Chromosomale Spread-Vorbereitung von humanen embryonalen Stammzellen für die Karyotypisierung

Einführung. Hallo. Wir stammen vom Institut für Biometrische Wissenschaften der Bundesuniversität Faja in Brasilien. In diesem Video werden wir Chromosomenpräparate menschlicher embryonaler Stammzellen herstellen, um mögliche chromosomale Veränderungen nachzuweisen. Obwohl menschliche embryonale Stammzellen in der Regel einen stabilen Karyotyp aufweisen, berichteten mehrere Studien, dass sie unter bestimmten Kulturbedingungen anfällig dafür werden, chromosomale Anomalien zu erwerben, wie beispielsweise die Zugabe ganzer Chromosomen oder Chromosomenabschnitte.

Die Charakterisierung der genetischen Integrität von HASS in vitro ist unter Berücksichtigung ihrer wesentlichen Rolle für Entwicklungs- und Embryogenesestudien sowie für die Arzneimittelprüfung von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus stellen chromosomale Veränderungen bei zukünftigen therapeutischen Ansätzen eine reale Sorge dar, da sie häufig mit der Karzinogenese assoziiert sind. Beginnen wir also.

Behandeln Sie die Zellen mit Ate. In diesem Verfahren verwenden wir es. Die acht bis neun hat eine Linie, die in F 12 mit 20 % No-Count-Serumersatz und 80 bis neun Gramm pro Milliliter Fibroblastenwachstumsfaktor gehärtet wurde. Beginnen Sie damit, den Kulturkolben aus dem Inkubator zu entnehmen, und fügen Sie unter einer laminarer Luftstromhaube Coit mit einer Endkonzentration von 0,1 Mikrogramm pro Milliliter hinzu.

Die Zugabe von Coit zum Medium induziert Mitoka, Ruhephase und Metaphase. Wenn die Chromosomen gut kondensiert sind und unter dem Mikroskop leichter sichtbar werden, achten Sie darauf, sterile Techniken anzuwenden, um Kontaminationen zu vermeiden. Nachdem Sie Coit hinzugefügt haben, bewahren Sie die Flasche auf und bringen die Zellen zurück in den Inkubator.

Nach der Inkubationszeit die Zellen fixieren, die Zellen sind zu diesem Zeitpunkt noch nicht zur Fixierung bereit. Es ist nicht notwendig, unter sterilen Bedingungen zu arbeiten. Beginnen Sie damit, das Medium abzusaugen, und wenn Sie damit fertig sind, fügen Sie Trypsin hinzu.

Das DTA beträgt 0,05 % gegenüber dem Kolben. Stellen Sie sicher, dass genügend Trypsin hinzugefügt wird, um die Bodenfläche der Zellen vollständig zu bedecken. Verschließen Sie den Kolben und schütteln Sie ihn vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten.

Das Trypsin ermöglicht es, die Zellen fünf Minuten bei Raumtemperatur zu inkubieren. Nach den fünf Minuten der Inkubation bei Raumtemperatur sollten die Zellen nicht mehr an der Unterseite des Kolbens haften, und Sie müssen das Trypsin entweder durch Zugabe von Kulturmedium mit Serum oder durch vorsichtiges Hinzufügen von Serum zu den Zellen inaktivieren. Entfernen Sie vorsichtig die Kappe des Kolbens und geben Sie Kulturmedium oder das Serum hinzu, wobei die Flüssigkeit entlang der Unterseite des Kolbens über die Zellen fließen soll.

Pipettieren Sie die Zellsuspension mehrmals auf und ab, um die Zellen vollständig zu dissoziieren. Überführen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Konischglas, jedoch stellen Sie vorher sicher, dass die Zellen gut dissoziiert sind und die Suspension keine sichtbaren Zellklumpen enthält. Verschließen Sie das Gefäß nach Abschluss des Umpipettierens und zentrifugieren Sie es.

Falten Sie die Suspension fünf Minuten lang. Nach der Zentrifugation bei 800 U/min sollte sich ein Zellpellet am Boden des Röhrchens befinden. Achten Sie darauf, das Zellpellet nicht aufzuwirbeln.

