Name: Die Verwendung von SC1 (Pluripotin) zu MESC Self-Erneuerung in der Abwesenheit von LIF-Support (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-18T17:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Lernen Sie die Kultivierung von Maus-Embryonalstammzellen mit SC1 als kostengünstige Alternative zu LIF. Diese Methode ermöglicht die Aufrechterhaltung der Selbsterneuerung und Pluripotenz.

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Die Autoren möchten Dr. Sheng Ding vom Scripps Research Institute und Dr. Hongkui Deng von der Peking-Universität für ihre Unterstützung und die Richtung zu danken.

1. Vorbereitung der MEF Feeder-Platten <ol><li> Einen Tag vor Kultivierung ES-Zellen, Tauwetter ein Fläschchen von bestrahlten E14.5 CF-1 MEF Feeder-Zellen (siehe unsere Vorgehensweise zum ES-Zellen auftauen). </li><li> Platte der MEF Feeder-Zellen bei einer Dichte von 10.000 Zellen / Well in einer 12-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2. MEF Zellen Medien: DMEM mit 10% ES-PBS, 1X Glutamin und 1X nicht-essentiellen Aminosäuren ergänzt. </li></ol> 2. Wartung von Self-Erneuerung der Maus ES-Zellen <ol><li> Lösen Sie die ES-Zellen unter Verwendung von Trypsin. Seed die Zellen bei einer Dichte von 50.000 Zellen / well auf die zuvor vorbereiteten MEF Feeder-Platten in Nährmedien (Knockout MEM mit 15% KSR, 4 mM L-Glutamin, 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren und 1X BME ergänzt) mit SC1 ergänzt in der gewünschten Konzentration (wir haben 100 nM, 300 nM und 1 pM). Außerdem haben wir eine positive Kontrolle gut, dass mit 1000 μ / ml LIF ergänzt wurde. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Kultur der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 3-4 Tage in jedem Durchgang. Refresh Medien alle 48 Stunden. </li><li> Passage-Zellen von 1.10 bis 01.15 Uhr mit Trypsin ein ähnlicher Dichte wie die erste Aussaatdichte aufrecht zu erhalten. Nach 5 Passagen, können die Zellen auf die Expression von typischen Pluripotenz Marker mit Immunzytochemie untersucht werden. </li></ol> 3. Immunzytochemische Untersuchung der Pluripotenz Markers <ol><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit PBS. </li><li> Fix die Zellen mit 500 ul Fixativ für 20 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit PBS. </li><li> Block unspezifische Bindung mit 500 ul Blockierungspuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen mit 250 ul des spezifischen primären Antikörper (wir Nanog, Sox2, SSEA1 und Oct4 bei den folgenden Verdünnungen: 1:500, 1:2000, 1:500 und 1:500) </li><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit PBS. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen mit 250 ul des sekundären Antikörper für 2 Stunden bei Raumtemperatur, hielten sich fern von Licht (wir haben Esel anti-Maus konjugiert mit Alexa Fluor ® 555 bei 1:2000 und Esel-anti-Kaninchen konjugiert mit Alexa Fluor ® 488 bei 1 : 2000). </li><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit PBS. </li><li> Add DAPI (Endkonzentration 1 pg / ml) auf dem letzten Waschen und Inkubation 5 Minuten, um Kerne zu visualisieren. </li><li> Analysieren Sie die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: 1. Morphologie Ergebnisse: Maus ES-Zellen (ESC R1) wurden am MEF Feeder-Zellen in Anwesenheit von entweder LIF oder SC1 gewachsen zu Selbst-Erneuerung in einem undifferenzierten Zustand halten. Nach dem zweiten Durchgang konnte die Differenzierung in Zellen ohne LIF oder SC1 (negative Kontrolle) beobachtet werden und nach 5 Passagen im Wesentlichen keine undifferenzierte Kolonien beobachtet wurden. LIF (positive Kontrolle) behandelt Kolonien blieb in einem undifferenzierten Zustand in den 5 Zellpassagen. Zellen, die mit SC1 in Konzentrationen von 300 nM oder 100 nM behandelt blieb auch nach 5 Passagen undifferenziert, aber die Zellen mit 1 uM SC1 erfahrenen Zelltod nach dem vierten Durchgang behandelt. (Bild 2 von app beachten) Tabelle 1 fasst die morphologische Beobachtungen. 2. Expression der Pluripotenz Markers Maus ES-Zellen für 5 Passagen beibehalten wurden fixiert und untersucht durch Immunzytochemie für SSEA1, Oct4, Nanog und Sox2. Marker-Expression wurde ähnlich wie Zellen in LIF erhalten. (Abb. 3 und 4 des app beachten) <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2a.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Morphologie Vergleich von Zellen in LIF oder SC1 gepflegt. Kein Unterschied in der Morphologie beobachtet. <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2c.jpg" alt="Abbildung 2 und 3" /> Abbildung 2 und Abbildung 3: Nanog, SSEA1, Sox2 und Oct4 Färbung von ES-Zellen mit SC1 oder LIF (Abb. 4 von ca. beachten) gepflegt. Cells in SC1 gepflegt zeigen ähnliche Pluripotenz-Marker zum Ausdruck Zellen in LIF erhalten. Tabelle 1 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> Negative Control </td><td> LIF Positive Control </td><td> SC1 1um </td><td> SC1 300 nM </td><td> SC1 100 nM </td></tr><tr><td> 1. Besuch </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td></tr><tr><td> 2. Passage </td><td> Einige differenzierte Morphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td></tr><tr><td> 3. Passage </td><td> Mehrzahl der Zellen differenziert </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td></tr><tr><td> 4. Passage </td><td> Kein ESC Kolonien </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Der Zelltod beobachtet </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td></tr><tr><td> 5th Passage </td><td> differenziert </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Der Zelltod beobachtet </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li>
<li>Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453, 519-523 (2008).</li>
<li>Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+embryonic+stem+cells+by+a+small+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acat.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule.</a> Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).</li>
</ol>

