Name: Visualizing Einzel-Molekül-DNA-Replikation mit Fluoreszenz-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-09T16:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 57 s
Description: Erfahren Sie Einzel-Molekül-Fluoreszenz-Mikroskopie zur Visualisierung der DNA-Replikation durch individuelle Replisome in Echtzeit. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung koordinierter DNA-Synthese-Aktivitäten.

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Samir Hamdan unterstützt bei der Entwicklung dieser Technik. E. coli-Proteine ​​sind aus dem Labor von Prof. Nick Dixon, sind University of Wollongong und T7 Proteine ​​aus Prof. Charles Richardson, Harvard Medical School. Die Arbeit wird durch die National Institutes of Health (GM077248 zu AMvO) und die Jane Coffin Childs Foundation (JJL) unterstützt.

Vor der Durchführung einer Einzel-Molekül-Replikation Experiment, müssen ein paar Materialien im Voraus vorbereitet werden. 1. DNA Replication Vorlage Das Substrat für die Replikation Reaktion ist ein biotinylierter, tailed M13 Rolling-Circle unter Verwendung von Standardverfahren molekularbiologischen Techniken 1,2. Werkstoffe: M13mp18 Einzelstrang-DNA, Biotinylated Schwanz Oligonukleotid-Primer (5&#39;-Biotin-T 36 AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT-3 &#39;), T7-DNA-Polymerase, Heat Block, Phenol / Isoamylalkohol / Chloroform <ol><li> Glühen des biotinylierten Oligo Schwanz der M13 durch Zugabe einer 10-fachen Überschuss von Oligo in TBS-Puffer (330 nM Schwanz Oligo, 33 nM M13). </li><li> Erhitzen Sie die Mischung auf 65 ° C in der Hitze zu blockieren. Einmal erhitzt, schalten Sie die Hitze blockieren und ermöglichen ein langsames Abkühlen auf richtig glühen die Grundierung. </li><li> Fügen Sie die grundierte M13 zu einer Mischung von 64 nM T7 DNA-Polymerase und T7-Replikation Puffer mit dNTPs und MgCl 2. </li><li> Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 ° C für 12 Minuten und löschen mit 100 mM EDTA. </li><li> Purify das ausgefüllte Produkt DNA mit Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol-Extraktion und Dialyse in TE-Puffer oder einem anderen geeigneten Pufferspeicher und bestimmen DNA-Konzentration (Back-Extrakt jedes organische Phase, um restliche grundiert M13 wiederherzustellen). </li><li> Eine Iteration der Vorlage Vorbereitung kann leicht mehrere Milliliter nanomolaren Konzentrationsbereich Vorlage, genug für Hunderte bis Tausende von Einzel-Molekül-Experimente. </li></ol> 2. Funktionalisierte Deckgläser Zur Befestigung der DNA, die Deckglas wird das Glas zunächst mit einem Aminosilan, die dann an biotinylierte PEG-Moleküle gekoppelt ist funktionalisiert. Diese Beschichtung hilft, die unspezifische Wechselwirkungen der DNA-Replikation und Proteine ​​mit der Oberfläche 1,3 zu reduzieren. Materialien: Glas-Deckgläschen, Küvetten, 3-Aminopropyltriethoxysilan, Methoxy-PEG5k-NHS-Ester, Biotin-PEG5k-NHSester, Aceton, 1M KOH, Ethanol, Backofen, Ultraschallbad <ol><li> Reinigen Sie die Deckgläschen, indem man sie in Küvetten und Befüllen der Gläser mit Ethanol. Ultraschallbad für 30 Minuten und spülen Sie die Gläser füllen und mit 1 M KOH. Ultraschallbad für 30 Minuten sowohl wäscht wiederholen. </li><li> Zum ersten Funktionalisierung Reaktion, müssen alle Spuren von Wasser entfernt werden. Füllt die Krüge mit Aceton und beschallen für 10 min. Spülen Sie die Gläser nochmals mit Aceton. </li><li> Bereiten Sie eine 2% v / v Lösung des Silans Reagenz in Aceton. Hinzufügen, um die Küvetten und agitieren für 2 Minuten. Diese Reaktion koppelt die Alkoxygruppe des Aminosilan auf das Glas, so dass eine reaktive Amin für die nächsten Kupplungsschritt. Die Reaktion wird mit einem großen Überschuss an Wasser. </li><li> Trocknen Sie die Deckgläschen durch Backen sie bei 110 ° C in den Ofen für 30 Minuten. </li><li> Bereiten Sie eine 50:1 methoxy: Biotin PEG-Gemisch in 100 mM NaHCO 3 pH 8,2. Ziel für rund 0,2% w / v biotinylierten PEG. </li><li> Je 100 ul der PEG-Gemisch auf ein trockenes silanisiert Deckglas und legen Sie eine weitere Deckglas an der Spitze. Inklusive einem Deckglas spacer erlauben Trennung der Deckgläser. </li><li> Inkubieren Sie die Deckgläser in der PEG-Lösung für 3 Stunden, dann trennen Sie jedes Paar von Deckgläsern und waschen gründlich mit Wasser. Seien Sie vorsichtig, damit die Deckgläser funktionalisierten Seitenketten als nur einmal an Seite mit PEG beschichtet werden. </li><li> Trocknen Sie die Deckgläser und speichern unter Vakuum. Die Oberflächen bleiben für mindestens einen Monat stabil, so Dutzende von Deckgläsern können in einer Batch gemacht werden und nach Bedarf verwendet. </li></ol> Diese Materialien sollten vor der Zeit gemacht werden, und dann für jedes Experiment verwendet. Zu Beginn jedes Einzel-Molekül-Experiment, von der Montage der Flusskammer beginnen. 