Automated System für Single Molecule Fluorescence Messungen der Oberflächen-immobilisierten Biomoleküle

Um die Dynamik einzelner Moleküle über einen längeren Zeitraum hinweg zu untersuchen, müssen die Moleküle zunächst räumlich lokalisiert werden. Dies erreichen wir, indem wir sie an der Oberfläche einer mikrofluidischen Zelle immobilisieren. Das Verfahren beginnt mit dem Zusammenbau der Zelle, die vier Kammern enthält, in denen die Biomoleküle fixiert werden.

Die Kammern sind über Einlass- und Auslasskapillaren mit der Umgebung verbunden. Die Zelle wird hergestellt, indem eine strukturierte PDMS-Scheibe mit einem Quarzdeckglas verschmolzen wird. Die zusammengesetzte Zelle wird anschließend auf dem Fluoreszenzmikroskop montiert, und flexible Schläuche werden an die Kapillaren angeschlossen, um einen einfachen Lösungsaustausch durch die Kammern zu ermöglichen, um zunächst die Oberfläche zur Immobilisierung von Molekülen zu aktivieren, gefolgt von einem Durchfluss einer Lösung von biotinyliertem BSA durch einen der Kanäle.

BSA bindet an die Kammeroberfläche. Anschließend leitet man eine Streptavidin-Lösung durch, die sich an das Biotin bindet. Schließlich führt man das biotinylierte Oligonukleotid zu, das an das Streptavidin bindet und somit das Molekül der Untersuchung an der Oberfläche des Quarz-Deckgläschens verankert.

Ein Bildpuffer, der so konzipiert ist, dass die Stabilität und Intensität der Fluorofare über die gesamte Aufnahmedauer maximiert wird, strömt während des gesamten Akquisitionszeitraums mit konstanter Rate durch die Kammer. Die automatisierte Anordnung scannt verschiedene Bereiche der Oberfläche nach Molekülen mit Donor- und Akzeptor-Fluorofaren ab und bewegt diese nacheinander in das Untersuchungsvolumen, wobei für jedes Molekül eine zeitliche Fluoreszenzintensitätskurve aufgezeichnet wird, bis beide Fluorofare photobleichen. Hallo, ich bin Nicholas Dfi aus dem Labor von Professor Miller am Fachbereich Biomedizinische Technik der Boston University.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, um Einzelmolekül-F-Spektren von immobilisierten Nukleinsäuren mithilfe einer konfokalen Anordnung zu erhalten. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Dynamik von Nukleinsäuren sowie Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäuren und Enzymen zu untersuchen. Beginnen wir also.

Der Microfluid-Excel wird hergestellt, indem eine strukturierte, zwei Millimeter dicke Scheibe aus Polydimethylsiloxan oder PDMS mit einem frisch gereinigten Quarzdeckglas verbunden wird. Um die strukturierte PDMS-Scheibe herzustellen, mischen Sie 10 Teile Silikonelastomer-Grundmasse mit einem Teil Härter, verrühren gründlich und entgasen eine Stunde im Vakuum. Nachdem die Elastomer-Grundmasse entgast wurde, gießen Sie sie vorsichtig in die Mikrofluidik-Zellform.

Lassen Sie die Elastomermischung zwei Stunden lang auf einer Heizplatte bei 70 Grad Celsius aushärten. Nach dem Aushärten die PDMS-Scheibe vorsichtig mit einem Rasiermesser von der Form ablösen. Die PDMS-Scheibe enthält vier rechteckige Kammern mit je 30 Mikrolitern.

Verbinden Sie die flache Seite der PDMS-Scheibe, also die Seite ohne Kanäle, durch Plasmabehandlung beider Oberflächen für 30 Sekunden mit einem einen Zoll großen Glasfenster. Das Glasfenster enthält an beiden Enden der Kanäle zuvor gebohrte zwei Millimeter große Löcher. Anschließend wird durch jedes Loch im Glasfenster ein zwei Zoll langes, flexibles Kapillarrohr aus Quarzglas eingeführt.

Führen Sie zuerst eine Nadel ein und schieben Sie dann das Kapillarrohr ein, bis es den Kanal erreicht. Versiegeln Sie die Öffnungen im Glasfenster mit einer schnell aushärtenden Silikon-Gussmasse, beispielsweise Quick Cast. Spülen Sie die Kanäle mit Ethanol und Wasser aus, nachdem Sie die Zelle und eine frisch mit Piranha-Reinigungsmittel behandelte kreisförmige Quarzdeckglasplatte von einem Zoll Durchmesser 30 Sekunden lang plasmabehandelt haben.

Verbinden Sie den Deckglaser mit der Seite der Zelle, die die Kanäle enthält. Die Kammern sind nun versiegelt. Lassen Sie die montierte Zelle über Nacht bei Raumtemperatur aushärten.

