Die Nutzung der Protease Fluorescent Detection Kit für Protease-Aktivität zu bestimmen

Dieses Protokoll beginnt damit, dass Inkubationspuffer, FXI-Casein-Lösung und die Probe, die das Protease-Enzym der Untersuchung enthält, in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben werden; anschließend wird vorsichtig gemischt und 60 Minuten bei 37 Grad Celsius im Dunkeln inkubiert. Um die proteolytische Reaktion am Ende der Inkubationszeit zu stoppen, wird TCA-Lösung zugegeben, vorsichtig gemischt und erneut 30 Minuten bei 37 Grad Celsius im Dunkeln inkubiert. Bei diesem Schritt fällt das nicht umgesetzte Substrat aus.

Zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 10.000 G und entfernen Sie den Überstand, der die säurelöslichen, mit FXI markierten Fragmente enthält. Überführen Sie den Überstand in eine Einzel- oder Mehrfachbrunnenplatte, verdünnen Sie ihn mit Assay-Puffer und messen Sie die Probe im Fluorimeter.

Hallo, ich bin Carrie Cup Vineyard und Wissenschaftlerin an unserem Sigma Aldridge DeKalb-Standort in St. Louis, Missouri. Heute zeige ich Ihnen ein Verfahren zur fluorometrischen Bestimmung der Proteaseaktivität. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Qualitätskontrolllabor, um eine geringe Proteaseaktivität zu ermitteln.

Beginnen wir also. Für dieses Verfahren werden der Inkubationspuffer, der Assaypuffer und die 0,6 normale Trichloressigsäurelösung (TCA) als gebrauchsfertige Lösungen bereitgestellt. Portionieren Sie die Lösung des mit Fite markierten Cain in kleinere Mengen und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius. Achten Sie darauf, das Material vor Licht zu schützen, indem Sie braune Fläschchen verwenden oder durchsichtige Röhrchen mit Folie umwickeln.

Die Aufteilung des Fite-Cain-Substrats minimiert die Notwendigkeit wiederholter Einfrier- und Auftauzyklen. Wiederholte Einfrier- und Auftauzyklen oder heftiges Schütteln bzw. Mischen des Fite-Cain könnten zur Trennung des Fite vom Cain führen, was zu einem höheren Hintergrundsignal führen kann. Wenn das Fluorimeter kalibriert oder der lineare Bereich für das Fite-Signal bestimmt wird, bereiten Sie die Fite-Kontrolllösung vor. Stellen Sie die Lösung frisch her, indem Sie sie in Assay-Puffer auf die geeignete Konzentration rekonstituieren.

Wenn fertig, die Lösung vor Licht schützen. Zum Schluss bereiten Sie die Trypsin-Protease-Kontrolle vor, indem Sie 100 Mikroliter einer einmillimolaren Salzsäure in das Gefäß mit lyophilisiertem Trypsin geben und kurz mischen, um sicherzustellen, dass das Trypsin gelöst ist. Die Lagerung des Trypsins unter sauren Bedingungen erhöht seine Stabilität.

Beachten Sie, dass die Trypsin-Kontrolllösung temperatursensitiv ist und bei niedrigen Konzentrationen nicht stabil. Bereiten Sie anschließend alle Assaysproben vor, zu denen Testproben sowie Kontroll- und Blindproben während des gesamten Assays gehören. Schützen Sie die Proben für jede Testprobe vor Licht.

Vermischen Sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen 20 µL Inkubationspuffer, 20 µL des fit c kian Substrats und 10 µL der Testprobe. Man kann ein durchsichtiges Mikrozentrifugenröhrchen verwenden, solange die Probe im Dunkeln inkubiert wird. Beachten Sie außerdem, dass Testproben mit hoher Proteaseaktivität verdünnt werden müssen.

Die Trypsin-Kontrollprobe dient als positive Kontrolle dafür, dass der Assay ordnungsgemäß funktioniert, um die Nachweisgrenze zu bestimmen oder eine allgemeine Standardkurve zu erstellen. Zum Herstellen der Trypsin-Kontrolle ein Teil säurehaltiges Trypsin mit neun Teilen Inkubationspuffer oder dem für die Testproben verwendeten Puffer vermischen und gut homogenisieren. Die endgültige Arbeitskonzentration von Trypsin beträgt 20 Mikrogramm pro Milliliter. Wenn ein anderer spezifischer Protease verwendet wird, bereiten Sie die Kontrolllösung mit dieser spezifischen Protease und einem geeigneten Puffer vor.