3. Flusskammer Vorbereitung Das Experiment wird mit Hilfe einer einfachen Flusskammer mit einem funktionalisierten Deckglas, doppelseitiges Klebeband, ein Quarz-Objektträger und Schläuche hergestellt. Eine Flusskammer wird für jede Einzel-Molekül-Experiment 1,4 zubereitet. Material: Doppelseitiges Klebeband, Rasierklinge, Quartz slide mit Bohrungen für Schläuche, Quick-dry Epoxy, funktionalisierten Deckglas (siehe oben), Streptavidin-Lösung (25 ul 1 mg / mL in PBS), Tubing, Blocking-Puffer (20 mM Tris pH 7,5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,2 mg / ml BSA, 0,005% Tween-20) <ol><li> Beginnen Sie, indem 20-25 ml Blocking-Puffer in einem Exsikkator, um mögliche Luftblasen für spätere Schritte zu entfernen. </li><li> Werfen Sie einen PEG-funktionalisierten Deckglas und breitete 125 von PBS-verdünnten Streptavidin-Lösung über die Oberfläche. Lassen Sie diese für 20 Minuten inkubieren während der Vorbereitung in anderen Teilen der Kammer, so dass Streptavidin an die Oberfläche Biotine binden. </li><li> Schneiden Sie ein Stück zweiseitigd-Band zu passen die Größe des Quarz-Objektträger. Markieren Sie die Position des Schlauches Löcher auf dem Band mit einem Bleistift, so dass ein Überblick über die Flusskammer auf dem Band (1 mg / mL) gezogen werden können. </li><li> Machen Sie einen 2 mm breiten Rechteck um die Löcher. Dies wird als der Strömungskanal dienen, so achten Sie darauf, geraden Seiten zu machen und lassen Raum um das Rohr Einlass und Auslass. Falls gewünscht, können mehrere Kanäle oder verschiedene Größen verwendet werden. </li><li> Schneiden Sie entlang der gezeichneten Kontur, so dass gerade, saubere Schnitte zu machen, dass kein Klebstoff ragt in den Kanal. </li><li> Reinigen Sie den Quarz gründlich mit Aceton oder Ethanol, um Klebstoff von der vorherigen Durchflusszelle Bau zu entfernen. </li><li> Finden Sie die beste Ausrichtung des Kanals skizzieren, entfernen Sie die eine Seite der Rückseite und setzt vorsichtig das Band auf den Quarz-Objektträger. Seien Sie vorsichtig, um das Band richtig auszurichten, da die Ein-und Auslass Löcher zu bleiben entsperrt brauchen. </li><li> Cut Rohrlängen für die Einlass-und Auslass der Durchflusszelle. Es hilft, die Ende der Röhre bei etwa einem 30 ° Winkel geschnitten, so dass das Rohr nicht drücken wird gegen die Kammer unten flach. Legen Sie die Rohre auf irgendeine Art von Unterstützung sie für die einfache Befestigung an der Messzelle in die nächsten Schritte zu suspendieren. </li><li> Spülen Sie die Streptavidin-beschichteten Deckglas gründlich mit Wasser ab und trocknen mit Druckluft. Denken Sie daran, dass nur eine Seite funktionalisiert wird, darauf achten, nicht das Deckglas umdrehen. Entfernen Sie die andere Seite der Band sichern und Ort der Quarz-Objektträger auf das Deckglas. </li><li> Leicht auf dem Deckglas drücken, um Push-out keine Luft in den Klebstoff der Falle. So vermeiden Sie Luftblasen immer in den Strömungskanal. </li><li> Verschließen Sie die Seiten der Kammer mit Epoxy. Legen Sie das ausgeschnittene Schlauch in die Löcher der Quarz und Dichtung in Stelle mit Epoxidharz. Dies muss für ein paar Minuten trocknen lassen. </li><li> Nach dem Trocknen beginnen Blockierung der Oberfläche, indem einige der entgasten Blockierungspuffer durch eine der Röhren. Ein 21-Gauge-Nadel passt perfekt in die 0,76 mm Schlauch. Flush ein paar Mal, um Luftblasen zu entfernen und damit die Kammer für mindestens eine halbe Stunde zu inkubieren. </li></ol> 4. Single-Molecule Replication Experiment Werkstoffe: Vorbereitet Flusskammer, SYTOX Orange, TIRF-Mikroskop, 532 nm Laser, CCD-Kamera, Computer mit der Bildaufnahme-Software, Rolling-circle DNA-Substrat, Replication Proteine <ol><li> Nach der Durchflusszelle blockiert wurde, ist alles bereit für die Einzel-Molekül-Experiment zu beginnen. </li><li> Nehmen Sie die Durchflusszelle und legen Sie es auf dem Mikroskoptisch. Halten Sie die Kammer in Platz mit Bühne Clips und sicher sein, dass der Strömungskanal geradeaus entlang der y-Achse positioniert ist. </li><li> Schließen Sie die Durchflusszelle Auslaufrohr der Spritzenpumpe mit einem größeren Durchmesser Anschluss Schlauch oder einer Nadel. Setzen Sie den Einlass in Blocking-Puffer und ziehen wieder auf die Spritze, um die Luft in den Schlauch zu entfernen. Eine sanfte Bewegung aus dem Auslaufrohr wird klar, keine Luftblasen in der Messzelle gefangen. </li><li> Von der Stammlösung DNA-Template zu 25 pM in 1 ml Blocking-Puffer. Durchfluss in die Kammer zu moderaten Durchfluss gute Flächendeckung von DNA ermöglichen. 