Name: Automated System für Single Molecule Fluorescence Messungen der Oberflächen-immobilisierten Biomoleküle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-02T16:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit einem automatisierten konfokalen Mikroskop FRET-Spuren von einzelnen DNA-Molekülen auf einer Oberfläche erfassen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Nukleinsäuredynamiken und Enzyminteraktionen in Echtzeit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken Chandran Sabanayagam für seine Hilfe bei der Entwicklung des Systems, Joshua Edel für Beratung in der Gestaltung der Mikrofluidik-Gerät und das Personal an der Rowland Institute der Harvard University für die Bearbeitung von Teilen der Einrichtung. Wir erkennen an, nützliche Gespräche mit Mitgliedern der Meller Gruppe an der Rowland Institute und an der Boston University, und die Mitglieder der T. Ha &#39;s-Gruppe am UIUC für hilfreiche Informationen. Schließlich schätzen wir die finanzielle Unterstützung von der National Science Foundation (PHY-0701207) und dem National Institute of Health (GM075893).

1 - Montage des mikrofluidischen Zelle Die mikrofluidischen Zelle erfolgt durch Fusion aus einem gemusterten, 2 mm dick, Polydimethylsiloxan (PDMS) Festplatte auf eine frisch gereinigte Quarz Deckglas. Die PDMS-Diskette enthält vier 30 ul rechteckigen Kammern, die durch Ein-und Auslass flexible Kapillaren verbunden mit einem Pufferspeicher und einer Spritzenpumpe, bzw. für die kontrollierte Fluss von Puffer zugegriffen wird. Die Messzelle ist auf seiner Rückseite durch ein Glasfenster unterstützt und auf eine maßgeschneiderte Küvettenhalter mit einem wassergekühlten thermoelektrischen Element die Temperatur zu regulieren. <ol><li> Um die gemusterten PDMS Festplatte, mix 10 Teilen Silicon-Elastomer-Basis mit 1 Teil Härter, gut mischen und Entgasung für 1 Stunde im Vakuum. </li><li> Vorsichtig gießen das Elastomer-Mix auf den mikrofluidischen Zelle Form. In unserem Fall ist dies ein 1 &quot;Silizium-Wafer mit vier Streifen (1x10 4 x 1x10 3 x 300 um) von negativen Photoresist gemacht. Lassen Sie diese auf einer Heizplatte bei 70 ° C aushärten für zwei Stunden. </li><li> Ziehen Sie vorsichtig das gehärtete PDMS Festplatte aus der Form mit einer Rasierklinge. Sicherung der Festplatte auf ein 1&#39;&#39;Glasfenster (mit 8 x 2 mm Durchmesser vorgebohrt an beiden Enden der Kanäle) von Plasma-oxidierende beide Oberflächen für 30 Sekunden. Sicherung der Glasscheiben auf der flachen Seite des PDMS Festplatte (die Seite nicht mit den Kanälen). </li><li> Legen Sie ein 2-Zoll langen, flexiblen Quarzglaskapillare Schlauch durch jede Glasscheibe das Loch, bis sie den Kanal erreicht. Einsetzen einer Nadel und dann nach mit der Kapillare kann diesen Prozess erleichtern. Seal die Glasscheibe Löcher mit einer schnellen Aushärtung Silikonverguss wie Kwik-Cast. </li><li> Spülen der Kanäle mit Ethanol und Wasser, und Plasma-Aktivierung der Zelle zusammen mit einem frisch gereinigten, 1-Zoll runden Quarz Deckglas für 30 Sekunden. Wir schlagen vor, Reinigung dieses Deckglas mit Piranhas *. Fuse das Deckglas auf der Seite der Zelle mit den Kanälen, Abdichtung der Kammern. </li><li> Lassen Sie die Montage Zelle zu härten bei Raumtemperatur über Nacht. </li></ol> * Piranha ist eine Lösung von H 2 O 2 und H 2 SO 4 in 1:2.5 Proportionen. Zur Reinigung der Deckgläser, tauchen sie in Piranha bei 90 ° C für 20 min. 2 - Die Aktivierung der Oberfläche für Molekül Immobilisierung Für Nukleinsäure-Studien besteht die einfachste Oberflächenimmobilisierung Schema der ersten Beschichtung eine Glas-oder Quarz-Deckglas mit biotinyliertem Rinderserumalbumin (BSA) und dann mit Streptavidin. Dies ermöglicht dem biotinylierten Probe mit hoher Spezifität für Tage bei Raumtemperatur immobilisiert werden. <ol><li> Connect flexible Schlauch an den Kapillaren zur einfachen Puffer-Injektion mit einer Spritze und Nadel. </li><li> Inject einer Lösung von 0,1 mg / ml biotinylierte BSA in Puffer A (10 mM TRIS-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, gefiltert mit 0,02 um-Filter) in den Kanal und Inkubation für mindestens 30 min. </li><li> Flow 300-500 ul Puffer A mit einem freien biotinylierten BSA aus dem Kanal zu entfernen, wobei darauf geachtet, keine Luftblasen im Inneren der Kammer Falle. </li><li> Inject einer Lösung von 0,1 mg / ml Streptavidin in Puffer A und Inkubation für 15 min. Wiederholen Sie dann Schritt 3. </li><li> Der Fluss durch eine 3-5 pM Lösung des biotinylierten Probe. Führen Sie eine Oberflächen-Scan, um die Abdeckung der fluoreszierenden Moleküle kontrollieren. Wenn nötig, erhöhen die Konzentration der Probe um eine bessere Abdeckung zu erreichen. Inkubieren für 10 min und wiederholen Sie Schritt 3. </li></ol> Die mikrofluidischen Zelle befindet sich auf einem motorisierten XY-Tisch ermöglicht grob (bis zu 25 mm) Bewegung mit optisch kodiert DC-Motoren montiert und fein (1 nm) Bewegung mit zwei closed-loop Piezo-Aktuatoren (Physik Instrumente Modell M-014 oder ähnlich). Dies kann entweder vor oder nach der Aktivierung der Oberfläche für die Immobilisierung Probe durchgeführt werden. 