Visualizing Einzel-Molekül-DNA-Replikation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Bei dieser Technik werden Glasdeckgläser mit einer Mischung aus inerten und Biotin-Peg-Molekülen funktionalisiert. Mit dieser funktionalisierten Oberfläche wird eine Durchflusszelle erstellt und auf ein Rasenmikroskop gelegt. Biotinylierte Rolling-Circle-Templates werden mit multivalentem Streptavidin an der Oberfläche befestigt.

Wenn die Substrate durch Zugabe von Repli-Zonenproteinen und Nukleotiden repliziert werden, wird die resultierende doppelsträngige DNA mit laminarer Strömung verlängert und in Echtzeit mit einem Interkollationsfarbstoff abgebildet. Hallo, ich bin Nathan Tanner aus dem Labor von Antoine Van Ian in der Abteilung für Biologische Chemie und Molekulare Pharmakologie an der Harvard Medical School. Ich bin Joe Laro, auch aus dem Van Noian-Labor.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Fluoreszenzbildgebung der DNA-Replikation in Echtzeit auf Einzelmolekülebene. Dieses Verfahren nutzen wir in unserem Labor, um koordinierte DNA-Syntheseaktivitäten einzelner Replikationskomplexe zu untersuchen. Also lasst uns loslegen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, verbinden Sie das biotinylierte Schwanz-Oligo mit der einzelsträngigen M 13-DNA, indem Sie einen zehnfachen Überschuss an Oligo in TBS-Puffer hinzufügen, Erhitzen auf 65 Grad Celsius und dann den Heizblock ausschalten, um eine langsame Abkühlung zu ermöglichen, um den Primer richtig zu aneelen. Jetzt, da die Primzahl M 13 fertig ist, fügen Sie es zu einer Mischung aus 64 nanomolaren T-sieben-DNA-Polymerase und T-sieben-Replikationspuffer hinzu, die D-NDPs und Magnesiumchlorid enthält, und inkubieren Sie die Reaktion 12 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation mit 100 millimolar EDTA abschrecken.

Als nächstes reinigen Sie die eingefüllte Produkt-DNA mit Phenol, Isoamylalkohol, Chloroform, extrahieren und dialysieren Sie in TE-Puffer oder einen anderen geeigneten Lagerpuffer, extrahieren Sie jede organische Phase zurück, um alle Reste der Grundierung zurückzugewinnen. M 13 nach der Dialyse bestimmen Sie die DNA-Konzentration mit dem UV-Vis-Spektralphotometer. Eine Iteration der Matrizenvorbereitung kann eine ausreichende nanomolare Konzentration der Schablone für Hunderte bis Tausende von Einzelmolekülexperimenten erzeugen.

Jetzt, da die DNA fertig ist, fahren Sie mit der Vorbereitung der funktionalisierten Deckgläser fort. Die zu replizierende DNA wird an Glasdeckgläser gebunden, die mit Amil Lane funktionalisiert sind, die Oxy-Gruppe des Amil bindet an das Glas, so dass ein Amin für die Bindung biotinylierter Peg-Moleküle zur Verfügung steht. Diese Beschichtung trägt dazu bei, unspezifische Bindungen an die Oberfläche zu reduzieren.

Um die Glasabdeckgläser gründlich zu reinigen, legen Sie sie in Färbegläser und füllen Sie die Gläser mit Ethanol-Ultraschall. Spülen Sie die Gläser 30 Minuten lang aus und füllen Sie sie 30 Minuten lang mit einem molaren Kaliumhydroxid Sonicate und wiederholen Sie beide Wäschen. Für die erste Funktionalisierungsreaktion müssen alle Spuren von Wasser entfernt werden.

Füllen Sie die Färbegläser mit Aceton und beschallen Sie es 10 Minuten lang. Leere die Gläser und fülle sie erneut mit Aceton. Fahren Sie fort, das Sinusreagenz in die Gläser zu geben und zwei Minuten lang zu rühren.

Dann mit einem großen Überschuss an Wasser abschrecken. Dann trocknest du die Deckgläser, indem du sie bei 110 Grad Celsius im Ofen für 30 Minuten backst. Als nächstes bereiten Sie die PEG-Mischung mit etwa 0,2 % Gewicht pro Volumen vor, indem Sie einen Abdeckschirm aus Glas verwenden, der die Trennung der Deckgläser ermöglicht, und pipettieren Sie 100 Mikroliter auf ein trockenes, siloisiertes Deckglas.

Legen Sie einen zweiten Decklaschen darauf. Inkubieren Sie die Deckgläser drei Stunden lang in der PEG-Lösung. Trennen Sie dann jedes Paar Deckgläser und waschen Sie es ausgiebig mit Wasser.

Achten Sie darauf, die Deckgläser mit der funktionalisierten Seite nach oben zu halten, da nur eine Seite mit Stift beschichtet wird. Zum Schluss trocknen Sie die Deckgläser mit Druckluft und lagern sie unter Vakuum in einem Trockenmittel, die Oberflächen bleiben mindestens einen Monat lang stabil. So können Dutzende von Deckgläsern in einer Charge hergestellt und bei Bedarf verwendet werden.

