Name: Isolation und großräumige Ausdehnung der erwachsenen Menschen Endothelial Colony Forming Progenitorzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-28T07:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Lernen Sie die Isolation und Expansion von Endothelial Colony Forming Progenitorzellen aus menschlichem peripherem Blut mit serumfreiem Medium. Diese Methode minimiert Immunisierungsrisiken und unterstützt die Gefäßbiologie-Forschung.

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Die Autoren danken Dr. Katharina Schallmoser für die Bereitstellung PHPL und Margaretha Frühwirth und Daniela Thaler für hervorragende technische Unterstützung.

A.) ECFC ISOLATON TAG 1: <ol><li> Bevor Sie mit Start der Vorbereitung des Experiments das Zellkulturmedium Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2). Supplement 500ml Endothelial Basal Medium-2 mit Heparin (1ml von 1000 U / ml), 5ml 100x Lösung von Penicillin / Streptomycin (alle Sigma, St. Louis, MO; <a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a> ), L-Glutamin (2 mM Endkonzentration ) und 50 ml gepoolten menschlichen Thrombozyten-Lysat (PHPL). Dann fügen Sie 0,2 ml Hydrocortison, 2 ml hFGF-B, 0,5 ml VEGF, 0,5 ml EGF, 0,5 ml IGF-1 und 0,5 ml Ascorbinsäure (sofern als SingleQuots, alle Lonza, Walkersville, MD; <a href="http://www.lonzabioscience.com/">http://www.lonzabioscience. com /</a> ). Sterile Filtrat das Medium durch einen 0,2 m-Porengröße 500 ml Millipore Vakuum-Filter. Da PHPL bildet kleine Klumpen müssen Sie möglicherweise zwei Filtern für ein Medium. Pre-warm gefiltert EGM-2 bis 37 ° C im Wasserbad </li><li> Sammeln Sie die Blutproben, indem 5 ml der erwachsenen menschlichen peripheren Blut aus der Cubitalvene in eine 6ml Konservierungsstoffe Natrium-Heparin-Blut Vacutainer-Röhrchen. Sie sollten die Blutproben innerhalb von maximal zwei Stunden zu bearbeiten. </li><li> Beginnen Sie mit der Vorbereitung eine 75 cm 2 (T75; Costar) Kolben mit einem belüfteten Kappe, einer 25 ml Pipette und zwei 5 ml Pipetten in einer laminaren Strömung Bank. </li><li> Pre-fill 15 ml vorgewärmten EGM-2 in den Kolben ergänzt mit 25 ml Pipette. Öffnen Sie nun das Blut Fläschchen und Probe alle 5 ml mit 5 ml Pipette in den Kolben. Spülen Sie die leere Blut Fläschchen mit 5 ml zusätzliche EGM-2 mit dem zweiten 5 ml Pipette. Das Gesamtvolumen innerhalb der T75 ist 25 ml. Schließen Sie die entlüftet-Cap der Flasche und in einem Brutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2 und 95% Luftfeuchtigkeit für 24 Stunden. </li></ol> TAG 2: <ol><li> Nach ca. 24 Stunden (über Nacht) sollten Sie entfernen die mittel-Blut-Gemisch, um loszuwerden, nicht adhärente Zellen. Für diese Ausarbeitung von zwei 25 ml Pipetten und drei 5-ml-Pipetten in der laminaren Strömung, pre-warme 20 ml ergänzt EGM-2 (vorbereitet vom Vortag) und 30 ml PBS auf 37 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Entfernen Sie den Kolben mit der Probe aus dem Inkubator und entfernen Sie alle den Überstand mit einer 25 ml Pipette. Achten Sie darauf, den Kolben Oberfläche kratzen, um eine Beschädigung mögliche Kolonie. Waschen Sie den inneren Kolben Zelladhärenz Oberfläche dreimal durch vorsichtiges Zugeben von 10 ml vorgewärmtes PBS und Kippen des Kolbens von einer Seite zur anderen. Entfernen Sie die PBS sofort jeder Zeit und zu verwerfen. </li><li> 20 ml frisches vorgewärmtes EGM-2 in den Kolben und legen Sie sie zurück in den Inkubator. Dieser Prozess sollte so schnell und schonend wie möglich für die anhaftenden Zellen nicht zu lösen durchgeführt werden. ECFCs leicht lösen, wenn sie in PBS oder bei Raumtemperatur zu lange gehalten werden. </li><li> Bildschirm durch den Kolben systemisch jeden zweiten Tag ab Tag zwei mit einem geringer Vergrößerung eines Lichtmikroskops auf der Suche nach ECFC Auswuchs. Wenn eine Kolonie Marke auf der Oberseite zu finden an der Außenseite des Kolbens, der die Position der Kolonie. Beachten Sie, dass die Flaks sollte nicht außerhalb des Inkubators für mehr als 5 Minuten. </li></ol> TAG 5: <ol><li> Am fünften Tag nach der Aussaat eine vollständige mittlere Änderung nicht