Name: DNA Transfektion von Säuger Skelettmuskulatur mit In Vivo Elektroporation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 56 s
Description: Lernen Sie die In-vivo-Elektroporation zur DNA-Transfektion in Mäuse-Skelettmuskulatur. Diese Methode ermöglicht die effiziente Expression und Visualisierung transgener Proteine in lebenden Tieren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken Dr. T. Otis, Department für Neurobiologie, UCLA, für die gemeinsame Nutzung der TPLSM Anlage mit uns, Dr. C. Fahlke, Institut für Physiologie, RWTH Aachen, Deutschland, für die freundliche Spende der pEYFP-ClC1 Plasmid, und Herr . R. Serrano für den technischen Support. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von NIH / NIAMS gewährt AR047664 und AR54816 unterstützt.

Experimentelle Verfahren zur in-vivo-Elektroporation von FDB und IO Muskeln <ol><li> Vor Beginn der in vivo Elektroporation Protokolle müssen Säugetieren Expressionsplasmide verstärkt um die Konzentration im Bereich von auf 2-5 pg Plasmid / ul TE Hinweis ergeben werden:. Wir verwenden routinemäßig kommerzielle Verstärkung Kits und folgen Sie den Hersteller &quot;Verfahren. Gewerbliche Expressionsplasmide Durchführung der CMV-Promotor arbeiten sehr gut im Skelettmuskel in vivo Transfektionen. </li><li> Aliquot das notwendige Volumen (10-20 ul) der Plasmid-Lösung und speichern Sie sie in zwei 0,5 ml Eppendorf-Röhrchen (eine für jeden Fuß der Maus). </li><li> Bereiten Sie eine Lösung mit 2 mg / ml Hyaluronidase in sterile Tyrode. </li><li> Mit einer Betäubung Feld tief betäuben eine Maus mit 4% Isofluran in O2 mit einem zugelassenen Gas-Narkosegerät. Legen Sie das Tier auf einem Heizkissen (37 ° C) und Aufrechterhaltung der Narkose mit einem Nagetier Gesichtsmaske. Überwachen Sie die Narkosetiefe durch toe Prise Reflex. </li><li> Unter Beobachtung mit einem Dissektionsmikroskop, injizieren 10 ul der Hyaluronidase-Lösung unter dem Fußballen von einem Fuß der Maus über einen 1 &quot;langen 33 gauge sterile Nadel. Dringen in die Haut an einer Stelle nahe der Ferse des Fußes und vorab die Nadel subkutan in Richtung der Basis der Zehen für ~ 1 / 4 &quot;. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang mit dem anderen Fuß, wenn dies gewünscht wird. </li><li> Trennen Sie die Anästhesie und die Maus in einem Käfig. Lassen Sie es vollständig aus der Narkose zu erholen. </li><li> Nach einer Stunde, betäuben das Tier ein zweites Mal und legen Sie es auf dem Heizkissen. Nach dem gleichen Verfahren für die Hyaluronidase beschriebene Lösung injizieren insgesamt von 20-50 ug der Plasmid-DNA (je nach Größe der Plasmid-Konstrukt). Die gesamte Injektionsvolumen sollte weniger als 20 ul / Fuß. Hinweis: wenn 15-20 μ L erforderlich ist, ist es ratsam, die Haut an der Einstichstelle in der Nähe mit Gewebe-Kleber. </li><li> Trennen Sie die Anästhesie und die Maus in einem Käfig. Lassen Sie es vollständig aus der Narkose zu erholen, und warten Sie 10-15 min. </li><li> Anesthetize das Tier bereits zum dritten Mal und legen Sie es auf dem Heizkissen. </li><li> Wählen Sie einen Fuß des Tieres. Legen Sie eine vergoldete Akupunkturnadeln unter die Haut an der Ferse, und eine zweite an der Basis der Zehen. Elektroden sind parallel zueinander und senkrecht zur Längsachse des Fußes. </li><li> Verbinden Sie den Kopf der Nadeln (Elektroden) mit dem elektrischen Stimulator mit Mikro-Clip-Anschlüsse. Elektroporieren die Muskeln, indem 20 Impulse, 20 ms Dauer / Stück, bei 1Hz. Je nach Abstand der Elektroden, die Impulse &#39;Spannungsamplitude eingestellt (durch die Überwachung mit einem Oszilloskop), um ein elektrisches Feld von ~ 100 V / cm Hinweis ergeben:. Keine Kontraktionen in Reaktion auf die Reize zu beachten, wenn das Niveau der Anästhesie ist ausreichend. </li><li> Wenn es gewünscht wird, wiederholen Sie die oben genannten Verfahren in der kontralateralen Fuß des Tieres. </li><li> Zurück das Tier in den Käfig und einmal vollständig aus der Narkose erholt halten sie unter Beobachtung. Hinweis: wenn das Verfahren verlief normal, das Tier sollte die volle Mobilität innerhalb von 30 Minuten wieder und danach ist bereit, zurück zu dem Tier Zimmer im Vivarium gesendet werden. Die Injektion von Hyaluronidase und DNA in den Fußsohlen haben keine spürbaren negativen Auswirkungen auf die Tiere. Einmal aus der Narkose erholt, werden die Mäuse in der Lage, normal zu schlendern um den Käfig. Als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme, um das Trinkwasser der Tiere Carprofen bei 0,0027 mg / ml für 2 Tage als Analgetikum hinzuzufügen. </li><li> Protein Expression kann 2-8 Tage nach der Transfektion untersucht werden. Allerdings hat anhaltende Expression vieler Proteine ​​über Monate beobachtet worden. </li></ol> HINWEIS: Alle tierischen Verfahren wurden von der UCLA Kanzlers Animal Research Committee genehmigt durch