Lentivirus Produktion

Dieses Verfahren beginnt mit der Transduktion von 293T-Zellen mit Lentivirus, Plasmid und viralen Verpackungsvektoren; das virale Überstand wird nach einer Inkubationszeit von mindestens 48 Stunden gewonnen. Der Überstand wird filtriert und mittels Ultrazentrifugation konzentriert. Das virale Pellet wird mit PBS resuspendiert, um die Virus-Titer zu erhalten: verdünnen Sie zunächst das konzentrierte Virus in komplettem Medium und führen Sie anschließend eine serielle Verdünnung durch, um Zellen mit Lentivirus zu infizieren.

Hallo, ich bin Shein Wong aus dem Labor von Michael McManus am Diabetes-Zentrum der University of California San Francisco. Ich bin Michael McManus. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung von Lentiviren.

Wir verwenden dieses Verfahren im Labor, um Lentiviren für die RNA-Interferenz herzustellen. Beginnen wir also. Um mit diesem Protokoll zu starten, bereiten Sie die DNA vor, mit der die 2 9 3 T-Zellen transfiziert werden sollen.

Vermischen Sie zunächst das FU-Gen-Sechs-Transfektionsreagenz in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen, indem Sie 30 Mikroliter Fuji Sechs mit 600 Mikrolitern serumfreiem Medium versetzen. Achten Sie darauf, dass Fuji beim Zugabevorgang die Röhrchenwand nicht berührt. Inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie anschließend im Röhrchenverschluss vier Mikrogramm lentivirales Plasmid mit 1,33 Mikrogramm zusammen.

Jeder Vektor zur Verpackung von Viren der dritten Generation. Das Lentiviralplasmid enthält die DNA. Das Virus wird sich in das Genom jeder Zelle einfügen, die es infiziert, während die Verpackungsvektoren die Gene für alle anderen Proteine enthalten, die zur Herstellung eines Lentivirus erforderlich sind. Schließen Sie den Deckel und mischen Sie durch mehrmaliges Umstülpen des Röhrchens.

Die DNA und das Transfektionsreagenz 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nun ist es an der Zeit, 293-Zellen mit der vorbereiteten DNA zu transfizieren. Verwenden Sie Zellen, die Sie 24 Stunden zuvor angesät haben und die eine Konfluenz von 50 bis 70 % erreicht haben. Geben Sie im Gewebekulturwerk alle vorbereitete DNA auf die 293-Platte und mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Platte sanft hin und her kippen. Stellen Sie die Zellen anschließend in den Inkubator zurück und lassen Sie die virale Produktion vor der Ernte 48 bis 96 Stunden lang weiterlaufen. Während der Inkubation produzieren die 293-Zellen Lentiviren, deren Genome eine RNA-Kopie Ihrer DNA des Interesses enthalten.

Jetzt ist es an der Zeit, das Virus zu sammeln. Nehmen Sie Ihre Zellen aus dem Inkubator. Halten Sie im Gewebekulturhaubenbereich einen 0,4- oder Fünf-Mikrometer-Spritzenfilter, eine Einweg-10-Milliliter-Spritze und ein UltraClear-Beckman-Zentrifugenröhrchen bereit.

Entfernen Sie mit der Einwegspritze den Überstand, der nun das Virus enthält. Bringen Sie einen 0,45-Mikron-Spritzenfilter an der Spitze an und filtrieren Sie das Virus in ein UltraClear-Beckman-Zentrifugenröhrchen. Der Filter lässt nur Viren und keine Zellen durch. Inkubieren Sie anschließend alle virusproduzierenden Zellen, bevor Sie sie verwerfen.

Behandeln Sie Kulturplatten, Spritzen und Filter 45 Minuten lang in 10 % Bleichlauge. Nachdem Sie das Virus gesammelt und filtriert haben, ist es nun an der Zeit, das Virus zunächst durch Ultrazentrifugation zu konzentrieren. Verwenden Sie serumfreies DMEM, um alle virushaltigen Röhrchen auf ein Gewicht innerhalb von 0,2 Gramm zueinander auszugleichen.

Laden Sie anschließend die ausgewogenen Zentrifugenröhrchen in die Eimer des SW 41 TI- oder SW 28-Rotors. Verschließen Sie die Rotoreimer und hängen Sie sie am Rotor ein. Stellen Sie dann den Rotor in die Ultrazentrifuge.

Zentrifugieren Sie das Virus etwa 90 Minuten bei vier Grad Celsius mit 25.000 U/min im SW 41 TI-Rotor oder mit 24.000 U/min im SW 28-Rotor. Nach der Zentrifugation kehren Sie zur Gewebekulturhaube zurück, drehen das Röhrchen um und gießen das SNAT in einen Behälter, der 10 % Bleiche enthält. Benutzen Sie ein Kim-Tuch, um überschüssige Flüssigkeit um das Pellet herum aufzusaugen, und stellen Sie das Röhrchen für nicht länger als fünf Minuten verkehrt herum in ein geeignetes Gestell, bis Sie bereit sind, das Pellet erneut aufzususpenderen.