adhärente Zellen zu entfernen. Zu diesem Zweck vorwärmen 20 ml EGM-2 bis 37 ° C im Wasserbad und bereiten zwei 25-ml-Pipetten. </li><li> Entfernen Sie den vollständigen Medium mit einer 25 ml Pipette und fügen frische, vorgewärmte ergänzt EGM-2 so schnell wie möglich. Die Zellen sollten nicht ohne Medium für mehr als eine Minute, um zu vermeiden Trocknen gelassen werden. Legen Sie wieder in den Inkubator und wiederholen Screening der Flasche täglich. </li><li> Feed the-Zellen durch den Ersatz von 30% des Mediums durch frisches ergänzt EGM-2-mal wöchentlich. </li></ol> TAG 14-28: <ol><li> Typische Kolonien mit Kopfsteinpflaster Morphologie sollte etwa 12 Tage angezeigt werden. Mark der oberen Außenseite des Kolbens auf die Position der einzelnen Kolonie zeigen. Lassen Sie den Kolonien bis Tag 28 wachsen, wenn einzelne Zellen zu lösen beginnen. Einmal, sind in erster Linie Kolonien identifiziert sie zwischen den Tagen 14 und 28 geerntet werden kann, abhängig von ihrer Größe. </li></ol> B.) ECFC HARVEST <ol><li> Pre-warm 5 ml Trypsin 0,05% / EDTA, 20 ml PBS und 5 ml frisch ergänzt EGM-2. </li><li> Vollständig zu entfernen Medium aus der Flasche in ein Falcon-Röhrchen (Vorsicht, nicht an der Oberfläche des Kolbens nicht zu beschädigen mögliche Kolonie touch) und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 10 ml vorgewärmter PBS. </li><li> 5 ml Trypsin / EDTA und Inkubation für 5 Minuten in den Inkubator. Die Zellen sollten nicht auf Trypsin für mehr als 7 min ausgesetzt werden, da es giftig wird. Gründlich Antippen der Seiten des Kolbens hilft Zellen zu lösen. Quench Trypsin-Protease-Aktivität durch Zugabe von ca. 10 ml der erhaltenen verwendet Kulturmedium. </li><li> Entfernen Zellsuspension in eine 50 ml Falcon Rohr. Waschen Sie die Flasche einmal mit 10 ml PBS, die danach auf den geernteten Zellsuspension zugegeben. Centrifuge die Zellsuspension bei 300 g für 7 min bei 4 ° C zu sammeln die Zellen und entfernen Sie die Trypsin. Überstand verwerfen und Zellpellet sofort in 1 ml PBS. Keep on ice. </li><li> Bestimmen der Zellzahl, wie in einem JoVE Protokoll, das von R. Ricardo und K. Phelani beschrieben. 5 </li></ol> C) ECFC EXPANSION <ol><li> Supplement 500 ml EGM-2 als in A 1.1 beschrieben). Pre-warm bis 37 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Für etwa 2500 cm 2 Kultur Raum bereiten entweder 11 T220 (225 cm 2) oder 15 T175 (175 cm 2) oder einer vierschichtigen Zellfabrik (CF-4; Nunc, Naperville, IL; <a href="http://www.nuncbrand.com/">http://www.nuncbrand . com</a> ). Zusätzlich benötigen Sie zwei frische Luft-caps und einer speziellen sterilen Trichter in der Laminar-Flow-bench. </li><li> Um Samen ECFCs bei einem Ausgangs-Zelldichte von 100 c / cm 2 Berechnung der Zellzahl ist notwendig. Zum einen CF-4 252800 Zellen werden in 500 ml frisches EGM-2 resuspendiert und ergossen sich in die CF-4 mit dem sterilen Trichter. Schließen Sie eine Entlüftung mit der vent-Kappe und kippen Sie das CF-4 zu einer Länge Seite, so dass eine gleichmäßige Verteilung des Mediums zwischen allen 4 Mehle. Dann kippen die Kammer zurück und öffnen Sie den Deckel des vent-cap. Legen Sie CF-4 in Inkubator. </li><li> Ändern Sie 20% des Mediums mindestens einmal wöchentlich, bis CF-4 ist konfluent. </li><li> Ernten Sie die Zellen wie in B beschrieben) mit 70 ml Trypsin / EDTA und ca. 200 ml PBS. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Mit dieser Trennung Methode beobachteten wir eine primäre Koloniebildung am Tag 12. In einer früheren Studie konnten auf einen Mittelwert von 4,0 ± 0,8 ECFC-Kolonien aus jeder ml der peripheren Blut gewonnen zu erholen. 4 ECFCs zeigte eine typische Kopfsteinpflaster Aussehen. Nach großräumige Ausdehnung, mit einer Aussaatdichte von 100 Zellen / cm 2, erhalten wir&gt; 1 x 10 8 Zellen in insgesamt rund 30 Tage aus 3 männlichen und 1 weiblichen Probanden (Alter zwischen 26 und 50 Jahre). ECFC unter diesen Bedingungen kultiviert wurden gezeigt, dass proliferative, funktional und genomisch stabil. 4 Darüber Zellen gespeichert werden kann (in 10% DMSO) in flüssigem Stickstoff für die weitere Verwendung sein. 3,4