Bereiten Sie die Kontrollprobe weiterhin vor, indem Sie 20 Mikroliter Inkubationspuffer, 20 Mikroliter Fz-Cain-Substrat und 10 Mikroliter der Trypsin-Kontrolle in einem Mikrozentrifugenröhrchen kombinieren. Es wird empfohlen, mindestens eine Kontrollprobe mit fünf Nanogramm Trypsin bei jedem Assay durchzuführen oder eine serielle Verdünnung zu verwenden. Die letzte Probe ist die Blindprobe, die hergestellt wird, indem 20 Mikroliter Inkubationspuffer, 20 Mikroliter des Fitz-Cain-Substrats und 10 Mikroliter ultrareines Wasser in einem Mikrozentrifugenröhrchen kombiniert werden.

Wenn die drei Probenarten vorbereitet sind, vorsichtig jeden Ansatz ansatzweise mischen und 60 Minuten lang im Dunkeln bei 37 Grad Celsius inkubieren. Achten Sie darauf, nicht zu heftig zu mischen, da übermäßige Turbulenzen zu einem hohen Fluoreszenz-Hintergrund führen und die Empfindlichkeit des Assays verringern können. Man kann bis zu 24 Stunden inkubieren, um die Empfindlichkeit zu erhöhen, längere Inkubationen werden jedoch nicht empfohlen, da das FXI-Casein dann beginnen könnte abzubauen.

Auch hier, um einen hohen Fluoreszenz-Hintergrund zu vermeiden, wenn die Inkubation abgeschlossen ist, geeignete Schutzausrüstung verwenden, um 150 Mikroliter der TCA-Lösung zu jedem Mikrozentrifugenröhrchen hinzuzufügen. Nach der Inkubation mit TCA sollte man eine weiße Trübung im Röhrchen beobachten, die das ausgefällte, undigestierte und unlösliche Cain darstellt; vorsichtig mischen und 30 Minuten bei 37 Grad Celsius im Dunkeln inkubieren. Am Ende der Inkubation mit der TCA-Lösung die Röhrchen 10 Minuten bei 10.000 G bei Raumtemperatur zentrifugieren.

Das Überstand enthält die säurelöslichen, mit Cain markierten Fragmenten, die für die Fluoreszenzmessung verwendet werden. Pipettieren Sie vorsichtig von der Oberfläche des Röhrchens, sodass kein Niederschlag aus dem Pellet in die Pipettenspitze gelangt, da dies zu einer falsch positiven Signalabgabe bei der nachfolgenden fluoreszenzbasierenden Detektion der Proteaseaktivität führen würde. Geben Sie 10 Mikroliter des TCA-Überstandes zu einem Milliliter Puffer für den Assay in einem Röhrchen hinzu und mischen Sie vorsichtig. Verdünnen Sie außerdem den FE-Standard für die Analyse, indem Sie 10 Mikroliter FE zu einem Milliliter Assaypuffer hinzufügen. Der FE-Kontrollwert und der Trypsin-Standard liefern einen Fluoreszenzpegel, den die Probe nicht überschreiten sollte. Die Lösung aus TCA-Überstand und Assaypuffer kann vor der Fluoreszenzmessung bis zu 24 Stunden im Dunkeln bei zwei bis acht Grad Celsius gelagert werden.

Wenn mit einem Vete gemessen wird, eine Milliliter der Lösung in einen geeigneten Vete überführen; wenn eine große Anzahl von Proben analysiert werden soll, kann eine 96-Loch-Platte und ein fluoreszenzbasierter Plattenreader zur Erfassung der fluorometrischen Daten verwendet werden. In diesem Assay dient Fluorescein-Isothiocyanat als Kontrolle für eine mögliche Instrumentenkalibrierung. Hier ist ein repräsentativer Linearitätsbereich des FS e-Signals nach der beschriebenen Vorgehensweise dargestellt.

Die Verwendung dieses Kits mit einer Inkubationszeit von 30 Minuten für den ersten Inkubationsschritt ergibt eine typische Standardkurve für Trypsin- und Kontrollproben im Bereich von 1,5 Nanogramm bis 25 Nanogramm. Die Fluoreszenzmessungen wurden in einer Mehrfach-Well-Platte durchgeführt. Die Nachweisgrenze des Assays entspricht der Menge an Protease, die eine signifikante Fluoreszenzsignalüberhöhung gegenüber dem Wert der Leerprobe erzeugt.

Heute haben wir Ihnen gezeigt, wie Sie das Protease-Bestimmungs-Kit von Sigma Aldridge verwenden, um fluorimetrische Protease-Aktivität in einer biologischen Probe nachzuweisen. Obwohl dieses Kit für Ihre Anwendung optimiert ist, ist es wichtig zu bedenken, dass für Ihre spezifischen Proteasen geringfügige Modifikationen erforderlich sein können. Damit ist der Vorgang abgeschlossen.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.