das Tierschutzgesetz und die PHS-Politik auf Humane Pflege und Verwendung von Labortieren vorgeschrieben. Repräsentative Ergebnisse: Die korrekte Umsetzung der in vivo Elektroporation oben beschriebenen Verfahren sollte in der effektiven Transfektion von Plasmiden in FDB und IO Muskeln führen. Doch die Effizienz der Expression von transgenen Proteinen Varianten werden auf dem Plasmid abhängen, der Größe und Komplexität des Proteins, die funktionellen Eigenschaften des Proteins, und eine Reihe von anderen Variablen außerhalb unserer Kontrolle. Wie in Abbildung 1 für eine FDB Muskel in Gegenwart von einem kommerziellen Plasmid (PMR-mCherry) Codierung für mCherry Protein elektroporiert dargestellt, sind die meisten der Muskelfasern mit unserem Protokoll transfiziert, wie durch die Tatsache, das die meisten von ihnen Anzeige rote Fluoreszenz dargestellt. Dies schließt nicht aus, dass die einzelnen Fasern verschiedene Grade der Proteinexpression aufweisen, oder dass nur wenige Fasern sind nicht an allen 3 transfiziert. Es sollte be darauf hingewiesen, dass die effiziente Expression von großen Mengen von fluoreszierenden Proteinen wie mCherry, EGFP, ECFP und EYFP, beeinträchtigt nicht die Muskelfasern &quot;Erregbarkeit und Erregung und Kontraktion Eigenschaften. In der Tat sind sie nicht von denen in sham transfizierten Muskeln (Ergebnisse nicht gezeigt). Praktische Ansätze verwendet, um die lokalisierte Expression von Fluoreszenz-markierten Proteine ​​in Skelettmuskelfasern zu überprüfen. Die intrazelluläre Lokalisation der di novo exprimierten transgenen Proteinen wird routinemäßig durch gleichzeitige Erwerb ausgewertet, mit dem TPLSM, fluoreszierende Abbildungen der jeweiligen Tags und Bilder von klar definierten Markern von zellulären Strukturen. Die typischsten dieser letzteren sind: a) Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) Bilder, die aus dem Myosin Anisotropie der Sarkomer A-Bands (zentriert bei der M-Linien) 9,10 ergeben und b) di-8-ANEPPS Fluoreszenz Bilder, die durch die Kennzeichnung der Oberfläche und quer röhrenförmigen (T-Tubulus-System) Membranen der Muskelfasern mit diesem impermeante potentiometrische dye11 gewonnen werden können. In Fluoreszenzbilder von Muskelfasern mit di-8-ANEPPS gefärbt erscheinen die T-Tubuli als schmale Bänder von Fluoreszenz orientierten etwa senkrecht zur Längsachse der Faser. Diese Bänder sind ungleichmäßig voneinander beabstandet: sie sind durch eine lange Strecke, die über die M-Linien umfasst, und eine kurze, die über die Z-Linie 11 erstreckt sich getrennt. Expression und Lokalisation von α-Actinin-EGFP in Skelettmuskelfasern. Ein Beispiel für den Ausdruck eines markierten Variante des strukturellen Muskelprotein α-Actinin ist in Abbildung 2 dargestellt. Dieses Protein ist dafür bekannt, eine wichtige Komponente der Z-Linie und als solche wird routinemäßig als Marker dieser structure12 verwendet. Wir transfizierten FDB und IO Muskeln mit dem Plasmid pEGFPN1-α-actinin1 Kodierung für die menschliche (nicht-Muskel) α-Actinin am C-Terminus mit EGFP markiert. Sechs Tage nach der Transfektion, fanden wir, dass, wie von EGFP-Fluoreszenz Verteilung, α-Actinin meist auf schmalen Bändern gleichmäßig entlang der Faserachse angeordnet ist Ausdruck bewertet. Ein einziges Band pro Sarkomer gesehen wird (2A und 2D). Die Kolokalisation von diesen Bands mit den Z-Linien wird durch den Vergleich der Verteilung der EGFP-Fluoreszenz mit der SHG (Abbildung 2B) und di-8-ANEPPS (Abb. 2E) Bilder gezeigt. Wie das Overlay-Bild (Abbildung 2C), α-Actinin-EGFP Bands wechseln sich ab mit dem SHG-Bands gezeigt, was darauf hinweist, dass sie auf halbem Weg zwischen zwei aufeinander folgenden M-Bänder befindet, zeitgleich mit der Lage der Z-Linien. In transfizierten Muskelfasern mit di-8-ANEPPS gebeizt, sind α-Actinin-EGFP-Bands gesehen, mittig zwischen jedem Paar von T-Tubuli (Abb. 2F), die Flanke des Z-Linien (dh durch eine kürzere Distanz getrennt) bekannt sind, was zeigt, dass transgene α-Actinin der Z-Linie wird angestrebt. Expression von DHPRα1s am N-Terminus mit EGFP markiert Die Effizienz der Muskel Transfektion mit pEGFPC1.1-DHPR α 1s ist in TPLSM Bilder (zB 3A) zeigt, dass überprüft meisten Fasern ausdrückliche EGFP-DHPRα1s (ein Transmembranprotein). Das auffälligste Merkmal von transfizierten Fasern ist das Doppel-gebändert Muster der EGFP-Fluoreszenz (3A &amp; 3B) wie zu erwarten, wenn dieses Protein, um die T-Tubuli gezielt wurde. Es kann auch in Abbildung 3 zu beachten, dass zwar verschiedene Fasern verschiedenen Ebenen der Fluoreszenzintensität Display, die gebänderte Fluoreszenzmuster einer einzelnen Faser zu erhalten homogen entlang der Faser zu sein scheint. Bei höherer Vergrößerung (Abbildung 3B), ist deutlich zu erkennen sein, dass die ungleichmäßige Abstände zwischen den Bands ähnlich wie in Fasern gefärbt di-8-ANEPPS (z. B. Abbildung 2E) beobachtet wird. Die Overlay-Bilder (Abbildung 3B &amp; 3E) zeigen, dass die SHG-Bands in den größeren Abstand zwischen den EGFP-DHPRα1s Bands befinden, untermauern, dass dieses Protein bei der T-Tubuli ist. Zusätzliche FRET-Messungen mit dem nicht-fluoreszierenden lipophilen Anion DPA-(Daten nicht gezeigt) zeigen weiterhin, dass die EGFP-Einheit innerhalb von wenigen Nanometern der inneren Flugblatt der T-Tubuli &quot;Membranen. Lokalisierung und funktionelle Beurteilung der Expression von EYFP-ClC1 Fasern mit pEYFP-ClC1, die ein EYFP-markierten Konstrukts (in der N-terminal) der Skelettmuskulatur Chlorid-Kanal (ClC1), Display EYFP Fluoreszenzbanden (Abbildung 4A) kodiert mit einem Muster ähnlich dem für EGFP-DHPRα1s beobachtet transfizierten &quot;Expression (Abbildung 3A) und entsprechend der T-Tubulus Anordnung wie abgebildet mit di-8-ANEPPS Färbung (Abb. 2E). Wie zu erwarten, die Überlagerung von EYFP-ClC1 (Abbildung 4A) und SHG Bilder (Abbildung 4B) als in der Überlagerung (Abbildung 4C) dargestellt, zeigen, dass die SHG-Bands auf den großen Abstand o zentriert sindf zwischen EYFP Fluoreszenzbanden. Um zu beurteilen, ob die Expression von EYFP-ClC1 führt zu einer deutlichen Erhöhung der Ruhe-Leitwert der Muskelfasern, wie aus der Überexpression von funktioneller Chlorid-Kanäle zu erwarten, wir enzymatisch gespalten Muskelfasern aus den transfizierten FDB Muskeln und ihrer elektrophysiologischen Eigenschaften untersucht mit einem Zwei-Mikroelektroden Versuchsaufbau zuvor beschrieben 6,11,13. Abbildung 5 zeigt die Ergebnisse von zwei Fasern: ein Ausdruck großer Mengen von EYFP-ClC1 als von der globalen Messungen der Fluoreszenzintensität in einem Standard-Fluoreszenzmikroskop (nicht dargestellt) beurteilt, und die andere ist eine nicht-transfizierten Kontrolle. Die Spannung Rekord in Abbildung 5A (aus der Muskelfaser Ausdruck EYFP-ClC1) zeigt, dass aufgrund der zu hohen Ruhe-Leitfähigkeit wird die Faser fast nicht erregbar. Aktuelle Reizimpulse von bis zu 400nA (0,5 ms) benötigt, um verwendet werden, um eine sehr kleine aktive Reaktion (kein Überschwingen, 5A) hervorzurufen. Nach dem Austausch des externen Tyrode-Lösung zu einem Gehalt von 500 uM des Chlorid-Kanal-Blocker 9-ACA wurden 200 nA Stromimpulse aus, um ein Aktionspotential (Abbildung 5B) zu entlocken, obwohl viel langsamer und breiter als diejenigen in der Kontrollgruppe Faser aufgenommen ( Abbildung 5C). Wie erwartet, hatte Zugabe von 9-ACA minimale Auswirkungen auf diese Kontrolle Faser (Abb. 5D). <img src="/files/ftp_upload/1520/1520fig1tmb.jpg" alt="Abbildung 1" border="0" /> Abbildung 1. Transfektionseffizienz der in-vivo Elektroporation Methode. Hellfeld (A) und Fluoreszenz (B) Bilder einer FDB Muskel mit PMR-mCherry transfiziert. Tage nach der Elektroporation Protokoll: 12 Tage. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1520/1520fig1.jpg">klicken Sie hier</a> für eine größere Version der Abbildung 1. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Expression und Ausrichtung der α-Actinin-EGFP in FDB-Fasern. Panels A und B sind EGFP Fluoreszenz-und SHG Bilder, jeweils aus einem Faser Ausdruck α-Actinin-EGFP. Panel C ist eine Überlagerung der Bilder in A und B. Panels D und E sind Fluoreszenzbilder einer anderen Faser Ausdruck α-Actinin-EGFP und gefärbt mit di-8-ANEPPS jeweils. Panel-F ist die Überlagerung der Bilder in D und E. Tage nach der Elektroporation Protokoll: 6 Tage. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Expression und Ausrichtung der EGFP-DHPRα1s in FDB-Fasern. Panel A, EGFP-Fluoreszenz Bild einer Gruppe von Fasern zum Ausdruck EGFP-DHPRα1s. Panel B ist eine Vergrößerung des Platzes in Panel A, um besser zeigen die gebänderte Muster der Proteinexpression. Panel C ist die SHG Bild entsprechend, um das Bild in Panel A. Panel D ist die Überlagerung der Bilder A und C. Panel E ist eine Erweiterung der Fläche in Panel D. Tage nach der Elektroporation Protokoll angegeben: 20 Tage. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Expression und Ausrichtung der EYFP-ClC1 in FDB-Fasern. Die Abbildungen A und B sind EYFP Fluoreszenz-und SHG Bilder, bzw. der Fasern zum Ausdruck EYFP-ClC1. Panel C ist die Überlagerung der Bilder in Abb. A und B. Panel D ist ein Intensitätsverlauf entlang der weißen Linie in das Bild in Panel C Tage nach der Elektroporation Protokoll markiert gemessen: 7 Tage. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Elektrophysiologische Beurteilung Fasern Ausdruck transgenen EYFP-ClC1. Panels A und B sind Spannung Datensätze aus einer Faser ausdrücken EYFP-ClC1 in Reaktion auf aktuelle Impulse vor und nach der Behandlung mit 9-ACA, jeweils. Panels C und D sind Spannung Datensätze (Aktionspotentiale) ausgelöst als Reaktion auf aktuelle Impulse in einem nicht-transfizierten Faser vor und nach der Behandlung mit 9-ACA, jeweils.