<ol><li>Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+activated+endothelial+cells+in+sickle+cell+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia.</a> N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).</li>
<li>Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li>
<li>Schallmoser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+large-scale+expansion+of+functional+mesenchymal+stem+cells+from+unmanipulated+bone+marrow+without+animal+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum.</a> Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).</li>
<li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+large-scale+expanded+endothelial+colony-forming+cells+function+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo.</a> Blood. , (2009).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+and+Determining+the+Viability+of+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Counting and Determining the Viability of Cultured Cells.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

Diese neuartige Isolierung und Expansion Methode ist ein einfaches und effizientes Verfahren, die effizienter und weniger zeitaufwendig, indem es jegliche Zellseparation (keine Dichtegradienten erforderlich) und weniger teuer als herkömmliche Techniken. Durch die Verwendung von PHPL Kontakt zu Rindern Antigene und vermeintlichen späteren xenoimmunization ist ausgeschlossen. Während der Kulturzeit kleine Blutgerinnsel bilden können, die durch die PHPL. Basierend auf unserer Erfahrung diese Blutgerinnsel haben keinen Einf...

<table><tbody><tr><td>Endotheliales Basalmedium-2</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td>500 ml</td></tr><tr><td>EGM-2 SingleQuots</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td>EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortison, Ascorbinsäure</td></tr><tr><td>Konservierungsmittelfreies Heparin</td><td>Biochrom AG</td><td></td><td>10 U/ml pro EGM-2</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>2 mM pro EGM-2</td></tr><tr><td>Penicillin und Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>100 U/mL Penicillin und&lt;br/&gt;100&amp;#x03BC;g/mL Streptomycin pro&lt;br/&gt;EGM-2</td></tr><tr><td>Trypsin/1 mM EDTA</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>7 ml für T75-Flasche&lt;br/&gt;70 ml für CF-4</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vierstöckige Zellfabrik (CF-4)</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriler Trichter</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;-Kultivierungsflasche (mit belüftetem Verschluss)</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-mL-Vakutainer-Röhrchen (konservierungsmittelfreies Natriumheparin)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>vorgefüllt mit 108 IE/6 ml&lt;br/&gt;konservierungsmittelfreiem Natriumheparin</td></tr><tr><td>50-ml-Falcon-Röhrchen</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-ml-Stripetten</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25-ml-Stripetten</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Squeezer</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriler Filter mit 0,2-μm-Porengröße</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>2 × 500 ml pro EGM-2</td></tr></tbody></table>

isolation und großräumige ausdehnung der erwachsenen menschen endothelial colony forming progenitorzellen