3 - Vorbereiten der Imaging Buffer (IB) Die IB besteht aus einer enzymatischen Sauerstoffbindung und einem Triplett-Quencher, wie Trolox. Da der IB durch ständig über Nacht geleert wird, sollte mindestens 10 ml im Voraus vorbereitet werden. <ol><li> Bereiten Sie 10 ml von 0,8% w / v D-Glucose, mindestens 35 mM TRIS-HCl pH 8,0 und 50 mM NaCl in deionisiertem Wasser. Die höhere Konzentration des Puffers ist aus zwei Gründen wichtig: Lösen Trolox wird die Lösung in einen sauren und der enzymatischen Reaktion wird auch niedriger der pH-Wert der Lösung im Laufe der Zeit. Da diese Lösung hat eine lange Haltbarkeit kann es als eine Stammlösung gelagert werden. </li><li> Lösen Sie 5 mg Trolox im Puffer in Schritt 1 durch Vortexen für ein paar Minuten und dann Schütteln für&gt; 10 min bereit. Trolox ist nicht sehr leicht löslich in Wasser bei pH&gt; 7, so drängt es nicht diesen Schritt. Die Lösung wird mit einem 0,2 um-Filter und lassen Entgasung im Vakuum für 10 Minuten. </li><li> Bereiten Sie die &quot;gloxy&quot; enzymatische Lösung durch Mischen von 60 ul water, 20 ul 5X Puffer A, 20 ul der Katalase, 1 mg Glucose-Oxidase und 100 ul 10 mg / ml BSA. Die Lösung wird mit einem 0,22 um Filter-Zentrifuge. </li><li> Vorsichtig mischen Puffer aus Schritt 2 mit dem &quot;gloxy&quot;-Lösung aus Schritt 3 Vermeidung der Bildung von Luftblasen. </li><li> Durchfluss der IB durch den Kanal mit einer konstanten Rate von 5 l / min mit einem mechanischen Spritzenpumpe, um den Fluss zu steuern. Bubble-Argon-Gas in die IB Reservoir an Luftsauerstoff aus re-Auflösung in den Puffer zu verhindern. </li></ol> Die Abtastung der Oberfläche, Molekül-Lokalisierung und Erfassung von einzelnen Moleküls Intensität Spuren wird durch ein LabView-Programm, das automatisierte Datenerfassung 1 erlaubt gesteuert. Das Programm scannt 20x20 um 2 Bereiche mit 0,2 mm Auflösung mit einer Geschwindigkeit von 0,1 mu m / ms. Die Daten werden sofort verarbeitet, um die Intensität gewichteten Positionen aller Pixel über dem Hintergrund zählt zu erhalten. Sobald die immobilisierten Moleküle gefunden werden, werden sie verschoben eins nach dem anderen in das konfokale Volumen und die Intensität der Donor-und Akzeptor-Fluorophor als Funktion der Zeit, bis beide Fluorophore photobleach werden aufgezeichnet. Die Bühne ist dann so programmiert werden, um einen neuen Ursprung 100 pm weg, und der Scan-Vorgang wird wiederholt. 4 - repräsentative Ergebnisse Im Folgenden sind einige Bilder zeigen die versammelten mikrofluidische Zelle vor Aktivierung der Oberfläche und, nachdem er auf dem Mikroskop bereit für Molekül Immobilisierung montiert. Wenn der Kanal erfolgreich aktiviert ist, sollte Oberflächenscans ähnlich sein wie die Scans unten zeigt Emission des Donor-Farbstoff (grün) und Akzeptor (rot) nach direkter Anregung des Donors dargestellt. Diese Moleküle sind eins nach dem anderen in die Sondierung Volumen bewegt wird und die Fluoreszenz wird im Laufe der Zeit, bis beide Farbstoffe photobleach aufgezeichnet, wie in der einzigen Molekül Spuren gezeigt. Von Spuren wie diese kann man erhalten, die FRET-Effizienz, die von der momentanen Donor-Akzeptor-Trennung, die wiederum verwendet, um die Struktur und Dynamik von Molekülen von biologischem Interesse zu erkunden, ist informiert. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig1tmb.jpg" alt="Abbildung 1" border="0" /> Abbildung 1: Microfluidic Zelle mit vier Kanälen, die jeweils mit Eingang / Ausgang Kapillaren. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig1.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig2tmb.jpg" alt="Abbildung 2" border="0" /> Abbildung 2: Cell am Mikroskop bereit für Messungen montiert. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig2.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig3tmb.jpg" alt="Abbildung 3" border="0" /> Abbildung 3: Setup für sm-FRET-Messungen. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig3.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 3 zu sehen. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig4tmb.jpg" alt="Abbildung 4" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig5tmb.jpg" alt="Abbildung 5" border="0" /> Abbildungen 4 und 5: Rote und grüne Kanal eines Oberflächen-Scan von immobilisierten FRET-Moleküle mit grünem Laser angeregt. Bitte klicken Sie auf eine größere Version zu sehen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig4.jpg">Abbildung 4</a> oder <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig5.jpg">Abb. 5</a> . <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig6tmb.jpg" alt="Abbildung 6" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig7tmb.jpg" alt="Abbildung 7" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig8tmb.jpg" alt="Abbildung 8" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig9tmb.jpg" alt="Abbildung 9" border="0" /> Abbildungen 6, 7, 8 und 9: Intensity Flugbahnen der Spender (grün) und Akzeptor (rot) Fluorophoren markiert, um ein DNA-Molekül 8, 10, 16 und 18 Basenpaare voneinander entfernt. Bitte klicken Sie auf eine größere Version zu sehen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig6.jpg">Abbildung 6</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig7.jpg">Abbildung 7</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig8.jpg">Abbildung 8</a> oder <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig9.jpg">Abbildung 9</a> .