<ol><li>Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+liver+in+vivo+by+biolistic+particle+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery.</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).</li>
<li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+dynamic+FRET+signals+from+the+transverse+tubules+in+mammalian+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers.</a> J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).</li>
<li>DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+mammalian+skeletal+muscle+as+a+heterologous+protein+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system.</a> Protein Expression and Purification. 47 (1), 281-288 (2006).</li>
<li>Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GFP-tagged+neuronal+glutamate+transporters+in+cerebellar+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons.</a> Neuropharmacology. 49 (6), 883-889 (2005).</li>
<li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+FRET+Signals+between+DPA+and+the+%7Balpha%7D1s+and+%7Bbeta%7D1a+Subunits+of+the+DHPR+of+Mammalian+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle.</a> Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).</li>
<li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+in+the+transverse+tubular+system+and+voltage+dependence+of+calcium+release+in+normal+and+mdx+mouse+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).</li>
<li>DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophic+skeletal+muscle+fibers+display+alterations+at+the+level+of+calcium+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14698-14703 (2008).</li>
<li>Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Chloride+Channel+Dysfunction+in+Two+Mouse+Models+of+Myotonic+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 79-94 (2007).</li>
<li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li>
<li>Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Myosin-Based+Source+for+Second-Harmonic+Generation+from+Muscle+Sarcomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres.</a> Biophys J. 90 (2), 693-703 (2006).</li>
<li>DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+and+functional+characterization+of+the+transverse+tubular+system+of+mammalian+muscle+fibers+using+the+potentiometric+indicator+di-8-ANEPPS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS.</a> J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).</li>
<li>Mills, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+the+actin-binding+proteins%2C+%7B%7Balpha%7D%7D-actinin-2+and+-3%2C+in+different+species%3A+implications+for+the+evolution+of+functional+redundancy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).</li>
<li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+action+potential-evoked+sarcoplasmic+reticulum+calcium+release+is+impaired+in+mdx+mouse+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir beschreiben hier die einzelnen Schritte, die folgten, um eine effektive Transfektion von DNA-Plasmiden in Skelettmuskelfasern erreichen durch in vivo Elektroporation werden sollte. Die wesentlichen Vorteile unseres Ansatzes sind die Einfachheit der Implementierung und ihrer minimalen Invasivität, die in vernachlässigbarer Gefahr für die Gesundheit der Tiere führt. In Wirklichkeit haben die oben beschriebene Elektroporation Protokolle nicht erfordert weit mehr als zwei subkutane Injektionen pro Fuß, durch ei...