Nachdem nun die Deckgläser fertig sind, kann man die Strömungskammer für das Einzelmolekülexperiment zusammenbauen. Beginnen Sie damit, 20 bis 25 Milliliter Blockierungspuffer, der BSA enthält, in ein Trockenmittel zu geben, um alle Luftblasen für spätere Schritte zu entfernen. Als nächstes verdünnen Sie 25 Mikroliter Streptavidin in 100 Mikrolitern PBS und verteilen Sie die Lösung auf der Oberfläche eines PEG-funktionalisierten Deckglases inkubieren Sie es 20 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit das Streptavidin an Oberflächenbiotin binden kann, während andere Teile der Kammer vorbereitet werden.

Schneiden Sie während der Inkubation des Deckglases ein Stück doppelseitiges Klebeband mit beidseitiger Rückseite so ab, dass es der Größe des Quarzobjektträgers entspricht, der zum Zusammenbau der Durchflusskammer verwendet wird. Markieren Sie mit einem Bleistift die Position der Schlauchlöcher auf dem Band, so dass ein Umriss der Strömungskammer auf dem Band gezeichnet werden kann. Machen Sie nach dem Markieren der Löcher ein zwei Millimeter breites Rechteck um die Markierungen.

Dieses Rechteck dient als Strömungskanal, also achten Sie darauf, gerade Seiten zu bilden und Platz um den Schlaucheinlass und -auslass zu lassen. Schneiden Sie nun das markierte Klebeband entlang der gezeichneten Kontur ab und machen Sie gerade, saubere Schnitte, um sicherzustellen, dass kein Klebstoff in den Kanal hineinragt. Reinigen Sie den Quarzobjektträger gründlich mit Aceton, um den Klebstoff von der Durchflusszellenkonstruktion zu entfernen, die in früheren Experimenten verwendet wurde.

Finden Sie die beste Ausrichtung des Kanalumrisses. Entfernen Sie eine Seite der Klebefolie und legen Sie das Klebeband vorsichtig auf die Rutsche. Achten Sie darauf, das Klebeband richtig auszurichten, da die Einlass- und Auslasslöcher frei bleiben müssen.

Bereiten Sie als Nächstes die Schlauchabschnitte von 0,76 Millimetern für den Ein- und Auslass der Durchflusszelle vor. Es hilft, das Ende des Rohres in einem Winkel von etwa 30 Grad zu schneiden, damit das Rohr nicht flach gegen den Kammerboden drückt. Hängen Sie den Schlauch an Reagenzglasgestelle auf, um ihn in den nächsten Schritten einfach an der Durchflusszelle zu befestigen.

Inzwischen ist die Inkubation des Deckglases abgeschlossen. Spülen Sie den Strep Avid ENC-beschichteten Abdeckbezug gründlich mit Wasser ab und trocknen Sie ihn mit Druckluft. Achten Sie darauf, den Eindeckbezug nicht umzudrehen, da nur eine Seite funktionalisiert ist.

Schließen Sie abschließend die Montage der Durchflusskammer ab, indem Sie die andere Seite der Bandunterlage entfernen und den Quarzschieber auf den Deckglas legen. Drücken Sie leicht auf den Deckglas, um die im Klebstoff eingeschlossene Luft herauszudrücken. So verhindern Sie, dass Luftblasen in den Strömungskanal gelangen.

Versiegeln Sie die Seiten der Kammer mit Epoxidharz. Führen Sie den abgeschnittenen Schlauch in die Löcher des Quarzes ein und verschließen Sie ihn mit Epoxidharz und lassen Sie ihn einige Minuten trocknen. Wenn die Epoxidversiegelung trocken ist, beginnen Sie mit dem Blockieren der Oberfläche.

Mit einer 21-Gauge-Nadel. Ziehen Sie einen Teil des Degas-Blockierpuffers durch eines der Rohre. Spülen Sie einige Male aus, um Luftblasen zu entfernen, und lassen Sie die Kammer mindestens eine halbe Stunde lang inkubieren, bevor Sie mit der Einzelmolekülreplikation fortfahren. Experiment.

Nachdem die Durchflusszelle verstopft ist, stellen Sie sie auf den Mikroskoptisch. Halten Sie die Kammer mit Tischklammern fest und stellen Sie sicher, dass der Strömungskanal entlang der y-Achse ausgerichtet ist. Verbinden Sie den Auslassschlauch der Durchflusszelle mit einem Verbindungsschlauch mit größerem Durchmesser mit der Spritzenpumpe.

Setzen Sie den Einlass in den Sperrpuffer ein und ziehen Sie die Spritze zurück, um jegliche Luft aus dem Schlauch zu entfernen. Ein sanftes Betätigen des Auslassrohrs hilft, alle in der Durchflusszelle eingeschlossenen Luftblasen zu entfernen. Fügen Sie nun die DNA hinzu und verdünnen Sie das Stamm-DNA-Template auf 25 Pikomolare in einem Milliliter Blockierungspuffer in die Kammer bei einer moderaten Flussrate wie 0,025 Millilitern pro Minute für 30 Minuten, um eine gute Oberflächenabdeckung der DNA zu ermöglichen.

