Vorbereitung der gepoolten menschlichen Thrombozyten-Lysat (PHPL) als effiziente Ergänzung zum tierischen Serum-freien menschlichen Stammzell-Kulturen
30. Oktober 2009
Menschliche Thrombozyten-Lysat ist eine reiche Quelle von Wachstumsfaktoren und eine starke Ergänzung in der Zellkultur. Dieses Protokoll stellt den Prozess der Vorbereitung einen großen Pool an menschlichen Thrombozyten-Lysat ausgehend von platelet rich plasma, Durchführung mehrerer Gefrier-Auftau-Zyklen und zum Abbau der Thrombozyten-Fragmente.
Dieses Protokoll beschreibt den Prozess zur Herstellung einer großen Menge an humanem Thrombozytenlysat, ausgehend von thrombozytenreichem Plasma. Durch Durchführung eines Gefrier-Tau-Zyklus werden die Thrombozyten lysiert. Anschließend werden mindestens 10 Einheiten eines humanen Thrombozytenlysats zu einer Charge gepoolten humanen Thrombozytenlysats oder PHPL zusammengefasst.
Dieses Volumen von etwa drei Litern wird weiter in Aliquote aufgeteilt und erneut eingefroren, um Thrombozytenfragmente zu entfernen. Diese Aliquote werden aufgetaut, in Vials überführt und zentrifugiert. Der Überstand ist das arm an Thrombozytenfragmenten liegende PHPL und enthält thrombozytenabgeleitete Wachstumsfaktoren, die zur Supplementierung von Zellkulturen verwendet werden.
Das verbleibende Pellet aus Plättchenfragmenten wird verworfen. Hallo, ich bin Kadina Sharmo aus dem Labor von Dr. TRO in der Einheit für Stammzellforschung an der Medizinischen Universität Grads. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung eines Pools menschlicher Thrombozytenisolate.
Wir beginnen mit thrombozytenreichem Plasma, führen mehrere Gefriertau-Zyklen durch und entfernen anschließend die Thrombozytenfragmente. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um eine ausreichende Ergänzung für Zellkulturen als Alternative zu fötalem Kälberserum zu erhalten. Beginnen wir also.
Dieses Protokoll beginnt mit thrombozytenreichem Plasma, das als PRP bezeichnet wird. Dieses Plasma kann entweder mittels Cy-Apherese hergestellt oder aus Buffycoats gewonnen worden sein. Personen außerhalb des Bereichs der Transfusionsmedizin sollten PRP von einer örtlichen Blutbank oder einem anderen autorisierten Anbieter beziehen.
Überprüfen Sie die Sterilität der PRP-Einheit, indem Sie 20 Milliliter aus jeder Einheit in einen kleinen angeschlossenen Beutel überführen und den Beutel mit dem Schweißgerät abtrennen. Diese Aliquotprobe kann unmittelbar nach der Herstellung zur Sterilitätsprüfung an ein mikrobiologisches Labor geschickt werden. Es ist wichtig, die PRP-Einheiten im ursprünglichen Lagerungsbeutel auf mindestens minus 20 Grad einzufrieren.
Sobald die bakteriellen Tests negativ sind, kann der nächste Schritt durchgeführt werden. Achten Sie darauf, dass das humane Thrombozytenlysat, das nun als HPL bezeichnet wird, nicht übermäßig warm wird; stellen Sie die HPL-Einheiten in ein Wasserbad mit 37 Grad, bis die Eisgerinnsel verschwunden sind. Nach diesem Einfrier- und Auftauvorgang sollten die Thrombozyten lysiert werden, um ein standardisiertes Produkt für jeden Thrombozytenlysat-Pool herzustellen.
Sammeln Sie 10 bis 15 aufgetaute PRP-Einheiten. Verbinden Sie jeden aufeinanderfolgenden HPL-Beutel mit dem Sammel-Doppelbeutel und überführen Sie das HPL in diese beiden Beutel. Trennen Sie die leeren HPL-Beutel mithilfe des Schweißgeräts ab.
Mischen Sie den Inhalt der beiden Beutel, um ein Endvolumen von drei bis vier Litern gepooltem humanen Thrombozytenlysat zu erhalten. Dies wird nun als PHPL bezeichnet. Verbinden Sie einen kleinen Beutel und entnehmen Sie eine 20-Milliliter-Probe des PHPL, um die Sterilität des gepoolten Produkts zu überprüfen.
Portionieren Sie Proben von PHPL für die weitere Verarbeitung, indem Sie kleine Beutel mit dem Sammel-Doppelbeutel verbinden. Überführen Sie Volumina von etwa 250 Milliliter in die kleinen Lagerungsbeutel und trennen Sie anschließend die gefüllten Beutel mit dem Schweißgerät ab. Führen Sie nun einen zusätzlichen Gefrier-Tau-Zyklus durch, um die Rate der Thrombozyten-Fragmentierung und die Menge freigesetzter Wachstumsfaktoren zu erhöhen.