dna transfektion von säuger skelettmuskulatur mit in vivo elektroporation

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Ein wachsendes Interesse in der Zellbiologie ist transgen zu veränderten Formen der essentiellen Proteine ​​(zB fluoreszenzmarkierten Konstrukte und / oder mutierte Varianten) auszudrücken, um ihre endogene Verteilung und funktionelle Bedeutung zu untersuchen. Ein interessanter Ansatz, der umgesetzt wurde, um dieses Ziel in ausdifferenzierten Zellen erfüllen, ist der<em&gt; In vivo</em&gt; Transfektion von Plasmiden durch verschiedene Methoden in bestimmten Geweben wie Leber<sup&gt; 1</sup&gt;, Skelettmuskel<sup&gt; 2,3</sup&gt;, Und sogar das Gehirn<sup&gt; 4</sup&gt;. Wir stellen Ihnen hier eine detaillierte Beschreibung der Schritte, die befolgt werden, um effizient transfizieren genetischen Materials in die Fasern der muss<em&gt; Flexor digitorum brevis</em&gt; (FDB) und<em&gt; Interosseus</em&gt; (IO) Muskeln des erwachsenen Mäusen mit einem<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroporation Ansatz. Die experimentellen Parameter wurden so die Anzahl der Muskelfasern transfizierten gleichzeitiger Minimierung Gewebeschäden, dass die Qualität und Quantität der Proteine ​​in einzelnen Fasern ausgedrückt beeinträchtigen maximieren optimiert. Wir haben überprüft, dass die Umsetzung der Methodik in diesem Papier beschrieben in einer hohen Ausbeute an löslichen Proteinen, dh EGFP und ECFP Ergebnisse<sup&gt; 3</sup&gt;, Calpain, FKBP12, β2a-DHPR, etc.; Strukturproteine, dh minidystrophin und α-Actinin und Membranproteine, dh α1s-DHPR, RyR1, kardiale Na / Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Wärmetauscher, NaV1.4 Na-Kanal, SERCA1, etc., wenn sie auf FDB, IO und andere Muskeln von Mäusen und Ratten angewendet. Die effiziente Expression einiger dieser Proteine ​​mit biochemischen überprüft<sup&gt; 3</sup&gt; Und funktionellen Nachweis<sup&gt; 5</sup&gt;. Allerdings sind bei weitem die häufigste bestätigenden Ansatz von uns verwendeten Standard-Fluoreszenz-Mikroskopie und 2-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (TPLSM), die nicht nur die allgemeine Ausdruck zu identifizieren lassen, sondern auch die detaillierte intrazelluläre Lokalisation von fluoreszenzmarkierten Protein-Konstrukten. Die Methode könnte auch genutzt werden, um Plasmide, die für die Expression von Proteinen der physiologischen Relevanz (wie hier) zu transfizieren, oder für RNA-Interferenz (siRNA) mit dem Ziel, die Expression von normalerweise exprimierten Proteine ​​(nicht von uns getestet) zu unterdrücken. Anzumerken ist, dass die Transfektion von FDB und IO Muskelfasern besonders relevant ist für die Untersuchung von Säugetieren Muskelphysiologie seit Fasern enzymatisch losgelöst von diesen Muskeln derzeit einer der am besten geeigneten Modelle zur grundlegenden Mechanismen der Erregbarkeit und Erregung und Kontraktion unter untersuchen Strom oder Spannung Klemme Bedingungen<sup&gt; 2,6-8</sup&gt;.