Sobald sich die DNA in der Kammer befindet, waschen Sie überschüssige DNA mit Blockpuffer für mindestens 200 Flusszellenvolumina aus. Um die gesamte freie DNA loszuwerden, schalten Sie den Laser und die Kamera ein. Der gekühlte CCD muss auf Temperatur kommen, bevor er verwendet werden kann.

Nach dem Abwaschen der überschüssigen DNA und der Entgasung des Replikationspuffers wird die Nukleotide DTT und Cytoxin des Replikationspuffers für den Replikationsreaktionsmix vorbereitet. Dann Proteine hinzufügen und vorsichtig mischen. Anschließend fließt das Reaktionsgemisch in die Durchflusszelle.

Die Strömungsgeschwindigkeit muss hier ausreichend sein, um doppelsträngige DNA für einen zwei Millimeter breiten 100 Mikrometer hohen Strömungskanal mit 0,04 Millilitern pro Minute zu dehnen. Lassen Sie die Mischung etwa 10 Minuten in die Kammer eindringen.

Verschieben Sie das Sichtfeld an die Seite des Kanals und fokussieren Sie auf das Klebematerial, um sicherzustellen, dass sich eines in der Nähe der Oberfläche befindet, um zu fokussieren und mit der Bildgebung zu beginnen. Passen Sie die Laserleistung, den Fokus des Mikroskops und den Rasenwinkel an. Halten Sie die Leistung niedrig, um eine Photospaltung der gefärbten DNA zu vermeiden.

Erfassen Sie je nach DNA-Replikationsrate mehrere Minuten lang ein bis fünf Bilder pro Sekunde. Wiederholen Sie dies, um längere Replikationsbahnen zu erhalten, oder wechseln Sie zu einem neuen Feld, um mehr Moleküle zu sehen, wenn fast das gesamte Reaktionsgemisch in mehr Puffer in den Zellfluss gepumpt wurde, mit cyt, um andere Sichtfelder zu sehen. Die Aufnahme mehrerer Bilder verschiedener replizierter Moleküle liefert Statistiken zur Bestimmung der Produktivität.

Im rollenden Kreis. Die führende Synthese des Replikationsassays dehnt den Schwanz aus, der den Kreis und die Oberfläche verbindet, der Schwanz wird durch die nachlaufende Strangpolymerase in doppelsträngige DNA umgewandelt und durch laminare Strömung gedehnt. Hier ist ein Beispiel für ein Gesichtsfeld mit Cyt Orange bei 532 Nanometer Anregung.

Bei den kleinen Fluoreszenzspots handelt es sich um angebundene, nicht replizierte Substrate. Beachten Sie die extreme Länge der Produkte und die große Anzahl von Produkten pro Feld. Ein typisches Sichtfeld zeigt zahlreiche replizierende Moleküle, die als wachsende helle Linien von gefärbten DNAE Coli sichtbar sind. Experimente bei 37 Grad Celsius ergeben je nach Oberflächendichte fünf bis 50 Moleküle pro Feld.

Die T Seven Repla-Zone initiiert viel effizienter und repliziert mehr als 50 % der Moleküle in einem Feld. Bei einer so hohen Dichte ist es schwierig, einzelne Moleküle aufzulösen, wie hier zu sehen. Führen Sie also das T-7-Experiment bei niedrigeren Proteinkonzentrationen oder Oberflächendichten durch. Chime-Diagramme typischer replizierender Moleküle aus E-coli und T-7-Experimenten enthalten Endpunkt-Trajektorien von Molekülen aus E-coli und T-7, die über die Zeit aufgetragen werden. Die Trajektorien sind mit linearer Regression ausgestattet, um Replikationsraten zu erhalten, die in diesem Beispiel 467,1 Basenpaare pro Sekunde für E-coli und 99,4 Basenpaare pro Sekunde betragen.

Für T 7 ergeben die Ratenverteilungen der einzelnen Molekültrajektorien, die mit den einzelnen Gaußen übereinstimmen, einen Mittelwert von 535,5 plus oder minus 39 Basenpaaren pro Sekunde für e coli und 75,9 plus oder minus 4,8 Basenpaare pro Sekunde. Für T 7 sind die Längenverteilungen der Replikationsprodukte fit für einen einfachen exponentiellen Zerfall, um die Produktivität zu erhalten, die 85,3 plus oder minus 6,1 Kilobasenpaare für e coli und 25,3 plus oder minus 1,7 Kilobasenpaare für G sieben beträgt. Dann haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die koordinierte DNA-Replikation mit einzelnen Molekülen messen können.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Deckgläser richtig zu funktionalisieren und saubere gerade Strömungskanäle zu schaffen. Achten Sie darauf, die Laserleistung zu erhalten und die Photospaltung der langen DNA zu minimieren. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.