Aspirieren Sie die Probe mit einer P 1000, bis nur noch etwa 200 Mikroliter verbleiben. Dieses Volumen ist median für Resus. Suspendieren Sie das Pellet in Resus.

Suspendieren Sie das Palatum. Schlagen Sie mehrmals vorsichtig mit den Fingern gegen das Röhrchen. Überprüfen Sie, ob die Zellen gut suspendiert sind, indem Sie sicherstellen, dass keine Zellklumpen mehr in der Lösung vorhanden sind.

Zu diesem Zeitpunkt sollte die Lösung trüb sein. Als Nächstes müssen Sie fünf Milliliter einer 75 Millimolar-Lösung von Kaliumchlorid hinzufügen, die auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Die hypotone Lösung sollte sehr langsam entlang der Rohrwand zugegeben werden, während Sie das Rohr drehen.

Nachdem Sie die ersten drei Milliliter hinzugefügt haben, verschließen Sie das Röhrchen fest und vorsichtig. Homogenisieren Sie die Zellsuspension mit einer hypotonen Lösung, indem Sie das Röhrchen langsam und vorsichtig horizontal drehen und rotieren.

Es wird fortgesetzt, indem die verbleibenden zwei Milliliter auf die gleiche Weise wie zuvor langsam zugegeben werden. Der Zweck der hypotonen Lösung besteht darin, das Zellvolumen zu vergrößern, um den Chromosomen zu ermöglichen, sich zu entwirren. Daher ist diese Inkubationszeit entscheidend, um gute Chromosomenpräparate zu erhalten. Sobald die gesamten fünf Milliliter zugegeben wurden, wird das Röhrchen verschlossen und die Zellen 15 Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius inkubiert.

Nach Ablauf der 15-minütigen Inkubationszeit nehmen Sie das Röhrchen aus dem Wasserbad. An diesem Punkt sollten Sie unter einem Abzug arbeiten, da die Dämpfe, die von der Fixierlösung erzeugt werden, toxisch sind. Falls kein Abzug zur Verfügung steht, arbeiten Sie unbedingt in einem gut belüfteten Bereich.

Entfernen Sie die Kappe des Röhrchens und geben Sie drei Tropfen der Fixierungslösung hinzu. Diese besteht im Verhältnis 3:1 aus Methanol und Essigsäure und sollte am Tag der Verwendung frisch hergestellt werden. Verschließen Sie das Röhrchen fest und drehen Sie es vorsichtig horizontal, indem Sie es langsam zuerst im Uhrzeigersinn, dann gegen den Uhrzeigersinn rotieren lassen.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang mit 800 U/min ohne Bremse. Es ist sehr wichtig, dass der Spindelvorgang langsam auslaufen kann, um Verluste durch Zellabrieb nach der Zentrifugation zu vermeiden. Dieser Zustand hält etwa 200 Sekunden lang an.

Um den Belag lediglich aufzulösen, klopfen Sie mehrmals vorsichtig mit den Fingern gegen das Röhrchen. Stellen Sie sicher, dass die Zellen gut suspendiert sind, indem Sie prüfen, ob keine Zellklumpen mehr vorhanden sind. Die Lösung mit drei Millilitern Fixierungslösung wird langsam entlang der Röhrchenwand zugegeben, während Sie das Röhrchen drehen, nachdem Sie die ersten drei Milliliter hinzugefügt haben.

Schließen Sie das Reagenzglas T fest und homogenisieren Sie die Zellsuspension vorsichtig, indem Sie das Reagenzglas horizontal drehen und es langsam rotieren lassen. Achten Sie darauf, mindestens eine volle Umdrehung durchzuführen. Um diesen Mischvorgang zu optimieren, fügen Sie mehr hinzu.

2 mL der Fixierlösung an der Tubuswand entlanggeben, um die Zellen abzusetzen. Die Zellsuspension über Nacht bei vier Grad Celsius lagern. So fixierte Zellen können monatelang in der Fixierlösung bei vier Grad Celsius aufbewahrt werden.