<ol><li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Techniques%2C+a+Laboratory+Manual%5BTitle%5D)+AND+%22CSHL+Press%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual.</a> CSHL Press. , (2008).</li>
<li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+scanning+confocal+microscope+for+single+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Pys.+Letters%22%5BJournal%5D)">High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis.</a> Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).</li>
<li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Fluorescence+resonance+energy+transfer+to+measure+distances+along+individual+DNA+molecules%3A+Corrections+due+to+nonideal+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer.</a> J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).</li>
<li>Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).</li>
<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single+molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).</li>
<li>Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.</li>
</ol>

Obwohl die obige Protokoll wurde für uns ein besonderes System und für eine bestimmte Auswahl von Farbstoffen (TMR und ATTO647N) optimiert wurde, ist es keineswegs die einzige bewährte Methode. Vor kurzem wurde eine alternative Sauerstoffbindung System, bestehend aus Protocatechusäure (PCA) / ​​Protocatechuat-3 ,4-Dioxygenase (PCD) gezeigt, dass die Photostabilität bestimmter Farbstoffe 4 zu erhöhen. Ebenso können andere Triplett-Zustand Quencher wie β-Mercaptoethanol (BME) anstelle von Trolox verwendet werden, obwohl diese nicht unterdrücken können lang anhaltende Blinken einige Farbstoffe, insbesondere Cy5 5. Obwohl Immobilisierung über Biotin-Streptavidin-biotinylierten Rinderserumalbumin (BSA) ist die bevorzugte Wahl für Nukleinsäuren Studien wird ein Polyethylenglykol (PEG)-beschichteten Oberfläche besser für Untersuchungen von Proteinen geeignet, da es unspezifische Adhäsion 1 verhindert. Darüber hinaus können sub-beugungsbegrenzten Größe Vesikel verwendet werden, um das Biomolekül des Interesses in den Fällen, wo es von Oberflächen-Wechselwirkungen 6 beeinflusst werden kann, zu verkapseln. In diesem Artikel haben wir einem konfokalen Aufbau mit Silikon Avalanche-Photodioden ausgestattet, um die Fluoreszenz-Intensität Spuren erwerben verwendet. Dieses Protokoll funktioniert genauso gut mit Total Internal Reflection Fluorescence Mikroskope (TIRF) mit CCD-Kameras ausgestattet. Unabhängig von der Mikroskopie verwendet, sm-FRET können auf räumliche Auflösungen nähert sich dem Angström, wenn der Donor-und Akzeptor Signal korrekt 7 korrigiert werden informieren.

<table><tbody><tr><td>Schmelzsilikat-Kapillarrohr</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP150375</td><td></td></tr><tr><td>Schmelzsilikat-Abdeckscheibe</td><td>Esco Products</td><td>R425000</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchleitung</td><td>Diba Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotinyliertes BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9085</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>0021122</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastomer-Kit</td><td>Dow Corning</td><td>3097366-1004</td><td>Silikon-Elastomer-Kit</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Aldrich</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>Katalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3155</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-Oxidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-Cast-Dichtungsmittel</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Kwik-Cast</td><td>Silikon-Gussmasse</td></tr></tbody></table>

automated system für single molecule fluorescence messungen der oberflächen-immobilisierten biomoleküle