Führen Sie dies durch, indem Sie die kleinen Beutel mit portioniertem PHBL bei minus 20 Grad einfrieren. Anschließend tauen Sie die Beutel in einem 37-Grad-Wasserbad im laminar flow hoods auf.
Verwenden Sie sterile Scheren, um das Röhrchen jedes Beutels aufzuschneiden und zu öffnen, und gießen Sie anschließend das PHPL in 50-Milliliter-Fläschchen. Oft neigen Thrombozytenfragmente zur Aggregation; Thrombozyten können außerdem eine Alloimmunisierung auslösen. Um diese Bedingungen zu vermeiden, entfernen Sie die Fragmente aus dem PHPL durch Zentrifugation bei 4.000 ×g für 15 Minuten in einer gekühlten Zentrifuge.
Als Nächstes pipettieren Sie das plasmatische Überstand in die endgültigen Lagergefäße und entsorgen die Thrombozyten-Pellets, um zu verhindern, dass Fragmente in Ihren Zellkulturen einfrieren. Lagern Sie 50-Milliliter-Aliquote von PHPL erneut bei minus 20 Grad bis zur weiteren Verwendung. Nachdem nun PHPL, das arm an Thrombozytenfragmenten ist, hergestellt wurde, können die Eigenschaften des Lysats analysiert werden.
Funktion und Qualität des gepoolten Thrombozytenlysats werden in Zellkulturen getestet und durch die effiziente Stimulation der Zellproliferation belegt; die Vermehrung mesenchymaler stromaler Zellen oder MSCs sowie endothelialer koloniebildender Zellen, E CFCs, ist erfolgreich mit plättchenfragmentarmem PHPL möglich. Unser schriftlicher Protokollteil mit den Mediumrezepturen ist hier einsehbar. Zwei Anwendungen für gepooltes humanes Thrombozytenlysat.
In der Kultur mesenchymaler stromaler Zellen ist dargestellt, dass MSCs des Spenders eins entweder mit PHPL oder mit plättchenfreien Fragmenten depletiertem PHPL kultiviert wurden. Wie angegeben, ist hier eine stärkere Fragmentkontamination zu erkennen im Vergleich zum alleinigen, fragmentdepletierten PHPL. Plättchenfragmente unterstützen das Wachstum von MSCs nicht ausreichend.
Alle drei Bilder wurden nach 13 Tagen Kultur angefertigt. Die MSCs des Spenders zwei wurden neun Tage lang in thrombozytenfragmentverarmtem PHPL anstelle von thrombozytenreichem Plasma kultiviert. Beachten Sie, dass PRP ohne Thrombozytenlyse das Auswachsen der MSCs nicht ausreichend unterstützt.
Siehe auch das JoVE-Protokoll von Andreas Reish, das die Verwendung fragmentdepletiertes PHPL zur Isolierung und Kultivierung von menschlichen Nabelschnurblut-abgeleiteten MSCs beschreibt. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man PHPL herstellt, um tierisches Serum in Ihren Stammzellkulturen vollständig zu ersetzen. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, daran zu denken, die Thrombozytenfragmente zu entfernen, bevor Heparin und PHPL dem Kulturmedium zugegeben werden.
Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von humanem Thrombozytenlysat (HPL) aus thrombozytenreichem Plasma (PRP). Der Prozess umfasst Gefrier-Tau-Zyklen zur Lyse der Thrombozyten und zur Erzeugung eines lysierten Produkts, das arm an Thrombozytenfragmenten und reich an Wachstumsfaktoren für die Supplementierung der Zellkultur ist.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellkultur
- Thrombozytenbiologie
- Wachstumsfaktorforschung
Hintergrund
- Menschliches Thrombozytenlysat ist ein wirksames Supplement in der Zellkultur.
- Es enthält verschiedene Wachstumsfaktoren, die für die Zellproliferation und -differenzierung essentiell sind.
- Der Herstellungsprozess ist entscheidend, um die Qualität und Wirksamkeit des Lysats sicherzustellen.
- Thrombozytenreiches Plasma dient als Ausgangsmaterial für die Herstellung von HPL.
Zweck der Studie
- Eine detaillierte Anleitung zur Herstellung von humanem Thrombozytenlysat bereitstellen.
- Gewährleistung der Entfernung von Thrombozytenfragmenten für ein reineres Lysat.
- Die Verwendung von HPL in verschiedenen Zellkultur-Anwendungen erleichtern.
Verwendete Methoden
- Ausgehend von thrombozytenreichem Plasma (PRP).
- Durchführung von Gefrier-Tau-Zyklen zur Lyse der Thrombozyten.
- Herstellung von gepooltem humanem Thrombozytenlysat (PHPL).
- Zentrifugation zur Entfernung von Thrombozytenfragmenten aus dem Überstand.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Herstellung einer großen Menge menschlichen Thrombozytenlysats.
- Entfernung von Thrombozytenfragmenten durch Zentrifugation.
- Ausbeute von etwa drei Litern thrombozytenabgeleiteter Wachstumsfaktoren.