0,025 ml / min für 30 Minuten gut funktioniert. Dies kann je nachdem, wie viele DNA-Moleküle auf der Oberfläche für jede Charge von Deckgläsern oder wie viele sind für das Experiment gewünscht variiert werden. </li><li> Sobald DNA ist in ausspülen, überflüssige DNA mit Blockierungspuffer. Wash für mindestens 200 Flow-Zelle Bände loswerden alle freien DNA. </li><li> Begin Entgasung der Replikation Puffer. Für die E. coli-Replikation Versuche, dies zu tun bei 37 ° C, um das Risiko von Blasen in der beheizten Flusskammer zu reduzieren. </li><li> Schalten Sie den Laser und Kamera. Die gekühlte CCD muss Temperatur zu erreichen, bevor es verwendet werden kann. </li><li> Wenn der Durchführung einer 37 ° C Experiment, schalten die Heizung auf. Seien Sie sicher, dass das Ziel ist in Kontakt mit der Durchflusszelle oder es wird ein Kühlkörper später. </li><li> Nach dem Waschen und der Entgasung kann die Reaktion hergestellt werden. Mix Nukleotide, DTT und SYTOX in die Replikation Puffer. Dann fügen Sie Proteine ​​und vorsichtig mischen. </li><li> Durchfluss des Reaktionsgemisches in die Messzelle. Diese Strömungsgeschwindigkeit muss ausreichend sein, um dsDNA strecken. Bei einem 2-mm breit, 100-um hohe Strömungskanal 0,04 ml / min gut funktioniert. </li><li> Nehmen Sie sich Zeit für das Gemisch in die Kammer eintreten und beginnen Bildgebung. Ein guter Tipp ist es, das Blickfeld auf die Seite des Kanals zu bewegen und sich auf den Klebstoff. Dadurch wird sichergestellt, Sie sind in der Nähe der Oberfläche zu fokussieren. </li><li> Passen Laserleistung, Mikroskop zu konzentrieren, und TIRF Winkel. Halten Sie die Leistung gering, um irgendeine Photospaltung der gefärbten DNA zu vermeiden. Erwerben Sie bei 1-5 Frames / Sekunde für einige Minuten in Abhängigkeit von der Rate der DNA-Replikation. Wenn gewünscht, wiederholen, um mehr Replikation Bahnen zu bekommen oder zu verschieben, um ein neues Feld mehr Moleküle sehen. </li><li> Nachdem das Reaktionsgemisch fast leer ist, ist es eine gute Idee, in mehr Puffer mit S flowYTOX um zu sehen, anderen Bereichen der Blick. Unter mehreren Bildern verschiedener repliziert Moleküle bietet Statistiken für Prozessivität Entschlossenheit. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Aktiv replizierenden Moleküle werden leicht als wachsenden Linien der gefärbten DNA gesehen. In unseren Experimenten, fließende 25 pM der M13 Substrat gibt 100-1000 Moleküle in einem 60x, 125 um x 125 um Sichtfeld (Abbildung 1). Performing Replikation Experimente mit dem E. coli replisome Proteine ​​bei 37 ° C (siehe Materialien für weitere Details) gibt 5-50 replizierenden Molekülen pro Gesichtsfeld. Bei vergleichbaren Konzentrationen der T7 replisome, die auf dem Substrat initiiert wesentlich effizienter, beobachten wir&gt; 70% der Moleküle in einem Feld zu replizieren. Diese Bedingungen ergeben ein Produkt Dichte so hoch, dass einzelne Moleküle schwer zu lösen und zu analysieren, so dass die T7 Experimente sind bei niedrigeren Proteinkonzentrationen durchgeführt. Datenanalyse: Um Tarifdaten, einfach Grundstück der Endpunkt der DNA gegen die Zeit und berechnen Sie die Steigung (Abbildung 2). Für Prozessivität, bestimmen die Gesamtlänge der DNA. Beide Zahlen werden sich an Basenpaare umgewandelt werden. Vor der Durchführung des Experiments, sollten Sie wissen, die Pixelgröße der Kamera an der richtigen Vergrößerung. Für Basenpaar Umwandlung ist eine gute Schätzung einfach konvertieren basierend auf den kristallographischen Länge der DNA, 2,9 bp / nm. Allerdings Laminar Flow wird nicht vollständig strecken die DNA, so dass ein DNA Längenkalibrierung, indem eine bekannte Länge DNA, zB 48.502 bp λ DNA, Befestigung an der Durchflusszelle mit einem biotinylierten Oligo und die Messung ihrer SYTOX gebeizt Länge an durchgeführt werden soll der Durchfluss für die Replikation Experiment verwendet. Ermittlung der Anzahl der Basenpaare / Pixel ermöglicht eine genaue Berechnung der Replikation