenden Sie die Einwegspritze, um den Überstand zu entfernen, der nun das Virus enthält. Befestigen Sie einen 0,45-Mikron-Spritzenvorsatzfilter an der Spitze und filtern Sie das Virus in ein UltraClear Beckman-Zentrifugenröhrchen. Der Filter lässt nur Viren und keine Zellen passieren, bevor er verworfen wird, und inkubiert alle virusproduzierenden Zellen.

Kulturplatten, Spritzen und Filter in 10% Bleiche für 45 Minuten. Nachdem Sie das Virus gesammelt und gefiltert haben, ist es an der Zeit, das Virus zuerst durch Ultrazentrifugation zu konzentrieren. Verwenden Sie serumfreies DMEM, um alle virushaltigen Röhrchen auf 0,2 Gramm genau zueinander auszugleichen.

Laden Sie anschließend die ausbalancierten Zentrifugenröhrchen in die Rotorbecher SW 41 TI oder SW 28. Verschließen Sie die Rotorschaufeln und haken Sie sie am Rotor ein. Setzen Sie dann den Rotor in die Ultrazentrifuge ein.

Schleudern Sie das Virus etwa 90 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 25.000 U/min in einem SW 41 TI-Rotor oder 24.000 U/min in einem SW 28-Rotor. Kehren Sie nach der Zentrifugation zur Gewebekulturhaube zurück und drehen Sie das Röhrchen um, um das SNAT in einen Behälter mit 10 % Bleiche zu gießen. Verwenden Sie ein Kim-Tuch, um überschüssige Flüssigkeit um das Pellet herum aufzusaugen, und drehen Sie das Rohr nicht länger als fünf Minuten in einem geeigneten Gestell um, bis Sie bereit sind, das Pellet wieder aufzuhängen.

Um das Viruspellet wieder zu resuspendieren, verwenden Sie eine Filterspitze, um 100 Mikroliter steriles, vorgefiltertes PBS in Ihr Röhrchen zu geben. Pipettieren Sie dann etwa 20 Mal auf und ab. Lassen Sie das Virus über Nacht bei vier Grad, um die Resuspension abzuschließen.

Sie können virale Präparate bei vier Grad etwa eine Woche und bei minus 80 Grad bis zu einem Jahr lagern. Denken Sie daran, alle leeren Tuben vor der Entsorgung mit 10% Bleiche zu behandeln. Wenn Sie beabsichtigen, das Viruspräparat länger als eine Woche zu verwenden, hält es sich im Kühlschrank.

Es werden minimale Aliquots von fünf bis 20 Mikrolitern für zukünftige Experimente und ein Aliquot von drei bis fünf Mikrolitern für die Titration hergestellt, eingefroren und die Aliquoten bei etwa minus 80 gelagert. Der nächste Schritt besteht darin, den Virustiter zu bestimmen. Wenn Sie ein fluoreszierendes Reportergen in Ihr lentivirales Plasmid aufgenommen haben, fluoreszieren infizierte Zellen und Sie können den Virustiter mittels Durchflusszytometrie bestimmen.

Verdünnen Sie zunächst drei Mikroliter des konzentrierten Virus in 1,5 Millilitern des vollständigen Mediums in Vertiefungen von eins bis sechs. In einer einzigen Reihe einer 96-Well-Platte. Führen Sie die folgenden seriellen Verdünnungen in allen sechs Vertiefungen bei 100 Mikrolitern vollständiger DM.To fügen Sie in der ersten Vertiefung 100 Mikroliter Medium ohne Viren hinzu.

Dies ist Ihre uneingeschränkte Kontrolle. Fügen Sie dem zweiten 100 Mikroliter des verdünnten Virus zum dritten hinzu. Nun, fügen Sie 100 Mikroliter der Mischung von der zweiten in die vierte Vertiefung hinzu.

Nun, fügen Sie 100 Mikroliter von der dritten Vertiefung zur fünften hinzu. Nun, fügen Sie 100 Mikroliter aus der vierten Vertiefung und in die sechste Vertiefung hinzu. Nun, fügen Sie 100 Mikroliter aus dem fünften hinzu.

Nun, nehmen Sie schließlich 100 Mikroliter aus der sechsten Vertiefung und verwerfen und bleichen Sie das Gesamtvolumen in allen Vertiefungen auf 200 Mikroliter mit DMEM. Mit jeder Verdünnung nimmt die Viruskonzentration um die Hälfte ab. Beachten Sie, dass es sich hierbei nur um empfohlene Verdünnungen handelt, die sich gut für die Titerung der meisten konzentrierten Viren eignen sollten.

Wenn Ihr Virus einen niedrigen Titer hat oder nicht konzentriert ist, müssen Sie möglicherweise Ihre Verdünnungen anpassen. Behandeln Sie unbenutzte verdünnte Viren 45 Minuten lang mit 10 % Bleichmittel, bevor Sie sie in einen Behälter für biologisch gefährliche Abfälle werfen. Geben Sie etwa 15.000 gesunde, sich aktiv teilende 2 9 3 T-Zellen in jede der sechs Vertiefungen.

Sie können eine einzelne 96-Well-Platte verwenden, um 16 Viruspräparate zu titern, die Wells auf 200 Mikroliter aufzufüllen, die Zellen in den Inkubator zurückzubringen und die Infektion mindestens 48 Stunden lang fortzuführen. Analysieren Sie nach der Inkubation die Zellfluoreszenz mit einem Durchflusszytometer. Sie können den Prozentsatz der fluoreszierenden Zellen pro Vertiefung verwenden, um den Titer oder die Anzahl der infektiösen Viruspartikel pro Milliliter des hinzugefügten Virus zu bestimmen.

Berechnen Sie die Anzahl der infektiösen Einheiten pro Milliliter mit der folgenden Formel, wenn Sie den Fluss interpretieren. Ergebnisse des Zytometers. Beachten Sie, dass man nur dann genaue Titerberechnungen durchführen kann, wenn infizierte Zellen nicht mehr als eine virale Integration pro Zelle erhalten haben.

Um sicherzustellen, dass dies der Fall ist, verwenden Sie Zellen mit einer Infektionsrate von weniger als 15 % für die Berechnungen. Zellen mit höheren Infektionsraten haben wahrscheinlich mehrere virale Integr pro Zelle erhalten. Die in Schritt zwei vorgeschlagene Verdünnung sollte mehrere Proben innerhalb dieses Infektionsbereichs ergeben.

Im Idealfall verwenden Sie mehrere Proben, um ein Titrationsdiagramm zu erstellen, aus dem Sie den endgültigen Titer berechnen können. Die berechnete Formel aus der angepassten linearen Linie kann zur Berechnung des Virustiters verwendet werden, aber Sie können den Titer bei Bedarf mit einer einzigen Probe berechnen. Man kann einen Titer von eins mal 10 bis zur siebten transduzierenden Einheit pro Milliliter für unkonzentrierte Viren und eins mal 10 bis zur achten transduzierenden Einheit pro Milliliter für konzentrierte Viren erwarten.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie bei diesem Verfahren Lentiviren erzeugen können. Es ist wichtig, alle Vorschriften zur biologischen Sicherheit einzuhalten und Abfälle ordnungsgemäß zu entsorgen. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.