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Dieser Beitrag stellt eine neuartige Recovery-Strategie für die endotheliale koloniebildenden Progenitorzellen (ECFCs) aus heparinisiertem aber ansonsten unmanipulierten erwachsenen menschlichen peripheren Blut innerhalb einer im Mittel 12 Tage. Nach großräumige Ausdehnung&gt; 1x10 8 ECFCs können für weitere Tests gewonnen werden. Vorteilhaft mit PHPL den Kontakt von menschlichen Zellen mit Rinderserum Antigene ausgeschlossen werden kann. Mittels Durchflusszytometrie und Immunhistochemie die isolierten Zellen können als ECFC und ihre in vitro-Funktionalität zu vaskulären Strukturen bilden können in einer Matrigel-Assay getestet werden charakterisiert werden. Weitere können diese Zellen subkutan in einem Mausmodell injiziert werden, um funktionelle, perfundierten Gefäßen in vivo zu bilden. Nach langfristige Expansion und Kryokonservierung Proliferation, erscheinen Funktion und genomische Stabilität zu erhalten. 3,4 Dieses Tier-Protein-freie Isolierung und Expansion Methode ist leicht anwendbar, um eine große Menge an ECFCs generieren.

Endothelial koloniebildenden Progenitorzellen (ECFCs) sind ein viel versprechendes Instrument, um vaskuläre Homöostase und Reparatur zu studieren.<sup&gt; 1,2</sup&gt; Dieser Beitrag stellt eine neuartige Tier-serumfreien Verfahren zur Isolierung und Expansion von ECFC aus heparinisiertem erwachsenen menschlichen peripheren Blut mit gepoolten menschlichen Thrombozyten-Lysat (PHPL) vermindert das Risiko von Anti-Rinder-Impfung.

Isolation und großräumige Ausdehnung der erwachsenen Menschen Endothelial Colony Forming Progenitorzellen

Diese Arbeit stellt eine neuartige Strategie zur Gewinnung von endothelialen koloniebildenden Vorläuferzellen (ECFCs) aus heparinisierten, ansonsten jedoch unbehandelten adulten ...