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)-Mikroskopie wurde in großem Umfang verwendet werden, um die Struktur und Dynamik von Molekülen von biologischem Interesse, wie Nukleinsäuren und Proteinen zu studieren. Einzelmolekül-FRET (sm-FRET)-Messungen an immobilisierten Molekülen erlauben langen Beobachtungen der System-wirksam, bis beide Farbstoffe photobleach-was in der Zeit-Spuren, die über biomolekulare Dynamik mit einem breiten Spektrum von Zeitskalen von Millisekunden bis Minuten. Zur Erleichterung der Übernahme einer großen Anzahl von Spuren für statistische Auswertungen, muss der Prozess automatisiert werden und die Probe Umfeld sollte dicht über die gesamte Messzeit (~ 12 Stunden) gesteuert werden. Dies geschieht mit Hilfe eines automatisierten konfokalen Mikroskop, das die Befragung von Tausenden von einzelnen Molekülen über Nacht ermöglicht, und einem mikrofluidischen Zelle, die den kontrollierten Austausch von Puffer erlaubt, mit eingeschränkten Sauerstoffgehalt und sorgt für eine konstante Temperatur während des gesamten Messperiode. Hier zeigen wir, wie die Mikrofluidik-Gerät montieren und wie man seine Oberfläche für die DNA-Immobilisierung zu aktivieren. Dann werden wir erklären, wie man einen Puffer vorbereiten, die Photostabilität und die Lebensdauer der Fluorophore zu maximieren. Schließlich zeigen wir die Schritte in der Vorbereitung der Einrichtung für die automatisierte Übernahme von zeitaufgelösten Einzelmolekül-FRET beteiligt Spuren von DNA-Molekülen.

In diesem Artikel beschreiben wir, wie wir FRET Spuren von einzelnen DNA-Molekülen auf einer Oberfläche immobilisiert mittels eines automatisierten konfokalen Mikroskop zu erhalten.

Automated System für Single Molecule Fluorescence Messungen der Oberflächen-immobilisierten Biomoleküle

Die Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer-Mikroskopie (FRET) wird in weitem Umfang eingesetzt, um die Struktur und Dynamik biologisch relevanter Moleküle zu untersuchen, ...

