Montage-, Lade-und Alignment einer analytischen Ultrazentrifuge Messkammerdirektanschluss
5. November 2009
Die analytischen Ultrazentrifuge (AUC) Probenzelle hält Probe und Referenz-Puffer und während der Experimente und eine hohe Vakuum-und Rotor-Geschwindigkeiten von bis zu 60.000 Umdrehungen pro Minute ausgesetzt. Dieses Video startet den viel Liebe zum Detail, die für Montage, Be-und Ausrichtung dieses sehr wichtige Komponente einer AUC Experiment demonstrieren.
Hallo, ich bin Andrea Balbo. Ich arbeite in der Peter Shucks Gruppe an den National Institutes of Health. In diesem Video zeigen wir Ihnen unsere Verfahren für die Montage, Beladung und Rotorausrichtung einer analytischen Ultrazentrifugen-Probenzelle.
Fangen wir an. Gesammelt. Hier sind die Komponenten einer analytischen Ultrazentrifugen-Probenzelle: Im Inneren des Zellgehäuses befindet sich ein 12 Millimeter großes Doppelsektor-Aktivkohlefeld-Epon-Mittelstück, das zwischen zwei Fensterbaugruppen angeordnet wird. Jede Fensterkombination besteht aus einer Fensterdichtung, einer Fensterverkleidung und einem Fenster, das im Fensterhalter gehalten wird.
Diese Teile werden dann in das Zellgehäuse geschoben, indem ihre Keilnuten mit dem Schlüssel im Gehäusezylinder ausgerichtet werden, einer Gehäusedichtung, und dann ein Schraubring schließt die Probenzelle mit einem Drehmomentdruck zwischen 120 und 140 Zoll Pfund. Nachdem Sie Ihre Probe in die Referenz geladen haben, dichten zwei Gehäusesteckerdichtungen und ein Gehäusestopfen die Ladelöcher der Zelle ab, um Scanartefakte, Lecks und Brüche während der Experimente zu vermeiden. Es ist wichtig, dass alle Komponenten sauber, trocken, staubfrei, frei und in bestmöglichem Zustand sind, häufig untersucht und bei Bedarf ausgetauscht werden. Sie benötigen außerdem Folgendes: eine analytische Ultrazentrifuge, einen Vierlochrotor aus Titan, eine Laborwaage, einen Drehmomentschlüssel mit ablesbarem Zifferblatt und einem Drehmomentständer, ein Gegengewicht und ein Gegengewichtsgewicht, einen Schlitzschraubendreher, eine Pinzette, eine 200-Mikroliter-Pipette mit einer langen, sich verjüngenden Pipettenspitze, Ausrichtungswerkzeuge und Spin-Coat-Schmiermittel.
Wir beginnen mit dem Bau von Musterzellen, indem wir zwei Fensterbaugruppen zusammenstellen. Platzieren Sie zunächst eine Fensterdichtung an der Unterseite des Fensterhalters. Positionieren Sie als Nächstes die Fensterverkleidung, oder manchmal auch Fensterkissen genannt, im Fensterhalter so, dass die Öffnung der Auskleidung in einem leichten Winkel gegenüber der Keilnut des Halters liegt.
Setzen Sie dann das Fenster in die Halterung ein und richten Sie die Anreißmarkierung auf der Scheibe an der Keilnut des Fensterhalters aus. Drücken Sie an den äußersten Rändern auf beiden Seiten des Fensters vorsichtig nach unten. Um eine ordnungsgemäße Abdichtung und ein genaues Twerking der Probenzelle zu gewährleisten, beschichten wir die Gehäusedichtung leicht im Schraubring.
Verteilen Sie mit dem Spin Coat Gleitgel eine sehr kleine Menge Spin Coat zwischen Daumen und Zeigefinger. Beschichten Sie die Schraubringgewinde mit einem dünnen, unsichtbaren Film aus Spinnlack. Beschichten Sie ebenfalls die Gehäusedichtung.
Wischen Sie sichtbares Schmiermittel ab. So beginnen Sie mit dem Zusammenbau der Probenzelle. Schieben Sie eine Fensterbaugruppe mit dem Fenster nach oben in das Zellengehäuse, indem Sie die Keilnut mit dem Gehäuseschlüssel ausrichten.
Richten Sie die Keilnut des Mittelstücks mit dem Gehäuseschlüssel aus und lassen Sie sie vorsichtig auf die Fensterbaugruppe im Inneren des Gehäuses fallen. Verwenden Sie niemals irgendein Werkzeug, um das Mittelstück in das Zellengehäuse zu schieben. Dies könnte zu dauerhaften Schäden am Mittelstück führen, was zu Lecklagerungsexperimenten führen kann.
Drehen Sie die zweite Fensterbaugruppe so, dass das Fenster zum Mittelstück hin und von Ihnen weg zeigt. Richten Sie die Keilnut mit dem Gehäuseschlüssel aus und schieben Sie ihn oben auf dem Mittelstück nach unten. Setzen Sie die Gehäusedichtung auf.