Durch die Kultivierung des gesamten Blutes in einem optimierten, tierserumfreien Medium. In einer 75 cm²-Flasche heften sich die E-CFCs an der Flaschenoberfläche an, wodurch der Großteil der roten und weißen Blutkörperchen entfernt wird. Spülen Sie die Flasche am ersten Tag und entfernen Sie die verbleibenden Zellen durch Mediumwechsel am fünften Tag.Überprüfen Sie im Abstand von zwei Tagen oder, falls praktisch, dreimal pro Woche auf Kolonien. Die ersten Kolonien sollten etwa am Tag 12 sichtbar sein. Hallo, mein Name ist Nicole Hoffman aus dem Labor der Stammzellforschungseinheit der Medizinischen Universität grots.Heute zeigen wir Ihnen ein vereinfachtes Verfahren zur Isolierung und Expansion von endothelialen koloniebildenden Vorläuferzellen oder ECFC aus peripherem Blut von Erwachsenen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Funktion und Biologie von ECFC in vitro und in vivo zu untersuchen. Beginnen wir also.Dieser Abschnitt beginnt mit der Herstellung und Filtrationsterilisation des endothelialen Wachstumsmediums zwei, das zum Kultivieren verwendet wird. Die EFCs temperieren 20 Milliliter Medium in einem 37-Grad-Wasserbad vor. Entnehmen Sie fünf Milliliter erwachsenes menschliches peripheres Blut aus der Vena cubitalis in ein sechs Milliliter fassendes, konservierungsmittelfreies Natriumheparin-Blutvakutainer-Röhrchen.Blutproben müssen innerhalb von zwei Stunden nach der Entnahme in einer laminaren Luftstrahlhaube verarbeitet werden. Stellen Sie einen 75 cm²-Flask mit durchlüftbarem Verschluss, eine 25-mL-Pipette und zwei 5-mL-Pipetten in eine laminare Luftstrahlbank. Füllen Sie den Kolben mit einer 25-mL-Pipette vorab mit 15 mL vorgewärmtem, supplementiertem E GM zwei. Öffnen Sie die Blutprobe und verwenden Sie die 5-mL-Pipette, um alle fünf Milliliter Blut direkt in den Kolben zu überführen. Spülen Sie das leere Blutgefäß mit den verbleibenden fünf Millilitern vorgewärmtem GM zwei unter Verwendung der Pipette aus. Geben Sie dieses Volumen zum Kolben hinzu.Schließen Sie die belüftete Kappe des Kolbens, der nun 25 Milliliter enthalten sollte. Stellen Sie den Kolben für 24 Stunden in einen Inkubator, der auf 37 Grad, 5 % Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit eingestellt ist. Am nächsten Tag erwärmen Sie 20 Milliliter ergänztes eGM zwei und 30 Milliliter PBS in einem Wasserbad auf 37 Grad und bereiten Sie zwei 25-Milliliter-Pipetten sowie drei 10-Milliliter-Pipetten in einer laminarer Luftstrom-Werkbank vor.Entfernen Sie den Kolben mit der Probe aus dem Inkubator und verwenden Sie eine 25-Milliliter-Pipette, um die mittlere Blutmischung, die nicht-angewachsene Zellen enthält, abzusaugen. Achten Sie darauf, die Kolbenoberfläche mit der Pipette nicht zu verkratzen. Um das Abkratzen angewachsener Zellen zu vermeiden, geben Sie vorsichtig 10 Milliliter vorgewärmtes PBS auf die innere, zellenbesiedelte Kolbenoberfläche und kippen Sie den Kolben von Seite zu Seite.Entfernen und verwerfen Sie sofort das PBS. Wiederholen Sie dies, spülen Sie zweimal. Als Nächstes arbeiten Sie schnell und vorsichtig.Um ein Ablösen der Zellen zu vermeiden, 20 Milliliter frisches, vorgewärmtes EGM-2 dem Kolben hinzufügen und diesen zurück in den Inkubator stellen. Unter der Vorsicht, den Kolben nicht länger als fünf Minuten außerhalb des Inkubators zu belassen, alle zwei Tage mit einem Lichtmikroskop bei niedriger Vergrößerung das Auswachsen von ECFCs im Kolben überprüfen. Ab dem zweiten Tag bis zum fünften Tag nach der Aussaat jeweils 20 Milliliter EGM-2 in einem 37-Grad-Wasserbad vorwärmen und zwei 25-Milliliter-Pipetten bereitstellen.Schnell arbeiten, um Austrocknung zu verhindern. Ersetzen Sie mit diesen Hilfsmitteln das Medium durch frisches, vorgewärmtes, supplementiertes e GM zwei, um nicht-angewachsene Zellen zu entfernen. Stellen Sie den Kolben zurück in den Inkubator und wiederholen Sie den Screening-Prozess täglich.Ersetzen Sie 30 % des Mediums durch frisch supplementiertes EGM, und zwar zweimal pro Woche. Typische Kolonien mit kieselsteinartiger Morphologie sollten etwa am Tag 12 erscheinen.Markieren Sie die obere äußere Seite des Kolbens, um die Position jeder Kolonie anzugeben. Lassen Sie die Kolonien bis zum Tag 28 wachsen, es sei denn, einzelne Zellen beginnen sich zu lösen. Sobald die primären Kolonien identifiziert wurden, können sie zwischen den Tagen 14 und 28 je nach ihrer Größe geerntet werden.Erwärmen Sie fünf Milliliter einer Trypsin-EDTA-Lösung und 20 Milliliter PBS auf 37 Grad. Achten Sie darauf, die