Preise und processivities. Unter zahlreichen Bildern und Filmen liefert eine große Anzahl von Produkt-Molekül, so dass das Plotten von Geschwindigkeit und Prozessivität Distributionen (Abbildung 2) 1. <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: (aus Lit. 1). A) Cartoon des Rolling-Circle-Replikation Assay. (SA, Streptavidin). Leading-Strang-Synthese erweitert den Schwanz Verknüpfung des Kreises und der Oberfläche. Der Schwanz ist an dsDNA durch die nacheilenden Strang Polymerase umgewandelt und streckte von Laminar-Flow. b) Beispiel-Sichtfeld mit SYTOX Orange und 532 nm Anregung. Kleine fluoreszierende Flecken angebunden werden, nicht repliziert Substraten. Beachten Sie die extreme Länge der Produkte und die große Anzahl der Produkte pro Feld (jeder Messzelle enthält&gt; 5000 solcher Felder). <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2: (nach Lit. 1). A, b) Kymographs typischer replizierenden Molekülen aus T7 (a) und E. coli (b) Experimente. c) Endpoint Flugbahnen von Molekülen aus a) und b) aufgetragen gegen die Zeit. Trajektorien sind mit lineare Regression anzupassen, um die Replikation Preise zu erhalten. Gezeigten Beispiele sind 99,4 bp s -1 und 467,1 bp s -1. d) Länge Verteilungen der Replikation Produkte, mit Einzel-exponentiellen Anpassung an Prozessivität erhalten: 25,3 ± 1,7 kbp (T7), 85,3 ± 6,1 kbp (E. coli). e) Rate Verteilungen der einzelnen Moleküls Bahnen, mit Einzel-Gauß-Fit. Mittel: 75,9 ± 4,8 bp s -1 (T7), 535,5 ± 39 bp s -1 (E. coli).

<ol><li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-molecule+observation+of+rolling-circle+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time single-molecule observation of rolling-circle DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 37, e27(2009).</li>
<li>Tabor, S., Huber, H. E., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+thioredoxin+confers+processivity+on+the+DNA+polymerase+activity+of+the+gene+5+protein+of+bacteriophage+t7%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli thioredoxin confers processivity on the DNA polymerase activity of the gene 5 protein of bacteriophage t7.</a> J Biol Chem. 262, 16212-16223 (1987).</li>
<li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29+grafted+to+silicon+surfaces%3A+Grafting+density+and+protein+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide) grafted to silicon surfaces: Grafting density and protein adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li>
<li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanner%2C+NA+%22DNA+replication%3A+Methods+and+protocols%22">DNA replication: Methods and protocols</a>. Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. 521, Humana Press. New York. 397-410 (2009).</li>
<li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li>
<li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-562 (2006).</li>
</ol>

Eine kritische Kontrollpunkte prüft die Wirkung der Beize, SYTOX Orange, auf die Replikation Proteine ​​von Interesse. Ein einfacher Weg, dies zu tun ist, um die Replikation Experiment in der Messzelle, wie beschrieben, aber mit dem Wegfall der SYTOX durchzuführen. Nachdem die Reaktionsmischung durch die Kammer geflossen ist, fügen Puffer mit SYTOX auf DNA-Färbung und untersuchen die Länge Verteilung der replizierten Moleküle. Alternativ können Standard-Bulk-Reaktionen verwendet werden, um eine Wirkung von SYTOX auf die Replikation Geschwindigkeit und Effizienz zu überprüfen. Das hier beschriebene Experiment verwendet nur einen einzigen Strömungskanal. Dies kann leicht durch die Schaffung von Multi-Channel-Flow Kammern oder mit PDMS oder ähnliche mikrofluidischen Systemen geändert werden. Eine Erhöhung der Anzahl der Kanäle erleichtert Screening von Protein-Konzentrationen, Mutanten oder Inhibitor-Moleküle und erhöht die Geschwindigkeit der Replikation der Datenerhebung. Wie bereits erwähnt, führen wir die E. coli-Replikation Experimente bei 37 ° C mit Hilfe eines selbst gebauten Aluminium-flow-Heizgerät, ein Widerstandsheizelement (Heizpatrone) und variable Spannungsversorgung. Das gibt gute Temperaturstabilität und vermeidet den Kauf eines objektiven Heizung. Zur Kalibrierung der Heizung haben wir einfach ein Loch in der Mitte eines Quarz-Durchflusszelle oben gebohrt, eingefügt ein Thermoelement in den Strömungskanal und floss Puffer als normal. Die Messung der Durchflusszelle Puffer Temperatur bei zunehmender Spannungen ermöglicht eine präzise Heizung.

