Isolation und großräumige Ausdehnung der erwachsenen Menschen Endothelial Colony Forming Progenitorzellen

Durch einfache Kultivierung des Gesamtblutes mit tierischem serumfrei optimiertem Medium. In einem 75 Quadratzentimeter großen Kolben haften E-FCKW an der Kolbenoberfläche, um den größten Teil der roten und weißen Blutkörperchen zu entfernen. Waschen Sie den Kolben am ersten Tag und beseitigen Sie die verbleibenden Zellen, indem Sie am fünften Tag das Gesamtmedium wechseln.

Führe ein Screening auf Bienenvölker jeden zweiten Tag durch, oder, wenn es möglich ist, dreimal pro Woche. Und die ersten Völker solltest du um den 12. Tag herum beobachten. Hallo, mein Name ist Nicole Hoffman aus dem Labor der Stammzellforschung der Medizinischen Universität grots.

Heute zeigen wir Ihnen ein vereinfachtes Verfahren zur Isolierung und Expansion von endothelialen koloniebildenden Vorläuferzellen oder ECFC aus adultem humanem peripherem Blut. In unserem Labor nutzen wir dieses Verfahren, um die Funktion und Biologie von ECFC in vitro und in vivo zu untersuchen. Also lasst uns loslegen.

Dieser Abschnitt beginnt mit der Aufbereitung und Filtersterilisation von Endothelwachstumsmedium zwei, das zur Kultivierung verwendet wird. Die EFCs erwärmen 20 Milliliter Medium in einem 37 Grad heißen Wasserbad. Ziehen Sie fünf Milliliter peripheres Blut von Erwachsenen aus der Cubitalvene in ein sechs Milliliter konservierungsmittelfreies Natrium-Heparin-Blutvacutainer-Röhrchen.

Blutproben müssen innerhalb von zwei Stunden nach der Entnahme in einer Laminar-Flow-Haube verarbeitet werden. Ein 1 75-Quadratzentimeter-Kolben der Reihe mit belüftetem Deckel, 1 25-Milliliter-Pipette und zwei Fünf-Milliliter-Pipetten in einer Laminar-Flow-Bank. Den Kolben mit einer 25-Milliliter-Pipette mit 15 Millilitern vorgewärmtem zugesetztem E GM two vorfüllen.

Öffnen Sie die Blutdatei und geben Sie mit der Fünf-Milliliter-Pipette alle fünf Milliliter Blut direkt in den Kolben. Spülen Sie mit der Pipette das leere Blutfläschchen mit den restlichen fünf Millilitern E GM two aus der Vorkriegszeit. Geben Sie dieses Volumen in den Kolben.

Schließen Sie den belüfteten Deckel des Kolbens, der nun 25 Milliliter fassen sollte. Stellen Sie den Kolben 24 Stunden lang in einen Inkubator bei 37 Grad, 5 % Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit. Am nächsten Tag werden 20 Milliliter supplementiertes e GM, zwei und 30 Milliliter PBS in einem 37 Grad heißen Wasserbad vorgewärmt und 2 25 Milliliter Pipetten und drei 10 Milliliter Pipetten in einer Laminar-Flow-Haube angeordnet.

Der Kolben mit der Probe wird aus dem Inkubator genommen und mit einer 25-Milliliter-Pipette das mittlere Blutgemisch entfernt, das nicht anhaftende Zellen enthält. Achten Sie darauf, dass Sie die Oberfläche des Kolbens nicht mit der Pipette zerkratzen. Um ein Abkratzen der adhärenten Zellen zu vermeiden, geben Sie vorsichtig 10 Milliliter vorwarmes PBS auf die innere Oberfläche der Kolbenzellen, und kippen Sie den Kolben von einer Seite zur anderen.

Entfernen und entsorgen Sie den PBS sofort. Wiederholen Sie dies, waschen Sie es zweimal. Dann schnell und schonend arbeiten.

Um ein Ablösen der Zellen zu vermeiden, geben Sie 20 Milliliter frisches, vorwarmes e GM two in den Kolben und stellen Sie ihn wieder in den Inkubator. Achten Sie darauf, den Kolben nicht länger als fünf Minuten außerhalb des Inkubators zu führen, und überprüfen Sie jeden zweiten Tag mit einem Lichtmikroskop mit geringer Vergrößerung auf ECFC-Auswüchse im Kolben. Beginnen Sie am zweiten Tag, am fünften Tag nach der Aussaat vor dem Krieg, 20 Milliliter EGM zwei in ein 37 Grad heißes Wasserbad und bereiten Sie 2 25-Milliliter-Pipetten vor.

Schnelles Arbeiten, um ein Austrocknen zu verhindern. Verwenden Sie diese Verbrauchsmaterialien, um das Medium durch frisches, vorgewärmtes Zusatzmittel e GM zwei zu ersetzen, wodurch nicht anhaftende Zellen entfernt werden. Setzen Sie den Kolben wieder in den Inkubator ein und wiederholen Sie den Siebvorgang täglich.

Ersetzen Sie 30% des Mediums durch frisch ergänztes Egm. Zwei zweimal pro Woche. Typische Kolonien mit Kopfsteinpflaster-Morphologie sollten um den 12. Tag herum auftreten.

Die obere Außenseite des Kolbens ist zu markieren, um die Position der einzelnen Kolonien anzugeben. Lassen Sie die Kolonien bis zum 28. Tag wachsen, es sei denn, einzelne Zellen beginnen sich abzulösen. Sobald die Primärvölker identifiziert wurden, können sie je nach Größe zwischen dem 14. und 28. Tag geerntet werden.