Um die Dynamik einzelner Moleküle über einen längeren Zeitraum hinweg zu untersuchen, müssen die Moleküle zunächst räumlich lokalisiert werden. Dies erreichen wir, indem wir sie an der Oberfläche einer mikrofluidischen Zelle immobilisieren. Das Verfahren beginnt mit dem Zusammenbau der Zelle, die vier Kammern enthält, in denen die Biomoleküle fixiert werden.Die Kammern sind über Einlass- und Auslasskapillaren mit der Umgebung verbunden. Die Zelle wird hergestellt, indem eine strukturierte PDMS-Scheibe mit einem Quarzdeckglas verschmolzen wird. Die zusammengesetzte Zelle wird anschließend auf dem Fluoreszenzmikroskop montiert, und flexible Schläuche werden an die Kapillaren angeschlossen, um einen einfachen Lösungsaustausch durch die Kammern zu ermöglichen, um zunächst die Oberfläche zur Immobilisierung von Molekülen zu aktivieren, gefolgt von einem Durchfluss einer Lösung von biotinyliertem BSA durch einen der Kanäle.BSA bindet an die Kammeroberfläche. Anschließend leitet man eine Streptavidin-Lösung durch, die sich an das Biotin bindet. Schließlich führt man das biotinylierte Oligonukleotid zu, das an das Streptavidin bindet und somit das Molekül der Untersuchung an der Oberfläche des Quarz-Deckgläschens verankert.Ein Bildpuffer, der so konzipiert ist, dass die Stabilität und Intensität der Fluorofare über die gesamte Aufnahmedauer maximiert wird, strömt während des gesamten Akquisitionszeitraums mit konstanter Rate durch die Kammer. Die automatisierte Anordnung scannt verschiedene Bereiche der Oberfläche nach Molekülen mit Donor- und Akzeptor-Fluorofaren ab und bewegt diese nacheinander in das Untersuchungsvolumen, wobei für jedes Molekül eine zeitliche Fluoreszenzintensitätskurve aufgezeichnet wird, bis beide Fluorofare photobleichen. Hallo, ich bin Nicholas Dfi aus dem Labor von Professor Miller am Fachbereich Biomedizinische Technik der Boston University.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, um Einzelmolekül-F-Spektren von immobilisierten Nukleinsäuren mithilfe einer konfokalen Anordnung zu erhalten. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Dynamik von Nukleinsäuren sowie Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäuren und Enzymen zu untersuchen. Beginnen wir also.Der Microfluid-Excel wird hergestellt, indem eine strukturierte, zwei Millimeter dicke Scheibe aus Polydimethylsiloxan oder PDMS mit einem frisch gereinigten Quarzdeckglas verbunden wird. Um die strukturierte PDMS-Scheibe herzustellen, mischen Sie 10 Teile Silikonelastomer-Grundmasse mit einem Teil Härter, verrühren gründlich und entgasen eine Stunde im Vakuum. Nachdem die Elastomer-Grundmasse entgast wurde, gießen Sie sie vorsichtig in die Mikrofluidik-Zellform. Lassen Sie die Elastomermischung zwei Stunden lang auf einer Heizplatte bei 70 Grad Celsius aushärten. Nach dem Aushärten die PDMS-Scheibe vorsichtig mit einem Rasiermesser von der Form ablösen. Die PDMS-Scheibe enthält vier rechteckige Kammern mit je 30 Mikrolitern.Verbinden Sie die flache Seite der PDMS-Scheibe, also die Seite ohne Kanäle, durch Plasmabehandlung beider Oberflächen für 30 Sekunden mit einem einen Zoll großen Glasfenster. Das Glasfenster enthält an beiden Enden der Kanäle zuvor gebohrte zwei Millimeter große Löcher. Anschließend wird durch jedes Loch im Glasfenster ein zwei Zoll langes, flexibles Kapillarrohr aus Quarzglas eingeführt.Führen Sie zuerst eine Nadel ein und schieben Sie dann das Kapillarrohr ein, bis es den Kanal erreicht. Versiegeln Sie die Öffnungen im Glasfenster mit einer schnell aushärtenden Silikon-Gussmasse, beispielsweise Quick Cast. Spülen Sie die Kanäle mit Ethanol und Wasser aus, nachdem Sie die Zelle und eine frisch mit Piranha-Reinigungsmittel behandelte kreisförmige Quarzdeckglasplatte von einem Zoll Durchmesser 30 Sekunden lang plasmabehandelt haben.Verbinden Sie den Deckglaser mit der Seite der Zelle, die die Kanäle enthält. Die Kammern sind nun versiegelt. Lassen Sie die montierte Zelle