Am nächsten Tag die Zellen waschen, indem die Zellen fünf Minuten bei 800 U/min zentrifugiert werden, ohne Bremse. Den Überstand verwerfen und in etwa 200 Mikrolitern resuspendieren. Den Pellet durch mehrmaliges Aufstoßen des Röhrchens mit den Fingern suspendieren.

Stellen Sie sicher, dass die Zellen gut assoziiert sind und die Suspension keine sichtbaren Zellklumpen enthält. Geben Sie langsam fünf Milliliter frische Fixierlösung an der Röhrenwand entlang hinzu. Verschließen Sie die Röhre und homogenisieren Sie die Zellen, indem Sie die Röhre vorsichtig horizontal drehen, während sie sich langsam rotierend bewegt.

Um die darin enthaltenen Zellen zu schützen, wird die Fixierungslösung zugegeben, die Lipide entfernt und anschließend die Proteine aist, wodurch eine einfache Chromosomenausbreitung ermöglicht wird. Zentrifugieren Sie das Reagenzglas fünf Minuten bei 800 RRP M ohne Bremse. Vorbereitung der Objektträger: Lassen Sie nach dem Zentrifugationsschritt eine ausreichende Menge an Lösung zurück, um das Zellpräparat homogen zu mischen.

Diese Menge an Flüssigkeit kann von der Anzahl der Zellen abhängen. Schlagen Sie das Röhrchen mehrmals vorsichtig mit den Fingern an. Stellen Sie sicher, dass die Zellen gut dispergiert sind, indem Sie überprüfen, ob keine sichtbaren Zellklumpen vorhanden sind.

Zu diesem Zeitpunkt sollte die Zielprobe hinzugefügt werden, indem 20 bis 30 Mikroliter Zellsuspension mittels Pipette parallel zur Lichtfläche auf einen sauberen, trockenen Objektträger übertragen werden. Während die Fixierlösung verdunstet, wird die Oberfläche des Lichts unmittelbar körnig. Die Lichtseite nach oben gerichtet 30 Sekunden lang dem Dampf von heißem Wasser aussetzen, um die Zellen aufzublähen.

Analysieren Sie diese Präparate. Nachdem Sie diese Objektträger vorbereitet haben, untersuchen Sie sie unter einem Phasenkontrastmikroskop mit den 10x- und den haarigen Objektiven, um festzustellen, ob die Zelldichte für eine weitere Analyse geeignet ist. Dieser Objektträger ist ein Beispiel für einen zu konzentrierten Ansatz.

Beachten Sie, dass die Zellkerne zu dicht an den Metaphaseausstrichen liegen. Wenn Sie ein Objektträger mit zu hoher Zelldichte haben, verdünnen Sie die Zellsuspension durch Zugabe weiterer Fixierungslösung. Dieser Objektträger zeigt die gewünschte Zelldichte.

Beachten Sie, dass die Metaphasepräparate gut verteilt und isoliert sind. Sobald ein Objektträger mit optimaler Zelldichte vorliegt, kann er nicht mehr angefärbt und ausgewertet werden. Vermeiden Sie die Auswahl von Metaphasen in Kernnähe, da Chromosomen verdeckt oder von der Sicht behindert sein können.

Suchen Sie nach Metaphasen, die abgerundet sind, achten Sie jedoch darauf, dass keine Chromosomen auseinandergezogen sind, bevor Sie eine Metaphase auswählen, die abgerundet und gut isoliert ist. Wie auf der folgenden Folie gezeigt, sollten Sie vermeiden, falsche IES zu melden, die durch zwei zusätzliche Ausstriche entstehen, oder den Verlust von Chromosomen, der durch auseinandergezogene Chromosomen verursacht wird.

Wir hoffen, dass dieses Video Ihnen bei Ihren weiteren Experimenten helfen wird. Wenn Sie Fragen haben, zögern Sie nicht, uns zu kontaktieren. Viel Spaß und viel Erfolg.