T7-Replikation: 40 mM Tris pH 7,5, 50 mM Kalium-Glutamat, 10 mM Magnesiumchlorid, 100 ug / mL BSA, mit 5 mM Dithiothreitol, 600 uM dNTPs, 300 nM ATP, 300 uM CTP und 15 nM SYTOX orange aufgenommen unmittelbar vor zu verwenden. Proteine ​​hinzugefügt: 5 nM gp4 (Hexamer), 40 nM-Polymerase (1:1 gp5: Thioredoxin), 360 nm gp2.5 1,5. E. coli-Replikation: 50 mM HEPES pH 7,9, 12 mM Magnesium-Acetat, 80 mM Kaliumchlorid, 100 ug / mL BSA mit 10 mM Dithiothreitol, 40 uM dNTPs, 200 nM rNTPs und 15 nM SYTOX orange aufgenommen unmittelbar vor dem Gebrauch. Proteine ​​hinzugefügt: 30 nM DnaB (Hexamer), 180 nM DNAC (Monomer), 30 nM αεθ, 15 nM τ 2 γ 1 δδ&#39;χψ oder τ 3 δδ&#39;χψ, 30 nM β (Dimer), 300 nM DNAG, 250 nM SSB (Tetramer), 20 nM Pria, 40 nM Prib, 320 nM Pric, 480 nM dnaT 1,6

visualizing einzel-molekül-dna-replikation mit fluoreszenz-mikroskopie

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Wir beschreiben eine einfache Fluoreszenzmikroskopie-basierte Echtzeit-Methode zur Beobachtung der DNA-Replikation in der Einzel-Molekül-Ebene. Eine kreisförmige, Gabel DNA Vorlage wird auf einer funktionalisierten Deckglas befestigt und umfassend nach Einführung der Replikation Proteinen und Nukleotiden (Abbildung 1) repliziert. Die wachsende Produkt doppelsträngige DNA (dsDNA) ist mit Laminar-Flow erweitert und visualisiert mit Hilfe eines interkalierende Farbstoff. Die Messung der Position des wachsenden DNA-Ende in Echtzeit ermöglicht eine präzise Bestimmung der Replikation Rate (Abbildung 2). Darüber hinaus gibt die Länge der abgeschlossenen DNA-Produkte auf dem Prozessivität der Replikation. Dieses Experiment kann sehr einfach und schnell durchgeführt werden und erfordert nur ein Fluoreszenzmikroskop mit einer relativ empfindlichen Kamera.

Dieses Protokoll zeigt eine einfache Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie-Technik zur Visualisierung der DNA-Replikation von einzelnen replisomes in Echtzeit.

Visualizing Einzel-Molekül-DNA-Replikation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Wir beschreiben eine einfache, auf Fluoreszenzmikroskopie basierende Echtzeitmethode zur Beobachtung der DNA-Replikation auf Einzelmolekülebene. Eine zirkuläre, gegabelte DNA ...