Flaschenoberfläche nicht zu berühren, und überführen Sie das gesamte Medium in ein Falcon-Gefäß. Dieses wird später verwendet, um die Trypsinaktivität zu stoppen, und die Zellen vorsichtig mit 10 Milliliter vorgewärmtem PBS zu waschen.Geben Sie fünf Milliliter Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie die Lösung etwa fünf Minuten bei 37 Grad oder bis sich die Zellen gelöst haben. Achten Sie darauf, die Inkubation nicht länger als sieben Minuten durchzuführen, da Trypsin nach der Inkubation für die Zellen toxisch werden kann. Klopfen Sie vorsichtig auf die Seiten des Kolbens, um die Zellablösung nach der Reaktion zu unterstützen. Stoppen Sie die Trypsin-Protease-Aktivität durch Zugabe von etwa 10 Milliliter des aufbewahrten, verwendeten Kulturmediums.Überführen Sie die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Spülen Sie den Kolben einmal mit 10 Milliliter PBS und geben Sie die Spüllösung zur geernteten Zellsuspension hinzu. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension sieben Minuten lang bei 300 × g in einer gekühlten Zentrifuge, um die Zellen zu pelletieren und die Trypsinlösung zu entfernen. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet sofort in einem Milliliter PBS.Halten Sie die resuspendierten Zellen auf Eis. Bestimmen Sie die Zellanzahl wie in einem anderen JoVE-Protokoll von Ricardo und Phelan beschrieben. Fahren Sie anschließend mit der ECFC-Expansion fort.Falls mehr als 360.000 E-CFCs gewonnen werden, fahren Sie mit dem Expansionsschritt fort; falls weniger als 260.000 e-CFCs gewonnen werden, erwägen Sie eine weitere Zellvermehrung vor der großtechnischen Expansion. Dazu säen Sie etwa 75.000 EFCs in 20 Milliliter E-GM zwei in einer 75 Quadratzentimeter großen Zellkulturschale aus und kultivieren sie eine weitere Woche lang oder bis zur Konfluenz. Ergänzen Sie 500 Milliliter E GM zwei, wie im beigefügten schriftlichen Protokoll beschrieben, und erwärmen Sie dieses Gemisch in einem 37-Grad-Wasserbad vor. Bereiten Sie für jeweils etwa 2.500 Quadratzentimeter Kulturfläche eine viergeschichtige Cell Factory oder CA vier vor. Sammeln Sie außerdem zwei frische Tyvek-Kappen und einen speziellen sterilen Trichter und lagern Sie diese in der laminar flow-Werkbank, um E CFCs mit einer anfänglichen Zelldichte von 100 Zellen pro Quadratzentimeter zu säen.Zunächst berechnen Sie die Zellzahl für jede CF vier 250.2, 800. Die Zellen werden in 500 Milliliter frischem E GM zwei resuspendiert und in die CF vier gegeben. Unter Verwendung eines sterilen Trichters verschließen Sie mit der abgedeckten Tyvek-Kappe ein Ventil und kippen die CF vier auf eine Längsseite, um eine gleichmäßige Verteilung des Mediums zwischen allen vier Ebenen zu ermöglichen.Jetzt kann die Kammer zurückgekippt und der Deckel der Tyvek-Kappe geöffnet werden. Achten Sie darauf, die offenen Lüftungsöffnungen mit zwei roten Kappen zu schützen. Diese Kappen können zusammen mit dem CF Four auf dem Weg zum Inkubator erworben werden.Stellen Sie die CF vier in den Inkubator und entfernen Sie die roten Kappen, um den Gasaustausch zu ermöglichen. Wechseln Sie mindestens einmal wöchentlich 20 % des Mediums durch vorgewärmtes Medium, bis die CF vier konfluent ist. Dieser Prozess ist spenderspezifisch und tritt wahrscheinlich nach 10 bis 14 Tagen ein. Abschließend können die Zellen wie zuvor beschrieben mithilfe von vorgewärmtem Trypsin-EDTA geerntet und die Proteaseaktivität mit dem verwendeten Medium gestoppt werden.Verwenden Sie außerdem etwa 200 Milliliter PVS zur Wäsche um Tag 12 herum. ECFC-Kolonien werden beginnen, mit einer typischen Pflasterstein-Morphologie zu erscheinen, wie Sie in dieser Kolonie sehen können, oder als einige gruppierte Zellen wie in dieser Kolonie, die am Tag 12 gefunden wurde. Während die Kolonien wachsen, bilden immer mehr Zellen die typische Pflasterstein-Morphologie.Wie Sie hier sehen können, lassen sich die isolierten eCFCs nach 15 und nach 18 Tagen mittels Immunchemie mit typischen endothelialen Oberflächenmarkern wie CD146, CD144, CD31 und von Willebrand-Faktor charakterisieren. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man endotheliale koloniebildende Vorläuferzellen aus peripherem Blut von Erwachsenen isoliert und vermehrt, während Sie dieses Verfahren durchführen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Erfolgsrate dieses Protokolls donorabhängig ist und zwischen 50 und 70 % liegt. Das war's.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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