über Nacht bei Raumtemperatur aushärten.Nachdem das zusammengebaute Mikrofluid-Excel über Nacht ausgehärtet ist, wird es in einen speziell angefertigten Halter eingesetzt und auf dem Objekttisch des konfokalen Mikroskops befestigt, um die Aktivierung der Zelloberfläche zu beginnen. Zum Immobilisieren von Molekülen verbinden Sie flexibles Schlauchmaterial mit den Kapillaren der Zelle, um die Injektion von Puffer mittels einer Spritze und einer Nadel zu ermöglichen. Injizieren Sie nun eine Lösung von 0,1 Milligramm pro Milliliter biotinyliertem BSA in Puffer A in den Kanal und inkubieren Sie mindestens 30 Minuten lang.Nach der 30-minütigen Inkubationsphase fließen 300 bis 500 Mikroliter Puffer A durch den Kanal, um nicht gebundenes biotinyliertes BSA aus dem Kanal zu entfernen. Achten Sie darauf, keine Luftblasen in der Kammer einzuschließen. Anschließend geben Sie eine Lösung mit 0,1 Milligramm pro Milliliter STR-Din in Puffer A in den Kanal und inkubieren 15 Minuten lang.Nach der 15-minütigen Inkubationsphase fließen 300 bis 500 Mikroliter Puffer A durch den Kanal, um jegliches nicht gebundene Strep-Din zu entfernen. Wie zuvor vermeiden Sie, Luftblasen in der Kammer einzuschließen. Schließlich leiten Sie eine Lösung mit drei bis fünf Pikomolar der biotinylierten Probe durch den Kanal.Um die Abdeckung der fluoreszierenden Moleküle zu überprüfen, wird ein Oberflächenscan durchgeführt. Inkubieren Sie die biotinylierte Probe 10 Minuten lang und wiederholen Sie anschließend den Pufferfluss. Wie zuvor gezeigt, besteht der Bildgebungs-Puffer (IB) aus einem enzymatischen Sauerstoff-Abbausystem und einem Triplett-Quencher wie Trol. Um den IB zunächst herzustellen, muss Trol gelöst werden.Fünf Milligramm Trol binden in 10 Milliliter Glucose-Puffer durch Vortexen für einige Minuten und Schütteln für mindestens 10 Minuten. Die Lösung filtrieren und 10 Minuten lang unter Vakuum entgasen lassen. Die TRO-Lock-Lösung vorsichtig mit der Glocky-enzymatischen Lösung mischen, wobei die Bildung von Luftblasen vermieden werden sollte.Füllen Sie das Reservoir mit der IB-Lösung. Steuern Sie dann mithilfe einer mechanischen Spritzenpumpe die Flussrate, indem Sie IB mit einer konstanten Geschwindigkeit von fünf Mikrolitern pro Minute durch den Kanal leiten, und blenden Sie Argongas in das IB-Reservoir ein, um zu verhindern, dass atmosphärischer Sauerstoff in den Puffer eindiffundiert. Das Oberflächen-Scanning, die Moleküllokalisation und die Aufnahme der Einzelmolekül-Intensitätssignale werden über das LabVIEW-Programm gesteuert, das 20 mal 20 Mikrometer quadratische Bereiche mit einer Auflösung von 0,2 Mikrometern und einer Geschwindigkeit von 0,1 Mikrometer pro Millisekunde abtastet.Die Daten aus dem Oberflächenscanning werden unmittelbar verarbeitet, um die intensitätsgewichteten Positionen aller Pixel oberhalb der Hintergrundzählimpulse zu ermitteln. Sobald die immobilisierten Moleküle gefunden sind, werden sie nacheinander in das konfokale Volumen bewegt, und die Intensitäten des Donor- und Akzeptorfluorophors werden als Funktion der Zeit aufgezeichnet, bis beide Fluorophore photobleichen. Anschließend wird der Messplatz so programmiert, dass er sich um 100 Millimeter zu einer neuen Ausgangsposition bewegt, und der Scanningvorgang wird wiederholt.Das zusammengesetzte MICROFLUID Excel wird hier gezeigt. Es handelt sich um Oberflächenabtastungen, die Einzelmoleküle in den grünen Donator- und roten Akzeptorkanälen darstellen. Einige typische Einzelmolekül-Spuren, die die Akzeptorintensität in Rot und den Donator in Grün zeigen, sind dargestellt.Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Einzelmolekül-Spuren von immobilisierten Biomolekülen mithilfe einer konfokalen Anordnung erhält. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, jeden Schritt sorgfältig und mit Bedacht auszuführen, da es sich um ein anspruchsvolles Experiment handelt. Das war's also.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