Bei dieser Technik werden Glasdeckgläser mit einer Mischung aus inerten und Biotin-PEG-Molekülen funktionalisiert. Mit dieser funktionalisierten Oberfläche wird eine Durchflusszelle hergestellt und auf ein TIRF-Mikroskop platziert. Biotinylierte Rolling-Circle-Vorlagen werden mithilfe multivalenter Streptavidin an der Oberfläche fixiert.Wenn die Substrate durch Zugabe von Replikationszonen-Proteinen und Nukleotiden repliziert werden, wird die entstehende doppelsträngige DNA durch laminare Strömung verlängert und in Echtzeit mithilfe eines interkalierenden Farbstoffs abgebildet. Hallo, ich bin Nathan Tanner aus dem Labor von Antoine Van Ians am Department für Biochemie und Molekularpharmakologie der Harvard Medical School. Ich bin Joe Laro, ebenfalls aus dem Van Noian-Labor.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Fluoreszenz-Bildgebung der DNA-Replikation in Echtzeit auf einzelnen Molekülen. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um koordinierte DNA-Syntheseaktivitäten einzelner Replikationskomplexe zu untersuchen. Beginnen wir also.Um dieses Verfahren zu beginnen, annealen Sie das biotinylierte Tail-Oligo an die M13-Einzelstrang-DNA, indem Sie ein zehnfaches Überschuss an Oligo in TBS-Puffer hinzufügen, auf 65 Grad Celsius erhitzen und dann den Wärmeblock ausschalten, um eine langsame Abkühlung zu ermöglichen, die eine korrekte Annealing des Primers gewährleistet. Nachdem der Primer M13 vorbereitet ist, geben Sie ihn zu einer Mischung aus 64 Nanomolar T7-DNA-Polymerase und T7-Replikationspuffer, die dNTPs und Magnesiumchlorid enthält, und inkubieren die Reaktion 12 Minuten bei 37 Grad Celsius. Beenden Sie die Inkubation durch Zugabe von 100 Millimolar EDTA.Reinigen Sie anschließend das aufgefüllte Produkt-DNA mittels Phenol-Isoamylalkohol-Chloroform-Extraktion und dialysieren Sie es in TE-Puffer oder einen anderen geeigneten Lagerpuffer. Extrahieren Sie jede organische Phase erneut, um eventuell verbliebene primerte M13-DNA zurückzugewinnen. Bestimmen Sie nach der Dialyse die DNA-Konzentration mit einem UV-Vis-Spektrophotometer. Eine Runde der Template-Präparation kann ausreichend Nanomolar-Konzentration an Template für Hunderte bis Tausende Einzelmolekül-Experimente liefern.Nun, da die DNA vorbereitet ist, fahren Sie mit der Herstellung der funktionalisierten Deckgläser fort. Die zu replizierende DNA wird an mit Amil Lane funktionalisierte Glasdeckgläser gebunden, wobei die Oxygruppe des Amil an das Glas bindet und eine Aminogruppe freisetzt, die zur Bindung biotinylierter PEG-Moleküle dient. Diese Beschichtung trägt dazu bei, unspezifische Bindungen an der Oberfläche zu verringern.Um die Glasdeckgläser gründlich zu reinigen, legen Sie sie in Färbegefäße und füllen die Gefäße mit Ethanol, das 30 Minuten lang ultraschallbehandelt wird. Spülen Sie die Gefäße aus und füllen Sie sie mit einmolarer Kaliumhydroxidlösung; behandeln Sie diese 30 Minuten lang mit Ultraschall und wiederholen Sie beide Waschschritte. Für die erste Funktionalisierungsreaktion müssen alle Spuren von Wasser entfernt werden.Füllen Sie die Färbegefäße mit Aceton und behandeln Sie sie 10 Minuten lang mit Ultraschall. Leeren Sie die Gefäße und füllen Sie sie erneut mit Aceton. Geben Sie anschließend das Sine-Reagenz zu den Gefäßen hinzu und schütteln Sie zwei Minuten lang.Anschießend mit einem großen Überschuss an Wasser abspülen. Danach die Deckgläser trocknen, indem sie 30 Minuten lang bei 110 Grad Celsius im Ofen gebacken werden. Als Nächstes die PEG-Mischung mit etwa 0,2 % Gewicht pro Volumen herstellen, wobei ein Glas-Deckglas-Abstandshalter verwendet wird, um die Deckgläser voneinander zu trennen; pipettieren Sie 100 Mikroliter auf ein trockenes silanisiertes Deckglas.Legen Sie eine zweite Deckglas auf die erste. Inkubieren Sie die Deckgläser drei Stunden lang in der PEG-Lösung. Trennen Sie anschließend jedes Paar Deckgläser und waschen Sie sie gründlich mit Wasser. Stellen Sie sicher, dass die Deckgläser mit der funktionalisierten Seite nach oben liegen, da nur eine Seite mit PEG beschichtet ist. Trocknen Sie die Deckgläser abschließend mit Druckluft und lagern Sie sie unter Vakuum in einem Exsikkator; die Oberflächen bleiben mindestens einen Monat stabil. Auf diese Weise können Dutzende von Deckgläsern in einer Charge hergestellt und nach Bedarf verwendet werden.Da die Deckgläser nun bereit