Um das virale Pellet erneut aufzuschwemmen, verwenden Sie eine Filterpipettenspitze, um 100 Mikroliter sterilem, vorgefiltertem PBS zu Ihrem Röhrchen hinzuzufügen. Pipettieren Sie dann etwa 20 Mal auf und ab. Lassen Sie das Virus über Nacht bei vier Grad zur vollständigen Resuspension stehen.

Sie können virale Präparationen etwa eine Woche lang bei vier Grad lagern und bis zu einem Jahr bei minus 80 Grad. Denken Sie daran, alle leeren Röhrchen vor dem Entsorgen mit 10 % Bleichmittel zu behandeln. Wenn Sie die virale Präparation länger als eine Woche verwenden möchten, bewahren Sie sie im Kühlschrank auf.

Stellen Sie minimale Aliquote von fünf bis 20 Mikrolitern für zukünftige Experimente sowie ein Aliquot von drei bis fünf Mikrolitern für die Titrierung her, gefrieren Sie diese ein und lagern Sie die Aliquote bei etwa minus 80. Der nächste Schritt besteht darin, die virale Titerbestimmung durchzuführen. Wenn Sie ein fluoreszierendes Reportergen in Ihr lentivirales Plasmid eingefügt haben, fluoreszieren die infizierten Zellen, und Sie können den viralen Titer mittels Durchflusszytometrie bestimmen.

Beginnen Sie damit, drei Mikroliter konzentriertes Virus in 1,5 Milliliter komplettem Medium in den Vertiefungen eins bis sechs eines 96-Loch-Plättchens zu verdünnen. Führen Sie anschließend folgende serielle Verdünnungen in allen sechs Vertiefungen mit jeweils 100 Mikrolitern komplettem DM durch. Geben Sie in die erste Vertiefung 100 Mikroliter Medium ohne Virus.

Dies ist Ihre ungefärbte Kontrolle. Geben Sie zum zweiten, verdünnten Virus 100 Mikroliter in die dritte Vertiefung. Geben Sie 100 Mikroliter der Mischung aus der zweiten Vertiefung in die vierte.

Wir geben 100 Mikroliter aus dem dritten Bohrloch in das fünfte. Wir geben 100 Mikroliter aus dem vierten Bohrloch in das sechste. Wir geben 100 Mikroliter aus dem fünften Bohrloch.

Nehmen Sie schließlich 100 Mikroliter aus dem sechsten Well heraus und entsorgen Sie diese, bleichen Sie und ergänzen Sie das Gesamtvolumen in allen Wells auf 200 Mikroliter mit DMEM. Bei jeder Verdünnung halbiert sich die Virus-Konzentration. Beachten Sie, dass dies nur empfohlene Verdünnungen sind, die sich gut zur Titrierung der meisten konzentrierten Viren eignen.

Wenn Ihr Virus einen niedrigen Titer aufweist oder nicht angereichert ist, müssen Sie möglicherweise Ihre Verdünnungen anpassen. Behandeln Sie nicht verwendeten verdünnten Virus vor dem Entsorgen in einem Bioabfallbehälter 45 Minuten lang mit 10 % Bleiche. Geben Sie etwa 15.000 gesunde, aktiv teilende 293T-Zellen in jedes der sechs Löcher.

Sie können eine einzelne 96-Well-Platte verwenden, um 16 virale Präparationen zu titrieren, die Wells auf 200 Mikroliter auffüllen, die Zellen in den Inkubator zurückbringen und die Infektion mindestens 48 Stunden lang fortschreiten lassen. Nach der Inkubation analysieren Sie die Zellfluoreszenz mittels Durchflusszytometrie. Sie können den Prozentsatz der fluoreszierenden Zellen pro Well verwenden, um die Titer oder die Anzahl infektiöser Viruspartikel pro Milliliter zugegebenen Virus zu bestimmen.

Berechnen Sie die Anzahl infektiöser Einheiten pro Milliliter anhand der folgenden Formel bei der Interpretation der Durchflusszytometer-Ergebnisse. Beachten Sie, dass genaue Titer-Berechnungen nur dann möglich sind, wenn infizierte Zellen nicht mehr als eine virale Integration pro Zelle erhalten haben.

Um sicherzustellen, dass dies der Fall ist, verwenden Sie Zellen mit einer Infektionsrate von weniger als 15 % für die Berechnungen. Zellen mit höheren Infektionsraten haben wahrscheinlich mehrere virale Integrationen pro Zelle erhalten. Die in Schritt zwei vorgeschlagene Verdünnung sollte mehrere Proben in diesem Infektionsbereich liefern.

Verwenden Sie idealerweise mehrere Proben, um eine Titrationskurve zu erstellen, aus der Sie den endgültigen Titer berechnen können. Mithilfe der berechneten Formel aus der angepassten linearen Geraden kann der virale Titer bestimmt werden, aber falls nötig, ist die Berechnung des Titers auch anhand einer einzelnen Probe möglich. Für nicht angereicherten Virus erwartet man einen Titer von einem Mal 10 hoch sieben transduzierenden Einheiten pro Milliliter und für angereicherten Virus einen Titer von einem Mal 10 hoch acht transduzierenden Einheiten pro Milliliter.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Lentiviren erzeugt, wenn man dieses Verfahren durchführt. Es ist wichtig, alle Vorschriften zur Biosicherheit einzuhalten und Abfälle ordnungsgemäß zu entsorgen. Damit ist alles gesagt.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.