automated-system-for-single-molecule-fluorescence-measurements

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt Experimente mit anschließender Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch den Einsatz von Mikro-gemusterten Oberflächen. Der Ansatz bietet die Möglichkeit, Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen zu erkennen und verbindet hohe Durchsatz mit der Möglichkeit, quantitative Informationen zu extrahieren.

In-vivo-Detektion von Protein-Protein-Interaktionen auf Micro-gemusterten Oberflächen

Protein-Wechselwirkungen werden in Zellen mit räumlicher Auflösung im Nanometerbereich visualisiert, indem die bimolekulare Fluoreszenzkomplemmentierung (BiFC) mit der photoaktivierten Lokalisationsmikroskopie (PALM) kombiniert wird. Beschrieben wird hier die Verwendung von BiFC-PALM zur Abbildung von Ras-Raf-Wechselwirkungen in U2OS-Zellen zur Visualisierung des nanoskaligen Clusterings und der Diffusion einzelner Ras-Raf-Komplexe.

Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie mit Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BIFC-PALM)

Die Herstellung von proteinfunktionalisierten planaren glasgestützten Lipiddoppelschichten, die Bestimmung der Proteinmobilität innerhalb und die Messung von Proteindichten wird hier gezeigt. Es wird eine Roadmap zum Bau eines rauschreduzierten Totalreflexionsmikroskops skizziert, das die Visualisierung von in einzelnen Doppelschichten residenten Fluorochromen mit hoher raumzeitlicher Auflösung ermöglicht.