sind, kann man die Flusskammer für das Einzelmolekül-Experiment zusammenbauen. Geben Sie zunächst 20 bis 25 Milliliter Blockpuffer mit BSA in ein Exsikkator, um Luftblasen für spätere Schritte zu entfernen. Verdünnen Sie anschließend 25 Mikroliter Streptavidin in 100 Mikroliter PBS und verteilen Sie die Lösung auf der Oberfläche eines mit Peg funktionalisierten Deckgläschens. Inkubieren Sie 20 Minuten bei Raumtemperatur, um die Bindung von Streptavidin an die biotinylierte Oberfläche zu ermöglichen, während andere Teile der Kammer vorbereitet werden.Während der Deckglaser im Brutschrank inkubiert wird, schneiden Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband mit Trägerfolie auf beiden Seiten zurecht, sodass es der Größe des Quarzobjektträgers entspricht, der zur Montage der Durchflusskammer verwendet wird. Markieren Sie die Position der Schlauchbohrungen auf dem Klebeband mit einem Bleistift, damit ein Umriss der Durchflusskammer auf das Band gezeichnet werden kann. Nachdem die Bohrungen markiert wurden, zeichnen Sie ein zwei Millimeter breites Rechteck um die Markierungen herum.Dieses Rechteck dient als Durchflusskanal. Achten Sie daher darauf, gerade Seiten zu schneiden und genügend Platz um den Schlauchzulauf und -ablauf freizulassen. Schneiden Sie nun das markierte Klebeband entlang der eingezeichneten Kontur, und führen Sie gerade, saubere Schnitte aus, um sicherzustellen, dass kein Klebstoff in den Kanal hineinragt. Reinigen Sie den Quarzobjektträger gründlich mit Aceton, um Klebstoffrückstände von Durchflusszellen zu entfernen, die in vorherigen Experimenten verwendet wurden.Finden Sie die optimale Ausrichtung der Kanalumrisslinie. Entfernen Sie eine Seite der Klebefolie und platzieren Sie das Band vorsichtig auf dem Objektträger. Achten Sie darauf, das Band korrekt auszurichten, da die Einlass- und Auslassöffnungen frei bleiben müssen.Bereiten Sie als Nächstes die Schläuche in einer Länge von 0,76 Millimeter für den Einlass und Auslass der Durchflusszelle vor. Es ist hilfreich, das Ende des Schlauchs in einem Winkel von etwa 30 Grad abzuschneiden, damit der Schlauch nicht flach auf dem Boden der Kammer aufliegt. Stellen Sie die Schläuche auf Reagenzglasgestelle, um sie in den nächsten Schritten leicht an die Durchflusszelle anschließen zu können.Mittlerweile ist die Inkubation der Deckgläser beendet. Spülen Sie das mit Strep-Avidin-ENC beschichtete Deckglas gründlich mit Wasser ab und trocknen Sie es mit Druckluft. Achten Sie darauf, das Deckglas nicht umzudrehen, da nur eine Seite funktionalisiert ist.Schließen Sie schließlich die Montage der Flusskammer ab, indem Sie die andere Seite der Klebebandabdeckung entfernen und den Quarzobjektträger auf die Deckglasplatte legen. Drücken Sie leicht auf das Deckglas, um eingeschlossene Luft aus dem Klebstoff zu verdrängen. Dies trägt dazu bei, die Bildung von Luftblasen im Flusskanal zu verhindern.Versiegeln Sie die Seiten der Kammer mit Epoxidharz. Führen Sie den zugeschnittenen Schlauch in die Bohrungen des Quarzes ein und verschließen Sie ihn mit Epoxidharz. Lassen Sie das Ganze einige Minuten trocknen. Sobald die Epoxidsiegelung trocken ist, beginnen Sie mit der Blockierung der Oberfläche.Unter Verwendung einer 21-Gauge-Nadel ziehen Sie etwas des Degas-Blockierpuffers durch eines der Röhrchen. Spülen Sie mehrmals durch, um Luftblasen zu entfernen, und lassen Sie die Kammer mindestens eine halbe Stunde inkubieren, bevor Sie mit dem Einzelmolekül-Replikations-Experiment fortfahren.Nachdem die Flusszelle blockiert wurde, platzieren Sie sie auf dem Mikroskopstadium. Halten Sie die Kammer mit Bühnenklammern fest und stellen Sie sicher, dass der Flusskanal entlang der y-Achse ausgerichtet ist. Verbinden Sie das Auslassrohr der Flusszelle mit der Spritzenpumpe, indem Sie einen Schlauch mit größerem Durchmesser als Verbindungsstück verwenden.Platzieren Sie den Inlet in Blockpuffer und ziehen Sie mit der Spritze zurück, um Luft aus dem Schlauch zu entfernen. Ein sanftes Klopfen auf den Outlet-Schlauch hilft dabei, Luftblasen, die in der Flusszelle eingeschlossen sind, zu entfernen. Geben Sie nun die DNA hinzu, verdünnen Sie die DNA-Ausgangslösung auf 25 Pikomolar in einem Milliliter Blockpuffer und lassen Sie diesen 30 Minuten lang mit moderater Flussrate, beispielsweise 0,025 Milliliter pro Minute, in die Kammer fließen, um eine gute