- Herstellung geeignet zur Zugabe in Zellkulturen.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine zuverlässige Methode zur Herstellung von humanem Thrombozytenlysat.
- HPL kann die Ergebnisse der Zellkultur erheblich verbessern.
- Weitere Studien können die Anwendungen von HPL in verschiedenen Forschungsbereichen untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Kultursysteme ohne tierisches Serum sind entscheidend, um die therapeutische Anwendung von Stammzellen in die klinische Praxis zu übertragen und regulatorischen Anforderungen gerecht zu werden. Dieses Protokoll ermöglicht die skalierbare Herstellung von humanem Thrombozytenlysat (pHPL) als definiertes, xenofreies Supplement, das die Proliferation mesenchymaler stromaler Zellen und die Ausbreitung endothelialer koloniebildender Zellen unterstützt. Durch die Standardisierung der Thrombozytenlyse und die Entfernung von Fragmenten werden die Variationen zwischen Chargen verringert und die Reproduzierbarkeit in frühen Forschungsphasen sowie präklinischen Arbeitsabläufen verbessert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet ein definiertes, menschlich gewonnenes Supplement, das mechanistische Untersuchungen der Signalwege der Stammzellproliferation und -differenzierung ermöglicht.
- Operativer Wert: Ermöglicht konsistente Kulturbedingungen über verschiedene Experimente hinweg und verringert so die Variabilität in Target-Validierungsassays.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet ein standardisiertes, wachstumsfaktorreiches Medium, das zuverlässige Ergebnisse in funktionellen Stammzell-Assays ermöglicht.
- Operationaler Wert: Unterstützt die Standardisierung von Assays durch einen fragmentarmen Lysat und minimiert so Störungen durch Thrombozytenaggregate in Screening-Plattformen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die expansion krankheitsrelevanter Stammzellen unter xenefreien Bedingungen und erfüllt damit die Anforderungen an translationsrelevante Biomarker und präklinische Modelle.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die skalierbare Produktion aus gepoolten Spenderquellen und unterstützt so den Technologietransfer sowie die Entwicklung von GMP-nahen Prozessen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess, indem sie eine serumfreie Zusatzlösung für die Stammzellkultur von der frühen Target-Validierung bis zur präklinischen Expansion bereitstellt und so die Identifizierung von Leitverbindungen sowie die mechanistische Risikominimierung unterstützt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung bei der Stammzellproliferation und -differenzierung, indem ein konsistentes, definiertes Mikroumfeld bereitgestellt wird.
- Screening: Ermöglicht reproduzierbare Tests von Substanzen oder Bedingungen in stammzellbasierten Assays durch einen standardisierten, fragmentarmen Lysat.
- Analytik: Liefert quantifizierbare Ergebnisse wie Proliferationsraten der Zellen und Effizienz der koloniebildenden Einheiten und ermöglicht somit den Vergleich unterschiedlicher Kulturbedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet Grundlagenforschung mit präklinischer Arbeit, indem die Expansion mesenchymaler stromaler Zellen und endothelialer Vorläuferzellen unter klinisch relevanten, tierversuchsfreien Bedingungen unterstützt wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft einen wiederverwendbaren, skalierbaren Prozess zur Herstellung eines klinisch tauglichen Supplements aus routinemäßig gewonnenem thrombozytenreichem Plasma und verringert damit die Abhängigkeit von variablen tierischen Serumpräparaten.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert das Vorhersagevertrauen bei Ergebnissen der Stammzellkultur, indem undefinierte tierische Serumkomponenten eliminiert und die Zufuhr von Wachstumsfaktoren standardisiert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch die Verarbeitung gepoolter Spenderproben sowie standardisierte Einfrier- und Auftauprozesse und Zentrifugationsschritte.
- Strategischer Wert: Verringert das biologische Risiko in der Entwicklung von Zelltherapien, indem eine humanbasierte, xenofreie Alternative zum fetalen Kälberserum bereitgestellt wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung, indem konsistente präklinische Datengenerierung in definierten Kultursystemen ermöglicht wird.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in sterilen Zellkultivierungstechniken, der Handhabung von Thrombozyten sowie Zentrifugationsprotokollen.
- Hängt von dem Zugang zu thrombozytenreichem Plasma von autorisierten Blutbanken oder Transfusionsdiensten sowie von steriler Schweiß- oder Versiegelungsausrüstung für die Manipulation von Beuteln ab.
- Erfordert standardisierte Sterilitätstests des eingesetzten PRP und des gepoolten Lysats vor und nach der Verarbeitung, um die Sicherheit der Kultur zu gewährleisten.
- Erfordert die Anpassung der Kulturprotokolle, um lot-spezifische Wachstumsfaktorkonzentrationen trotz der Pooling-Strategie zu berücksichtigen.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit mehrfacher Gefrier-Tau-Zyklen und von Zentrifugationsschritten, die die Verarbeitungsdauer verlängern und spezielle Ausrüstung erfordern.