Wir beschreiben detaillierte Verfahren für die effiziente Transfektion von Plasmid-DNA in die Fasern der Fußmuskulatur von lebenden Mäusen mittels Elektroporation und der nachfolgenden Darstellung der Proteinexpression mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie.

DNA Transfektion von Säuger Skelettmuskulatur mit In Vivo Elektroporation

Ein wachsendes Interesse in der Zellbiologie besteht darin, transgen modifizierte Formen essenzieller Proteine (z. B. fluoreszenzmarkierte Konstrukte und/oder Mutanten ...

Die Elektroporation kann in vivo durchgeführt werden, um DNA, Plasmide in transgenen adulten Maus-Musculus flexor digitorum brevis oder FDB sowie Interosseus- oder IO-Muskeln zu transfizieren und zu exprimieren. Das Verfahren beginnt mit der Anästhesie der Maus. Die plantare Fläche eines Fußes wird für die erste Injektion von Hyaluronidase vorbereitet, indem die Nadel an der Ferse eingeführt und subkutan entlang des Fußes geführt wird.Nach einer Stunde wird das Tier erneut anästhesiert und das Plasma in dieselbe subkutane Region des Fußes injiziert, in die zuvor die Hyaluronidase gegeben wurde. Nach 10 Minuten werden goldbeschichtete Akupakupunkturnadeln wie gezeigt subkutan platziert. Die Elektroporationsimpulse werden abgegeben, nachdem die Nadeln bei Bedarf mit dem Stimulator verbunden wurden.Das Verfahren kann am kontralateralen Fuß wiederholt werden. Nach einem Zeitraum von zwei bis acht Tagen wird das Tier getötet, die Muskeln werden präpariert und die Transfektion des gewünschten Proteins durch Beobachtung der Fluoreszenz unter dem Mikroskop überprüft. Hallo, ich bin Marino DeFranco aus dem Labor von Julio Vera am Fachbereich Physiologie der Davy Geffen School of Medicine an der UCLA.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur In-vivo-Transfektion eines transgenen Proteins exprimierenden Plasmids in Muskel­fasern erwachsener Mäuse. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Expression und Lokalisation transgener Proteine sowie die Auswirkungen der Protein-Überexpression auf die Physiologie der Muskel­fasern zu untersuchen. Beginnen wir also.Bevor die Protokolle zur in-vivo-Elektroporation beginnen, müssen Säuger-Expressionsplasmide amplifiziert werden, um Konzentrationen im Bereich von zwei bis fünf Mikrogramm Plasmid pro Mikroliter TE-Puffer zu erhalten. Üblicherweise verwenden wir Amplifikationskits von Qiagen und befolgen die Anweisungen des Herstellers. Wir empfehlen kommerzielle Expressionsplasmide mit dem CMV-Promotor, beispielsweise EEG FPC one oder EEG FPN one von in Vitrogen.Da dieser Promotor in Skelettmuskel in vivo sehr gut funktioniert, werden wir den Vorgang demonstrieren. Mithilfe von P EEG FPN eins haben wir im Voraus eine Lösung vorbereitet, die zwei Milligramm pro Milliliter Hyaluronidase in steriler Tyro-Lösung enthält. Diese Lösung wird bis zur Verwendung zur Tierpräparation bei Raumtemperatur aufbewahrt.Für die Transfektion verwenden wir eine Betäubungskammer, die mit einer zugelassenen Gasnarkosemaschine verbunden ist, und betäuben das Tier tief mit 4 % Isofluran in Sauerstoff. Sobald das Tier betäubt ist, tragen wir eine Salbe auf, um die Augen der Maus während der folgenden Narkoseverfahren vor Austrocknung zu schützen. Legen Sie das Tier auf eine Heizplatte, die auf 37 Grad Celsius eingestellt ist, und halten Sie die Narkose mit einer Nasenmaske aufrecht.Überwachen Sie die Narkosetiefe durch Überprüfung des Zehenquetschreflexes. Wenn das Tier tief narkotisiert ist, verwenden Sie eine eine Zoll lange sterile Nadel mit 33 Gauge, um 10 Mikroliter der hochkonzentrierten UR-Lösung unter die Haut der Fußsohle eines Fußes der Maus zu injizieren. Beobachten Sie dies unter einem Stereomikroskop, durchstoßen Sie die Haut an einer Stelle nahe der Ferse und führen Sie die Nadel subkutan in Richtung der Zehenwurzeln fort.Injizieren Sie die Lösung etwa ein Viertel Zoll lang vorsichtig, um eine übermäßige Hautwölbung zu vermeiden. Wiederholen Sie den Vorgang mit dem anderen Fuß. Falls gewünscht, wird das injizierte Enzym im Laufe von etwa einer Stunde das Bindegewebe um die Muskel­fasern weich machen, indem es Hyaluronsäure hydrolysiert.Dies erleichtert die Diffusion des DNA-Plasmids, das anschließend in den interstitiellen Raum zwischen den Fasern injiziert wird. Nach der Injektion von Hyaluronidase trennen Sie die Anästhesie ab und stellen die Maus in einen Käfig. Das Tier erholt sich innerhalb von drei bis vier Minuten von der Anästhesie.Nach einer Stunde betäuben Sie das Tier erneut. Sammeln Sie 10 Mikroliter der Plasmidlösung und geben Sie einen Tropfen auf die Rückseite eines sauberen kleinen Molken-Bootes. Nehmen Sie den Tropfen mit der Injektionsspritze auf und injizieren Sie ihn in die Fußsohle.Es können größere Mengen Plasma injiziert werden, wenn das gleiche Verfahren wie für die Hyaluronidase-Lösung bei größeren Proteinen angewendet wird. Wir empfehlen, nicht mehr als 20 Mikroliter zu injizieren, wenn mehr als 15 Mikroliter erforderlich sind. Zur Vermeidung eines Risikos, dass DNA durch die Einstichstelle austritt, empfehlen wir, den Hautbereich an der Nadeleinstichstelle mit Gewebekleber zu verschließen.Trennen Sie die Anästhesie und stellen Sie die Maus in einen Käfig. Lassen Sie sie die Anästhesie vollständig überstehen und warten Sie 10 bis 15 Minuten, um die Elektroporation vorzubereiten. Betäuben Sie das Tier erneut wie zuvor beschrieben.Wählen Sie eine Pfote des Tieres aus, platzieren Sie eine vergoldete Akupunkturnadel oder Elektrode unter der Haut an der Ferse und die zweite an der Basis der Zehen. Die Nadeln sind parallel zueinander und senkrecht zur langen Achse der Pfote ausgerichtet. Die Akupunkturnadeln haben einen Durchmesser von 160 µm und eine Länge von 13 mm.Sie werden einzeln verpackt und steril angeboten. Je nach Nadelabstand die Pulsamplitude anpassen, um Spannungspulse abzugeben. Dabei ein elektrisches Feld von etwa 100 Volt pro Zentimeter erzeugen.Stellen Sie die Pulsdauer auf 20 Millisekunden und die Frequenz auf ein Hertz ein. Verbinden Sie den Elektrodenkopf mit dem elektrischen Stimulator unter Verwendung von Mikroklemmverbindern. Stimulieren Sie die Fußmuskulatur durch Anlegen von 20 elektrischen Impulsen.