Die Autoren dieses Artikels sind bei Stemgent angestellt, einem Unternehmen, das Reagenzien und Geräte herstellt, die in diesem Artikel verwendet werden.

Das kleine Molekül SC1 kann zur Selbst-Erneuerung mit einem undifferenzierten Zustand in Maus-ES-Zellen zu erhalten. Vor dem Einsatz auf einer ungeprüften Zelllinie, jedoch sollte es titriert auf die optimale Konzentration zu bestimmen. Zum Beispiel, testeten wir drei Konzentrationen auf der Maus-ES-Zelllinie ESC R1. 100 nM und 300 nM Konzentrationen konnten Maus-ES-Zellen zu erhalten, war jedoch ein 1 pM Konzentration giftig. SC1 kann auch unter Feeder-freien Bedingungen verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>SC1</td><td>Stemgent</td><td>04-0011</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-1-Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>21702</td><td></td></tr><tr><td>Nanog-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab21603</td><td></td></tr><tr><td>Sox2-Antikörper</td><td>Chemicon International</td><td>Ab5603</td><td></td></tr><tr><td>Oct4-Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-5279</td><td></td></tr></tbody></table>

die verwendung von sc1 (pluripotin) zu mesc self-erneuerung in der abwesenheit von lif-support

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Maus embryonale Stammzellen (ES-Zellen) sind konventionell mit Leukämie Inhibitory Factor (LIF), um sich selbst zu erneuern pflegen kultiviert.<sup&gt; 1</sup&gt; Allerdings ist LIF teuer und Aktivierung der LIF/JAK/STAT3 Weg ist nicht unbedingt erforderlich, um die Selbst-Erneuerung Zustand zu halten.<sup&gt; 2</sup&gt; Die SC1 kleine Molekül kann eine kostengünstige Alternative zu LIF werden. SC1 Funktionen durch duale Hemmung des Ras-GAP und ERK1.<sup&gt; 3</sup&gt; Illustration seines Wirkmechanismus macht ihn zu einem nützlichen Werkzeug, um die grundlegenden molekularen Mechanismen der Selbst-Erneuerung zu studieren. Hier zeigen wir das Verfahren zur Kultivierung von Maus-ES-Zellen in Anwesenheit von SC1 und zeigen, dass sie in der Lage, sich selbst zu erneuern in der Abwesenheit von LIF zu halten sind. Zellen, die mit SC1 kultivierten zeigten ähnliche Morphologie im Vergleich zu Zellen mit LIF erhalten. Beide zeigten typische Maus-ES-Morphologie nach fünf Durchgängen. Expression von typischen Pluripotenz-Marker (Oct4, Sox2, Nanog und SSEA1) wurde nach fünf Durchgängen in Gegenwart von SC1 beobachtet. Darüber hinaus verursacht SC1 keine offenkundige Toxizität bei Maus-ES-Zellen.

SC1 Funktionen durch duale Hemmung des Ras-GAP und ERK1. Wir testeten die Funktion von SC1 in Unterstützung von Maus ES-Zell-Selbst-Erneuerung in der Abwesenheit von LIF und zeigte, dass SC1 in der Lage, sich selbst zu erneuern von Maus-ES-Zellkulturen zu halten ist.

Die Verwendung von SC1 (Pluripotin) zu MESC Self-Erneuerung in der Abwesenheit von LIF-Support

Maus-embryonale Stammzellen (ES-Zellen) werden konventionell mit dem Leukemia Inhibitory Factor (LIF) kultiviert, um die Selbsterneuerung aufrechtzuerhalten.1 LIF ist jedoch teuer und ...