Dann ein Schraubring, damit das Wort heraus sichtbar ist. Mit den Fingern. Dann ein Ausrichtwerkzeug, ziehen Sie den Schraubring von Hand fest.
Manchmal gleitet das Mittelstück nicht leicht in den Gehäusezylinder. Sie können es zuerst ausrichten und dann die zweite Fensterbaugruppe darauf platzieren. Durch sanften Druck nach unten auf die Fenstermontage.
Sie können beides gleichzeitig in das Zellengehäuse schieben. Auf diese Weise vermeiden wir, direkt auf das Mittelstück zu drücken. Jetzt ist ein guter Zeitpunkt, um die Zelle auf Staub, Flusen und Fingerabdrücke zu untersuchen.
Sie werden auch Newton-Ringe bemerken, die anzeigen, dass sich zwischen dem Mittelstück und den Fenstern noch Luft befindet. Diese verschwinden nach dem Anziehen mit dem Schraubring nach oben und das Wort ist sichtbar. Platzieren Sie die Probenzelle ganz nach unten in der Zelle.
Drehmomentspannzange des Drehmomentständers. Halten Sie die Zelle an Ort und Stelle, indem Sie konstanten Druck auf den Griff des Drehmomentständers ausüben. Ziehen Sie den Schraubenring in einer kontinuierlichen Bewegung auf 120 bis 140 Zoll Pfund an.
Lösen Sie den Griff des Drehmomentständers und entfernen Sie vorsichtig die Probenzelle. Routiniert laden wir ein Volumen von 400 Mikrolitern in jeden Sektor des 12-Millimeter-Mittelstücks. Positionieren Sie die Probenzelle mit einer 200-Mikroliter-Pipette so, dass die Ladelöcher oben liegen und das Wort auf dem Schraubring sichtbar ist.
Schieben Sie die Pipettenspitze halb nach unten in den linken Mittelstücksektor durch die Ladelöcher und geben Sie langsam 200 Mikroliter Referenzlösung ab. Wiederholen Sie dies einmal, um insgesamt 400 Mikroliter mit derselben Pipettenspitze und derselben Technik vorsichtig und langsam zu erhalten. Füllen Sie den richtigen Mittelstücksektor mit 400 Mikrolitern Probenlösung.
Es ist zwingend erforderlich, die Volumina der Referenz- und Musterlösungen so genau wie möglich aufeinander abzustimmen. Setzen Sie die Pipettenspitze fest auf die Pipette auf, laden und dosieren Sie die Lösungen langsam, vermeiden Sie Ladeblasen und verwenden Sie für beide Lösungen dieselbe Pipettenspitze. Alle tragen dazu bei, dass die Volumina gleich bleiben, um die Zelle abzudichten.
Platzieren Sie zwei rote Gehäusesteckerdichtungen fest in jedem Ladeloch und achten Sie darauf, dass sie sorgfältig zwischen dem Mittelstück und dem Aluminiumgehäuse positioniert sind. Decken Sie jedes Ladeloch mit einem Gehäusestopfen ab und ziehen Sie es mit einem kleinen Schlitzschraubendreher von Hand fest. Stellen Sie vor dem Beladen des Rotors sicher, dass das Gegengewicht und die Zelle, die dem Gegengewicht gegenüberliegen, innerhalb eines Gewichts von 0,5 Gramm voneinander entfernt sind.
Beginnen Sie mit einem Saldo bei Null. Wiegen Sie zunächst eine Probenzelle, die sich gegenüber dem Gegengewicht befindet. Zerreißen Sie die Waage, um das Gewicht der Probenzelle zu subtrahieren.
Wiegen Sie dann das Gegengewicht. Hier stellen wir fest, dass das Gegengewicht 4,193 Gramm leichter ist als die Probenzelle. Wählen Sie ein vier Gramm schweres Gegengewicht und schrauben Sie es in das Befestigungsloch des Gegengewichts, wobei Sie darauf achten, dass es nicht aus der Oberseite herausragt.
Schieben Sie das Gegengewicht an, um sicherzustellen, dass das Endgewicht innerhalb von 0,5 Gramm liegt. Platzieren Sie das Gegengewicht mit einem Vierlochrotor in Position vier, so dass der weiße Pfeil sichtbar ist und in Richtung der Zentrifugalkraft zeigt. Stellen Sie mit einem Ausrichtungswerkzeug sicher, dass es sich ganz unten im Inneren des Rotors befindet.
Positionieren Sie die Waagenmesszelle so, dass die Gehäusestopfen zur Mitte des Rotors zeigen und das Wort auf dem Schraubring sichtbar ist. Stellen Sie auch hier mit einem Ausrichtungswerkzeug sicher, dass es sich ganz unten im Inneren des Rotors befindet. Blick unter den Rotor.
Richten Sie die Innenseite aus. Ritzen, markieren Sie mit einem Ausrichtungswerkzeug die Markierung, die der Mitte des Rotors am nächsten liegt, mit der Markierung auf dem Gegengewicht. Richten Sie die Probenzelle auf die gleiche Weise an Position zwei aus.