Oberflächenbedeckung mit DNA zu gewährleisten.Sobald sich die DNA in der Kammer befindet, spülen Sie überschüssige DNA mit Blockierpuffer mindestens 200 Flusszellen-Volumina lang aus. Um die gesamte freie DNA zu entfernen, schalten Sie den Laser und die Kamera ein. Die gekühlte CCD-Kamera muss die Betriebstemperatur erreichen, bevor sie verwendet werden kann.Nachdem überschüssige DNA abgewaschen und der Replikationspuffer entgast wurde, bereiten Sie die Replikationsreaktionsmischung mit Nukleotiden, DTT und Cytoxin im Replikationspuffer vor. Anschließend geben Sie die Proteine hinzu und mischen vorsichtig. Danach leiten Sie die Reaktionsmischung in die Flusszelle ein.Die Strömungsgeschwindigkeit muss hier ausreichend sein, um doppelsträngige DNA in einem zwei Millimeter breiten und 100 Mikrometer hohen Strömungskanal zu strecken. Eine Durchflussrate von 0,04 Milliliter pro Minute hat sich bewährt. Geben Sie der Mischung etwa 10 Minuten Zeit, um in die Kammer einzutreten.Bewegen Sie das Sichtfeld zur Seite des Kanals und fokussieren Sie auf das Klebematerial, um sicherzustellen, dass man sich nahe der Oberfläche befindet, um zu fokussieren und mit der Bildaufnahme zu beginnen. Passen Sie die Laserleistung, den Mikroskopfokus und den Turf-Winkel an. Halten Sie die Leistung niedrig, um eine photochemische Spaltung der gefärbten DNA zu vermeiden.Je nach Geschwindigkeit der DNA-Replikation eine bis fünf Bilder pro Sekunde über mehrere Minuten aufnehmen. Wiederholen Sie den Vorgang, um längere Replikationsverläufe zu erhalten, oder wechseln Sie zu einem neuen Bildausschnitt, um weitere Moleküle zu beobachten, wenn nahezu die gesamte Reaktionsmischung in die Zellströmung gepumpt wurde; geben Sie mehr Puffer mit Cyt zu, um andere Sichtfelder zu betrachten. Die Aufnahme mehrerer Bilder verschiedener replizierter Moleküle liefert statistische Daten zur Bestimmung der Produktivität.Bei der Rolling-Circle-Replikation verlängert die führende Strangsynthese das Ende, das den Kreis mit der Oberfläche verbindet, und das Ende wird durch die Polymerase des nachfolgenden Strangs in doppelsträngige DNA umgewandelt und durch die gezeigte laminare Strömung gestreckt. Hier ist ein Beispiel für ein Sichtfeld mit Cyt Orange bei 532 Nanometer Anregung.Die kleinen fluoreszierenden Flecken sind verankerte, nicht replizierte Substrate. Beachten Sie die extreme Länge der Produkte und die große Anzahl an Produkten pro Feld. Ein typisches Sichtfeld zeigt zahlreiche replizierende Moleküle, die als helle, wachsende Linien aus gefärbter DNA sichtbar sind. E. Coli-Experimente bei 37 Grad Celsius ergeben je nach Oberflächendichte fünf bis 50 Moleküle pro Feld.Die T7-Replikationszone setzt viel effizienter ein und wird mehr als 50 % der Moleküle in einem Feld replizieren. Aufgrund dieser hohen Dichte ist es schwierig, einzelne Moleküle wie hier gezeigt aufzulösen. Führen Sie daher das T7-Experiment bei niedrigeren Protein-Konzentrationen oder geringerer Oberflächendichte durch. Chimäre Graphen typischer replizierender Moleküle aus E. coli- und T7-Experimenten enthalten Endpunkt-Trajektorien von Molekülen aus E. coli und T7, die über die Zeit aufgetragen sind. Die Trajektorien werden mittels linearer Regression angepasst, um die Replikationsraten zu ermitteln, die in diesem Beispiel 467,1 Basenpaare pro Sekunde für E. coli und 99,4 Basenpaare pro Sekunde für T7 betragen.Für T7 ergeben die Ratenverteilungen einzelner Molekültrajektorien, die mit einzelnen Gauß-Funktionen angepasst wurden, eine mittlere Geschwindigkeit von 535,5 ± 39 Basenpaaren pro Sekunde für E. coli und 75,9 ± 4,8 Basenpaaren pro Sekunde für G7. Für T7 werden die Längenverteilungen der Replikationsprodukte mit einem einfachen exponentiellen Abfall angepasst, um die Produktivität zu erhalten, die bei 85,3 ± 6,1 Kilobasenpaaren für E. coli und 25,3 ± 1,7 Kilobasenpaaren für G7 liegt. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man koordinierte DNA-Replikation auf Einzelmolekülebene messen kann.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Deckgläser ordnungsgemäß zu funktionalisieren und saubere, gerade Flusskanäle anzulegen. Achten Sie darauf, die Laserleistung niedrig zu halten und die photochemische Spaltung der langen DNA zu minimieren. Das war's.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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