Überwachen Sie die Spannungsform innerhalb des Oszilloskops. Auf die Reize hin werden keine nennenswerten Kontraktionen beobachtet. Falls das Niveau der Anästhesie ausreichend ist, kann dies bei Bedarf durchgeführt werden, während das Tier noch unter Anästhesie steht.Wiederholen Sie das oben beschriebene Elektroporationsverfahren am anderen Fuß. Nach der Elektroporation bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück und beobachten es weiterhin. Bis zur vollständigen Genesung von der Anästhesie sollte das Tier innerhalb von fünf Minuten volle Bewegungsfähigkeit zurückgewinnen. Falls keine unerwünschten Reaktionen aufgetreten sind und der Eingriff normal verlaufen ist, geben Sie als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme Carfin für zwei Tage dem Trinkwasser des Tieres in einer Konzentration von 0,027 Milligramm pro Milliliter hinzu.Als Analgetikum kann die Proteineexpression zwei bis acht Tage nach der Transfektion untersucht werden. Eine dauerhafte Expression vieler Proteine wurde jedoch über Monate hinweg beobachtet. Die Transfektionseffizienz eines mit dem kommerziellen Plasmid P EEG FPN, das für das EGFP-Protein kodiert, elektroporierten FDB-Muskels lässt sich leicht mittels UV-Licht – entweder von einer handgehaltenen UV-Lampe oder von Hochleistungs-UV-Dioden – sichtbar machen.Bei Betrachtung der Mauspfote unter dem Stereomikroskop ist ersichtlich, dass die meisten Muskelzellen mit unserem Protokoll transfiziert wurden, wie durch die grüne Fluoreszenz der meisten Fasern veranschaulicht wird. Das Stereomikroskop zeigt das allgemeine Transfektionsmuster des Muskels. Wiederholung dieser Beobachtung.Mithilfe eines Epi-Fluoreszenzmikroskops lässt sich das Expressionsmuster von EGFP in Bündeln von Muskel­fasern oder sogar in einzelnen Fasern sichtbar machen. Die Effizienz der Expression des mCherry-Proteins in FDB-Muskel­fasern kann durch den Vergleich von Hellfeld- und Fluoreszenz­bildern des Muskels beurteilt werden. Die intrazelluläre Lokalisation der neu exprimierten transgenen Proteine kann mithilfe der Zweiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskopie evaluiert werden.Bilder der fluoreszenzmarkierten Proteine und Bilder gut identifizierter Marker zellulärer Strukturen werden gleichzeitig aufgenommen. Die am häufigsten verwendeten Marker zellulärer Strukturen sind die Bilder der zweiten harmonischen Generierung oder SHG-Bilder, die aus der Myosin-Anisotropie der Sarkomere stammen. A-Bänder, zentriert an den M-Linien, und Farbstoff.Angehängte Fluoreszenzbilder können erhalten werden, indem die Membranen des Oberflächen- und Quertubulussystems oder T-Tubuli-Systems der Muskel­fasern mit ihrer imperian potentia metric-Färbung in Fluoreszenzbildern von Muskel­fasern, die mit Farbstoff acht anep gefärbt sind, markiert werden. Die T-Tubuli erscheinen als schmale Fluoreszenz­bänder, die annähernd orthogonal zur langen Achse der Faser ausgerichtet sind. Diese Bänder weisen einen ungleichmäßigen Abstand zueinander auf.Sie sind durch eine lange Strecke getrennt, die sich über die M-Linien erstreckt, und eine kurze, die sich über die Z-Linie erstreckt. Ein Beispiel für die Expression einer markierten Variante des strukturellen Muskelproteins Alpha-Aktinin ist hier dargestellt. Dieses Protein ist ein Hauptbestandteil der Z-Linie und wird routinemäßig als Marker für diese Struktur verwendet.Wir transfizierten FDB- und IO-Muskeln mit dem Plasmid P-E-G-F-P Fpn, das für humanes nicht-muskuläres Alpha-Aktinin kodiert, welches am C-Terminus mit EGFP markiert ist, sechs Tage nach der Transfektion. Wir fanden heraus, dass Alpha-Aktinin hauptsächlich in schmalen, entlang der Faserachse gleichmäßig angeordneten Bändern exprimiert wird. Pro Sarkomer ist ein einzelnes Band sichtbar.Die Kolokalisation dieser Banden mit den Z-Linien ergibt sich aus dem Vergleich der Verteilung der EGFP-Fluoreszenz mit entweder den SHG- oder den D-eight-Annex-Bildern, wie durch das Überlagerungsbild gezeigt wird. Alpha-Actinin- und EGFP-Banden wechseln sich mit den SHG-Banden ab, was darauf hinweist, dass sie mittig zwischen zwei aufeinanderfolgenden M-Banden lokalisiert sind und somit mit der Position der Z-Linien in transfizierten Muskel­fasern übereinstimmen, die mit d an up Alpha-Actinin gefärbt wurden. EGFP-Banden erscheinen zentriert zwischen jedem Paar von T-Tubuli, die bekanntermaßen die Z-Linien flankieren. Dies zeigt, dass das transgene Alpha-Actinin gezielt an die Z-Linie transportiert wird.Die Expression und gezielte Anreicherung des am N-Terminus mit EGFP markierten DHPR-Alpha-1-s wird in Abbildung drei.EGFP gezeigt. Die Fluoreszenz erscheint hauptsächlich als Paare von Banden, die in einem Muster angeordnet sind, das dem der T-tubuli ähnelt. Die Überlagerung von SHG- und E-G-F-P-D-H-P-R-Alpha-1-s-Bildern zeigt, dass sich zwischen je zwei aufeinanderfolgenden SHG-Banden zwei EGFP-fluoreszierende Banden befinden, was darauf hindeutet, dass DHPR-Alpha-1-s korrekt zu den T-tubuli D-acht und Abstaining, nicht gezeigt, geleitet wurde und einen eindeutigen Nachweis der DHPR-Alpha-1-s-Tubuli-Zielgerichtetheit liefert. Fasern, die mit P-E-Y-F-P-CLC-1 transfiziert wurden, das einen am C-Terminus mit EYFP markierten Konstrukt des Chloridkanals CLC-1 der Skelettmuskulatur codiert, zeigen EYFP-Fluoreszenz-Banden, die der Anordnung der T-Tubuli entsprechen, wie mit D-acht und Abstaining veranschaulicht.Wie erwartet. Die Überlagerung der EYFP CLC1- und SHG-Bilder, wie in der Darstellung gezeigt, veranschaulicht, dass die SHG-Banden in der Mitte des großen Abstands zwischen den EYFP-Fluoreszenzbanden liegen. Um zu beurteilen, ob die Expression von EYFP CLC1, wie aufgrund der Überexpression funktioneller Chloridkanäle erwartet, zu einer signifikanten Zunahme der Ruheleitfähigkeit der Muskelzellen führt, haben wir Muskelzellen enzymatisch aus dem transfizierten FDB-Muskel isoliert und ihre elektrophysiologischen Eigenschaften mittels einer Versuchsanordnung mit zwei Mikroelektroden untersucht.Dieses Bild zeigt Ergebnisse von zwei Fasern. Eine exprimiert große Mengen EYFP-clc. Die andere wurde anhand von globalen Messungen der Fluoreszenzintensität in einem Standard-Fluoreszenzmikroskop bewertet, und die dritte ist eine nicht transfizierte Kontrolle.Die Spannungs­aufzeichnung wurde von der Muskel­faser erhalten, die EY FP CLC1 exprimierte. Ein Strom­impuls, der größer war als der zur Erregung einer Kontroll­faser erforderliche, löste in der transfizierten Faser nur eine geringe regenerative Antwort aus, als die äußere Tyro-Lösung durch eine Lösung ersetzt wurde, die 500 Mikromolar der Chlorid­kanal­blocker­substanz 9-Racine-carbonsäure oder 9-ACA enthielt. Ein kleinerer Impuls löste ein Aktions­potential aus, das jedoch, wie erwartet, viel langsamer und breiter war als die in der Kontroll­faser aufgezeichneten.Die Zugabe von neun a CA hatte minimale Auswirkungen auf die Kontrollfaser. Wir schlussfolgern, dass die Faser, die EY FP CLC exprimiert, aufgrund der übermäßigen Ruhechlorid-Leitfähigkeit nahezu nicht erregbar ist. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man ein Plasmid, das ein transgenes Protein exprimiert, mittels Elektroporation in eine lebende Skelettmuskelfaser transfiziert, und auch, wie man die Transfektionseffizienz sowie die Lokalisation und Funktion der transfizierten Proteine bewertet.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.I.