Nachdem alle Zellen ausgerichtet sind, ist der Rotor bereit für die Platzierung in der Zentrifugenkammer.
Überblick
Dieses Video zeigt die Montage, das Beladen und die Ausrichtung einer Probenzelle für eine analytische Ultrazentrifuge (AUC), was für AUC-Experimente entscheidend ist. Die richtige Handhabung und Vorbereitung der Probenzellenkomponenten wird betont, um genaue Ergebnisse zu gewährleisten.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Analytische Ultrazentrifugation
- Biophysikalische Methoden
- Techniken zur Probenvorbereitung
Hintergrund
- Die AUC-Probenzelle ist für die Durchführung von Experimenten bei hohen Rotorgeschwindigkeiten unerlässlich.
- Sie besteht aus mehreren Komponenten, die präzise zusammengesetzt werden müssen.
- Die Aufrechterhaltung von Sauberkeit und korrekter Ausrichtung ist entscheidend, um experimentelle Artefakte zu vermeiden.
- Das Verständnis des Montageprozesses ist für Forscher, die AUC verwenden, von entscheidender Bedeutung.
Zweck der Studie
- Ein detaillierter Leitfaden für die Montage und das Beladen einer AUC-Probenzelle zur Verfügung zu stellen.
- Die Bedeutung einer sorgfältigen Vorbereitung bei AUC-Experimenten hervorzuheben.
- Sicherzustellen, dass Forscher den Prozess genau replizieren können.
Verwendete Methoden
- Montage von Fensterbaugruppen und Zentralteil in der Probenzelle.
- Anwendung von Drehmoment zur Sicherung der Probenzellenkomponenten.
- Beladen von Referenz- und Probenlösungen in die Zelle.
- Ausbalancieren der Probenzelle mit einem Gegengewicht für genaue Messungen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Montage der AUC-Probenzelle, wie im Video gezeigt.
- Korrekte Ladetechniken gewährleisten minimale Blasen und gleiche Volumina.
- Gegengewichtsanpassungen sind entscheidend für eine genaue Rotorleistung.
- Visuelle Indikatoren, wie Newton'sche Ringe, helfen bei der Beurteilung der Montagequalität.
Schlussfolgerungen
- Aufmerksamkeit bei der Detailgenauigkeit bei der Montage der Probenzelle ist für AUC-Experimente unerlässlich.
- Die Befolgung der beschriebenen Verfahren kann die Zuverlässigkeit des Experiments verbessern.
- Regelmäßige Wartung und Inspektion der Komponenten wird empfohlen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Proper assembly and alignment of analytical ultracentrifuge sample cells are critical for generating reliable biophysical data on protein size, shape, purity, and oligomerization states. Meticulous sample cell preparation minimizes experimental artifacts, ensuring data integrity for target validation and mechanistic studies in early drug discovery. This procedural rigor supports predictive confidence in downstream screening and lead optimization workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise determination of protein oligomerization states and protein-protein interactions, directly informing target validation hypotheses.
- Operational Value: Provides label-free, solution-based assessment of macromolecular properties under near-native conditions.
- Predictive Value: Reduces mechanistic ambiguity in target de-risking by delivering quantitative sedimentation coefficients and shape parameters.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers hydrodynamic size and shape data essential for assay buffer formulation and stability screening.
- Operational Value: Ensures sample integrity and monodispersity, critical for reproducible biochemical and cell-based assays.
- Platform Integration: Supports biophysical characterization of purified targets prior to high-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables assessment of protein complex formation and conformational changes relevant to disease mechanisms.
- Operational Value: Supports lot-to-lot consistency checks of recombinant proteins used in preclinical models.
- Translational Continuity: Bridges biophysical target characterization with functional assays in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The analytical ultracentrifuge sample cell workflow integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing biophysical readouts that inform go/no-go decisions based on target behavior and stability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of target oligomerization and interaction networks, enabling biological de-risking prior to assay development.
- Screening: Ensures target monodispersity and stability, directly impacting assay readiness and data quality in screening campaigns.
- Analytics: Generates quantitative sedimentation coefficient and molecular weight measurements that allow comparison of protein states under varying conditions.
- Translational Research: Connects purified target biophysics to functional validation in preclinical models through consistent material quality.
- Enterprise Reuse: Represents a standardized, reusable capability for biophysical characterization across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target properties, reduction of mechanistic ambiguity, and improved target validation rigor.
- Operational Value: Standardized sample preparation, reproducibility across runs, and scalability across laboratories.
- Strategic Value: Better-informed go/no-go decisions, reduced failure rates due to target instability, and improved capital efficiency in early discovery.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted target prioritization based on biophysical de-risking data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biophysical techniques and precision handling of optical components.
- Dependent on analytical ultracentrifuge instrumentation, torque wrenches, alignment tools, and cleanroom-compatible sample handling.
- Necessitates cross-team standardization of cleaning, assembly, and torque application protocols.
- Involves adaptation considerations for different sample types, buffer conditions, and centerpiece geometries.
- Limited by component fragility; windows and centerpieces are susceptible to damage from particulates, improper torque, or misalignment.