Erwärmen Sie fünf Milliliter einer Trypsin-EDTA-Lösung und 20 Milliliter PBS auf 37 Grad. Das gesamte Medium wird unter Ächtung der Oberfläche des Kolbens in ein Falkenröhrchen überführt. Dies wird später verwendet, um die Trypsinaktivität zu unterdrücken und die Zellen vorsichtig mit 10 Millilitern PBS aus der Vorkriegszeit zu waschen.

Fügen Sie fünf Milliliter Trips in EDTA hinzu und inkubieren Sie die Lösung etwa fünf Minuten lang bei 37 Grad oder bis sich die Zellen lösen. Achten Sie darauf, dass Sie nicht länger als sieben Minuten inkubieren, da Trypsin nach der Inkubation für die Zellen giftig werden kann. Klopfen Sie kräftig auf die Seiten des Kolbens, damit sich die Zellen nach der Reaktion ablösen können. Die Aktivität der Tryinprotease wird durch Zugabe von etwa 10 Millilitern des konservierten gebrauchten Nährmediums gestillt.

Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Falkenröhrchen. Waschen Sie den Kolben einmal mit 10 Millilitern PBS und geben Sie die Waschlösung zur geernteten Zellsuspension. Die Zellsuspension wird sieben Minuten lang in einer gekühlten Zentrifuge mit dem 300-fachen G geschleudert, um die Zellen zu sammeln und das Trypsin zu entfernen, den Überstand zu verwerfen und das Zellpellet sofort in einem Milliliter PBS wieder zu suspendieren.

Halten Sie die resuspendierten Zellen auf Eis. Bestimmen Sie die Zellzahl, wie in einem anderen JoVE-Protokoll von Ricardo und Phelan beschrieben. Fahren Sie dann mit der ECFC-Erweiterung fort.

Für den Fall, dass mehr als 360.000 E-FCKW zurückgewonnen werden, fahren Sie mit der Expansionsstufe fort, falls weniger als 260.000 E-FCKW zurückgewonnen werden. Erwägen Sie, die Zellen weiter zu erweitern, bevor Sie sie in großem Maßstab erweitern. Tun Sie dies, indem Sie etwa 75.000 EFCs in 20 Milliliter E GM zwei in einen 75 Quadratzentimeter großen Zellkulturkolben säen und eine weitere Woche lang oder bis zur Konfluenz kultivieren.

Zugabe von 500 Millilitern E GM two, wie im beigefügten schriftlichen Protokoll beschrieben, und Vorwärmen dieser Mischung in einem 37 Grad heißen Wasserbad. Bereiten Sie für jeweils ca. 2.500 Quadratzentimeter Kulturfläche eine vierschichtige Zellfabrik oder CA vier vor. Sammeln Sie zusätzlich zwei frische Tyvek-Kappen und einen speziellen sterilen Trichter und lagern Sie sie in der Laminar-Flow-Haube, um E-FCKW mit einer Ausgangszelldichte von 100 Zellen pro Quadratzentimeter zu säen.

Berechnen Sie zunächst die Zellzahl für jedes CF-vier 250,2, 800. Die Zellen werden in 500 Millilitern frischem E GM zwei resuspendiert und in das CF vier gegossen. Verwenden Sie einen sterilen Trichter, verwenden Sie die abgedeckte Tyvek-Kappe, um eine Entlüftung zu schließen, und kippen Sie den CF um vier zu eins zur Längsseite, um eine gleichmäßige Verteilung des Mediums auf alle vier Ebenen zu ermöglichen.

Nun kann die Kammer nach hinten gekippt und der Deckel der Tyvek-Kappe geöffnet werden. Achten Sie darauf, die offenen Lüftungsschlitze mit zwei roten Kappen zu schützen. Diese Kappen können mit dem CF four auf dem Weg zum Inkubator erworben werden.

Stellen Sie den CF four in den Inkubator und entfernen Sie die roten Kappen, um den Gasaustausch von 20 % des Mediums mit dem Vorkriegsmedium mindestens einmal wöchentlich zu ermöglichen, bis der CF four konfluent ist. Dieser Prozess ist spenderabhängig und wird wahrscheinlich nach 10 bis 14 Tagen stattfinden. Schließlich können die Zellen wie zuvor beschrieben geerntet werden, indem Vorkriegs-Tripsin EDTA und das verwendete Medium verwendet werden, um die Proteaseaktivität zu unterdrücken.

Verwenden Sie außerdem etwa 200 Milliliter PVS zum Waschen etwa am 12. Tag. ECFC-Kolonien beginnen mit einer typischen Kopfsteinpflaster-Morphologie zu erscheinen, wie Sie sie in dieser Kolonie sehen können, oder als einige gruppierte Zellen wie in dieser Kolonie, die am Tag 12 gefunden wurde. Wenn die Kolonien wachsen, bilden mehr Zellen die typische Kopfsteinpflaster-Morphologie.

Wie Sie hier sehen können, können die isolierten e FCKW nach 15 Tagen und nach 18 Tagen immunchemisch mit typischen Endothelzelloberflächenmarkern wie CD 1 46, CD 1 44, CD 31 fermentierend und vom Willebrand-Faktor charakterisiert werden. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie bei diesem Verfahren eine Endothelkolonie isolieren und erweitern, die Vorläuferzellen aus dem peripheren Blut des erwachsenen Menschen bildet. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Erfolgsquote dieses Protokolls spenderabhängig ist und zwischen 50 und 70 % liegt.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.