Hallo, ich bin Sarah NAU am STEM Gen Labor in Boston. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Aufrechterhaltung der Selbsterneuerung von embryonalen Stammzellen der Maus in Gegenwart des kleinen Moleküls C1-Mouse. Embryonale Stammzellen werden normalerweise in Gegenwart von Leukämie-Hemmfaktor kultiviert, um die Selbsterneuerung aufrechtzuerhalten.L ist jedoch teuer. Daher stellen wir hier eine kostengünstige Alternative vor, das kleine Molekül SC one. Im letzten Teil des Videos zeigen wir Ihnen einen Vergleich der Expression von Pluripotenzmarkern zwischen in L kultivierten Zellen und solchen, die in SC one kultiviert wurden.Beginnen wir also. Einen Tag vor der Kultivierung der embryonalen Stammzellen tauen Sie eine Probe bestrahlter Fütterungszellen auf. Säen Sie die Fütterungszellen mit einer Dichte von 10.000 Zellen pro Vertiefung aus.In einer 12-Loch-Platte die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Am nächsten Tag die ES-Zellen auf der MEF-Futtererschicht ausplattieren, wobei die Zellen mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro Vertiefung auf die vorbereiteten Futtererplatten gesät werden, in Wachstumsmedium, das mit SC1 in der gewünschten Konzentration ergänzt ist; wir verwendeten 100 Nanomolar, 300 Nanomolar und 1 Mikromolar.Als Kontrolle fügen wir eine Vertiefung hinzu, der 1000 Mikrogramm pro Milliliter LIF zugesetzt wurde. Inkubieren Sie die Zellen nun über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.Am nächsten Tag erneuern Sie das Medium für die kontinuierliche Kultivierung. Ersetzen Sie das Medium alle 48 Stunden und passagieren Sie die Zellen im Verhältnis 1:10 alle drei bis vier Tage, um eine ähnliche Dichte wie die anfängliche Aussaatdichte beizubehalten. Nach fünf Passagen können wir nun die Expression typischer Pluripotenzmarker mittels Immunchemie überprüfen, um die Immunchemie von Stammzellen zu beginnen.Spülen Sie die Zellen zunächst vorsichtig dreimal mit PBS. Fixieren Sie die Zellen mit 500 µL 4 % Paraformaldehyd für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die Zellen erneut dreimal mit PBS gewaschen haben, blockieren Sie die unspezifische Bindung mit 500 µL Blockpuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur.Fügen Sie anschließend 250 Mikroliter des primären Antikörpers zu den Zellen hinzu und lassen Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. In diesem Experiment erfolgt die Inkubation mit den Antikörpern nano SOX zwei, SSEA eins und OCT vier. Nach einer weiteren Waschserie inkubieren Sie die Zellen zwei Stunden lang bei Raumtemperatur mit 250 Mikrolitern des mit einem fluoreszierenden Farbstoff konjugierten sekundären Antikörpers, wobei Sie die Proben vor Licht schützen. Waschen Sie die Zellen abschließend ein letztes Mal und geben Sie DAPI in einer Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter in die letzte Waschung.Anschießend die Zellen fünf Minuten lang inkubieren, um die Kerne anzufärben. Schließlich die Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop analysieren. Gezeigt sind hier Auflichtaufnahmen von mausischen ES-Zellen, die in Gegenwart von entweder LIF oder SC1 auf Futterzellen kultiviert wurden, um die Selbsterneuerung im undifferenzierten Zustand aufrechtzuerhalten.Hier sind Maus-ES-Zellen dargestellt, die über fünf Passagen hinweg kultiviert wurden. Die Zellen wurden fixiert und mittels Immunzytochemie auf SSEA-1, OCT4, Nanog und SOX2 untersucht. Die Markerexpression von Zellen, die in C1 kultiviert wurden, war vergleichbar mit der von Zellen, die in LIF kultiviert wurden.Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man das niedermolekulare Molekül SC one verwendet, um die Selbsterneuerung in embryonalen Stammzellen der Maus aufrechtzuerhalten. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass SC one titriert werden sollte, um die optimale Konzentration zu bestimmen, bevor es an einer noch nicht getesteten Zelllinie eingesetzt wird. Damit ist alles gesagt.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben einen Fluoreszenz-Reporter-Assay schnell zu identifizieren und zu charakterisieren, Gene, die Maus embryonalen Stammzellen Wartungs-und Selbst-Erneuerung zu regulieren.

Oct4GiP Reporter Assay auf Gene, die Maus embryonalen Stammzellen Wartungs-und Self-Study Erneuerung Regulate

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Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für die effiziente, Bulk und schnelle chemische Rückfall von konventionellen Linie grundiert menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSC) in einen Epigenomically-Stall naiv Präimplantations Epiblast-ähnliche pluripotenten Zustand. Diese Methode ergibt verringerte Abstammung grundiert Genexpression und deutliche Verbesserung der gerichteten multilineage Differenzierung über ein breites Repertoire von konventionellen hPSC Linien.

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Lernen Sie die Kultivierung von Maus-Embryonalstammzellen mit SC1 als kostengünstige Alternative zu LIF. Diese Methode ermöglicht die Aufrechterhaltung der Selbsterneuerung und Pluripotenz.

Die Verwendung von SC1 (Pluripotin) zu MESC Self-Erneuerung in der Abwesenheit von LIF-Support

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