Nachdem das zusammengebaute Mikrofluid-Excel über Nacht ausgehärtet ist, wird es in einen speziell angefertigten Halter eingesetzt und auf dem Objekttisch des konfokalen Mikroskops befestigt, um die Aktivierung der Zelloberfläche zu beginnen. Zum Immobilisieren von Molekülen verbinden Sie flexibles Schlauchmaterial mit den Kapillaren der Zelle, um die Injektion von Puffer mittels einer Spritze und einer Nadel zu ermöglichen. Injizieren Sie nun eine Lösung von 0,1 Milligramm pro Milliliter biotinyliertem BSA in Puffer A in den Kanal und inkubieren Sie mindestens 30 Minuten lang.

Nach der 30-minütigen Inkubationsphase fließen 300 bis 500 Mikroliter Puffer A durch den Kanal, um nicht gebundenes biotinyliertes BSA aus dem Kanal zu entfernen. Achten Sie darauf, keine Luftblasen in der Kammer einzuschließen. Anschließend geben Sie eine Lösung mit 0,1 Milligramm pro Milliliter STR-Din in Puffer A in den Kanal und inkubieren 15 Minuten lang.

Nach der 15-minütigen Inkubationsphase fließen 300 bis 500 Mikroliter Puffer A durch den Kanal, um jegliches nicht gebundene Strep-Din zu entfernen. Wie zuvor vermeiden Sie, Luftblasen in der Kammer einzuschließen. Schließlich leiten Sie eine Lösung mit drei bis fünf Pikomolar der biotinylierten Probe durch den Kanal.

Um die Abdeckung der fluoreszierenden Moleküle zu überprüfen, wird ein Oberflächenscan durchgeführt. Inkubieren Sie die biotinylierte Probe 10 Minuten lang und wiederholen Sie anschließend den Pufferfluss. Wie zuvor gezeigt, besteht der Bildgebungs-Puffer (IB) aus einem enzymatischen Sauerstoff-Abbausystem und einem Triplett-Quencher wie Trol. Um den IB zunächst herzustellen, muss Trol gelöst werden.

Fünf Milligramm Trol binden in 10 Milliliter Glucose-Puffer durch Vortexen für einige Minuten und Schütteln für mindestens 10 Minuten. Die Lösung filtrieren und 10 Minuten lang unter Vakuum entgasen lassen. Die TRO-Lock-Lösung vorsichtig mit der Glocky-enzymatischen Lösung mischen, wobei die Bildung von Luftblasen vermieden werden sollte.

Füllen Sie das Reservoir mit der IB-Lösung. Steuern Sie dann mithilfe einer mechanischen Spritzenpumpe die Flussrate, indem Sie IB mit einer konstanten Geschwindigkeit von fünf Mikrolitern pro Minute durch den Kanal leiten, und blenden Sie Argongas in das IB-Reservoir ein, um zu verhindern, dass atmosphärischer Sauerstoff in den Puffer eindiffundiert. Das Oberflächen-Scanning, die Moleküllokalisation und die Aufnahme der Einzelmolekül-Intensitätssignale werden über das LabVIEW-Programm gesteuert, das 20 mal 20 Mikrometer quadratische Bereiche mit einer Auflösung von 0,2 Mikrometern und einer Geschwindigkeit von 0,1 Mikrometer pro Millisekunde abtastet.

Die Daten aus dem Oberflächenscanning werden unmittelbar verarbeitet, um die intensitätsgewichteten Positionen aller Pixel oberhalb der Hintergrundzählimpulse zu ermitteln. Sobald die immobilisierten Moleküle gefunden sind, werden sie nacheinander in das konfokale Volumen bewegt, und die Intensitäten des Donor- und Akzeptorfluorophors werden als Funktion der Zeit aufgezeichnet, bis beide Fluorophore photobleichen. Anschließend wird der Messplatz so programmiert, dass er sich um 100 Millimeter zu einer neuen Ausgangsposition bewegt, und der Scanningvorgang wird wiederholt.

Das zusammengesetzte MICROFLUID Excel wird hier gezeigt. Es handelt sich um Oberflächenabtastungen, die Einzelmoleküle in den grünen Donator- und roten Akzeptorkanälen darstellen. Einige typische Einzelmolekül-Spuren, die die Akzeptorintensität in Rot und den Donator in Grün zeigen, sind dargestellt.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Einzelmolekül-Spuren von immobilisierten Biomolekülen mithilfe einer konfokalen Anordnung erhält. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, jeden Schritt sorgfältig und mit Bedacht auszuführen, da es sich um ein anspruchsvolles Experiment handelt. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.