dna-transfection-mammalian-skeletal-muscles-using-vivo

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Tracking-Dynamics of Muscle Engraftment bei Kleintieren durch In Vivo Fluorescent Imaging

Ein Mausmodell einer neuromuskulären Elektrostimulation (NME) eine sichere und kostengünstige klinische Modalität, um den vorderen Abteil Muskeln beschrieben. Dieses Modell hat den Vorteil, Modifizieren eines leicht verfügbaren klinischen Einrichtung zum Zweck hervorzurufen gezielten und spezifischen Muskelkontraktionen in Mäusen.

Einem Mausmodell der Muscle Training durch neuromuskuläre Elektrostimulation

Ein nicht-invasiver Mittel, um den Erfolg der Transplantation Myoblasten auszuwerten beschrieben. Das Verfahren nutzt ein einheitliches Fusionsprotein Reportergen, dessen Expression von Genen kann mit unterschiedlichen Bildgebungsverfahren abgebildet werden zusammengesetzt. Hier nutzen wir...

Molecular Imaging Transplantierte Muscle Progenitor Zielzellen

Induzierte pluripotente Stammzell (iPSC)-abgeleitete myogene Vorläufer sind vielversprechende Kandidaten für Zelltherapiestrategien zur Behandlung von Muskeldystrophien. Dieses Protokoll beschreibt Transplantations- und Funktionsmessungen, die erforderlich sind, um die Engraftmentierung und Differenzierung von iPSC-abgeleiteten Mesoangioblasten (eine Art von Muskelvorläufern) in Mausmodellen der akuten und chronischen Muskelregeneration zu bewerten.

Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Dieses Protokoll verwendet Elektroporation, um fluoreszenzmarkierte Proteine in Muskelfasern von Mäusen einzuführen und zu exprimieren. Nach der Wiederherstellung nach der Elektroporation werden die Fasern isoliert. Einzelne Fasern werden dann mit hochauflösender konfokaler Mikroskopie abgebildet, um die Muskelstruktur sichtbar zu machen.

DNA Elektroporation, Isolierung und Imaging von Muskelfasern

Hier präsentieren wir eine in vivo Technik für den Gentransfer zu Schwann-Zellen (SCs) im Ischiasnerv der Nagetiere. Diese einfache Technik ist nützlich, um Signalmechanismen zu untersuchen, die an der Entwicklung und Aufrechterhaltung myelinisierender SCs beteiligt sind.

In vivo - Gentransfer auf Schwann - Zellen in der Nagerischiasnerv durch Elektroporation

Wir beschreiben eine neuartige experimentelle Technik, die nennen wir Minimal Invasive Muskel einbetten (MIME), basiert auf dem Beweis Skelettmuskelgewebe lebensfähige myogen Zellen enthält, die Spender-Zell-vermittelten Myogenesis bei implantiert erleichtern können Ein Host-Muskel.

Minimal-Invasive Muskel einbetten (MIME) - eine neuartige experimentelle Technik, Spender-Zell-vermittelten Myogenesis zu erleichtern

Die Elektroporation von Plasmid-DNA in die Skelettmuskulatur ist eine praktikable Methode, um die Genexpression zu modulieren, ohne die Muskelkontraktilität bei Mäusen zu beeinträchtigen.

Elektroporation von Plasmid-DNA in die Skelettmuskulatur der Maus

Dieses Protokoll beschreibt die Mikroinjektion und In-vivo-Elektroporation für die regional eingeschränkte CRISPR-vermittelte Genom-Editierung im Eileiter der Maus.

Somatic Genom-Engineered Mausmodelle mit In-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation

Die funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie ist eine Methode zur Untersuchung von Proteindomänenbewegungen in Echtzeit. Die Modifikation dieser Technik für ihre Anwendung in nativen Zellen ermöglicht nun die Detektion und Verfolgung einzelner Spannungssensorbewegungen von spannungsabhängigen Ca2+ -Kanälen in murinen isolierten Skelettmuskelfasern.

Funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie in nativen Zellen zur Untersuchung der Erregbarkeit der Skelettmuskulatur

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das in vivo Elektroporation und Denervierung des kranialen Musculus levator auris longus (LAL) kombiniert. Dieses Verfahren ermöglicht es, die mögliche Rolle von Muskelproteinen bei der Regeneration der neuromuskulären Synapse zu untersuchen.

Kombinierte In vivo Elektroporation und kurzfristige Reinnervation des kranialen Levator Auris Longus Skelettmuskel

Lernen Sie die In-vivo-Elektroporation zur DNA-Transfektion in Mäuse-Skelettmuskulatur. Diese Methode ermöglicht die effiziente Expression und Visualisierung transgener Proteine in lebenden Tieren.

DNA Transfektion von Säuger Skelettmuskulatur mit In Vivo Elektroporation

Weitere Videos entdecken