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

Wir stellen den Aufbau und das experimentelle Verfahren vor, um smFRET-Daten aus großen Donor-Akzeptor-Netzwerken mit einem TIRF-Mikroskop zu erhalten. Die Schritt-für-Schritt-Analyse dieser Messungen mit der Bayes'schen Inferenzsoftware Fast-NPS liefert durch die Anwendung angepasster Farbstoffmodelle hochaufgelöste Strukturinformationen.

Strukturelle Informationen vom Einzelmolekül-FRET-Experimente unter Verwendung des Fast Nano-Positionierungssystem

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur dreifarbigen SmFRET Daten und deren Auswertung mit einem 3D-Ensemble Hidden-Markov-Modell zu erhalten. Mit diesem Ansatz können Wissenschaftler kinetische Informationen aus komplexen Protein Systeme, einschließlich der Kooperativität oder korrelierte Interaktionen extrahieren.

Verwendung von dreifarbigen Einzelmolekül-Bund, die Korrelation von Protein-Interaktionen zu studieren

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Kennzeichnung Homogenität für jede Art von Protein in einer komplexen Protein-Probe auf der Einzelmolekül-Ebene zu bewerten.

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Dieser Artikel enthält Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Durchführung vollständig korrigierter genauer FRET-Messungen an einzelnen, frei streuenden Biomolekülen mit der quelloffenen, kostengünstigen smfBox, vom Einschalten über die Ausrichtung und Fokussierung bis hin zur Datenerfassung und -analyse.

Präzise und genaue Einzelmolekül-FRET-Messungen mit der Open-Source-smfBox

Dieser Artikel stellt eine Methode zur raumzeitlichen Analyse von mobilen, einzelmolekularen Förster-Resonanz-Energietransfer-basierten (smFRET)-basierten Sonden mittels Weitfeldfluoreszenzmikroskopie vor. Das neu entwickelte Software-Toolkit ermöglicht die Bestimmung von smFRET-Zeitspuren bewegter Sonden, einschließlich der korrekten FRET-Effizienz und der molekularen Positionen, als Funktionen der Zeit.

Automatisierte zweidimensionale raumzeitliche Analyse mobiler Einzelmolekül-FRET-Sonden

Hier wird ein Protokoll zur Durchführung und Analyse der Bindung, Mobilität und Assemblierung einzelner Moleküle auf künstlichen überfüllten Lipidmembranen unter Verwendung der Einzelmolekül-Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (smTIRF) vorgestellt.

Einzelmoleküldiffusion und Assemblierung auf polymerüberfüllten Lipidmembranen

Hier stellen wir das Protokoll vor, um die lokale Flexibilität und Dynamik von Biomolekülen unter Verwendung von zeitaufgelöster Fluoreszenzanisotropie auf Einzelmolekülebene im konfokalen Mikroskopiemodus zu untersuchen.

Zeitaufgelöste Fluoreszenzanisotropie von einzelnen Molekülen zur Charakterisierung der lokalen Flexibilität in Biomolekülen

Dieses Protokoll beschreibt die Single-Antibody-Markierung (SAL), um die nanoskalige räumliche Organisation von Plasmamembranproteinen zu klären. Durch die Nutzung kumulativer Antikörper-Epitope-Interaktionen auf Einzelmolekülebene kartiert Membran-SAL (mSAL) lokale Epitope-Verteilungen und erfasst gleichzeitig das Antikörperbindungsverhalten in der nativen zellulären Umgebung.

Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie von Membranproteinen mittels Einzel-Antikörper-Markierung

Erfahren Sie, wie Sie mit einem automatisierten konfokalen Mikroskop FRET-Spuren von einzelnen DNA-Molekülen auf einer Oberfläche erfassen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Nukleinsäuredynamiken und Enzyminteraktionen in Echtzeit.

Automated System für Single Molecule Fluorescence Messungen der Oberflächen-immobilisierten Biomoleküle

Weitere Videos entdecken