Name: Methoden zur Untersuchung des Zebrafisch Maxillary Barbel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-23T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Lernen Sie die chirurgische Amputation und Regeneration des maxillären Bartels bei Danio rerio. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Zelltypen und regenerativen Mechanismen in vivo.

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Diese Methoden wurden von EEL während eines Forschungsaufenthaltes verlassen im Labor von JT-Unterstützung durch die DePaul University Research Council und ein NIH / NIDCR R01 Zuschuss an JT (DE016678) zur Verfügung gestellt wurde entwickelt. Wir danken für die Bemühungen von Caroline Hunter, Tierpflege-Techniker in der CMRC Zebrafisch Core Facility und Paulina Pawluczuk, unsere Studenten Laborantin.

Zebrafisch Tierhaltung Zebrafische sind untergebracht und nach der Norm Methoden 1 aufgezogen. Vorbei am späten Larvenstadien Frist kann der Entwicklungsstand eines Zebrafisch durch seine Standard-Länge (SL), oder die gerade Linie in Millimetern von der vordersten Punkt der Oberlippe an der Basis der Schwanzflosse (posteriormost hypural Platte) gemessen werden 2. Bei ca. 1 Monat nach der Befruchtung (10-12 mm SL), erscheinen die Nasen-und Kieferhöhle Barben als transparent epithelialen Knospen in der Nähe des Riechgruben und auf den hinteren Ecken des Oberkiefers bzw.. Da der Zebrafisch reift, erstrecken sich die Barben in schmale, whisker Fortsätzen. Da die oberen Barbe ist größer (2-3 mm) und leichter zu manipulieren, gilt unser Protokoll nur für diese besondere Anhängsel; ähnliche Techniken konnte jedoch zu den kleineren nasalen Barben angepasst werden. Barbel Clipping <ol><li> Betäuben erwachsenen Zebrafisch auf die gewünschte Stufe (z. B.., 1,5-2,5 cm SL, ~ 3-6 Monate nach der Befruchtung) durch Eintauchen in 0,015% MS-222 (Ethyl-3-Aminobenzoesäure Methansulfonat) gepuffert auf pH 7,0 im System Wasser. Beachten Sie, bis schwimmen Bewegungen zu stoppen und gill Belüftung wird langsam und regelmäßig. Je nach Größe der Fische, nimmt Vollnarkose ca. 2-5 Minuten. </li><li> Mit einem Aquarium Fischnetz, Transfer 1-3 Fische auf einmal zu einem gefalteten Stück nassen Papiertuch in einer Petrischale. Mit einem stumpfen Spatel, orientieren die Fische, so dass sie parallel zueinander und linken lateralen Seite bis sind. Falten Sie ein Teil der nassen Papiertuch über den hinteren Teil der Fische, die den gesamten Körper bis zum Operculum (Kiemendeckel), um die Haut und Kiemen feucht während des Verfahrens. </li><li> Sehen Sie sich die Petrischale unter dem Stereomikroskop, mit geringem Winkel einfallende Licht auf den Kopf zu beleuchten. Konzentrieren Sie sich auf der Basis der linken Oberkiefer-Barbe, die von der hinteren ventralen Ecke des Oberkiefers (Abb. 1) ragt. <img src="/files/ftp_upload/1558/1558fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. </li><li> Dicht erfassen die Welle der Barbe leicht distal an den Rand des Oberkiefers. Elevate die Barbe Welle und legen Sie die Backen einer spitzen Feder Schere genau proximal der Pinzette. Die Schere kann die Zange für die Stabilität berührt werden. Schieben Sie die Backen der Schere entlang der Welle der Barbe, bis die Schneide nähert sich der Rand des Oberkiefers. Schließen Sie die Schere durch die Barbe Welle geschnitten. Die amputiert Barbe, noch griff in die Zange, kann zur Fixierung oder weitere Beobachtung entfernt werden. </li><li> Sofort überweisen Sie den Fisch auf einem kleinen Tank mit sauberem Wasser System (~ 500 ml) enthält einen Tropfen Methylenblau zu oberflächliche Pilzinfektion zu kontrollieren. Lassen Sie den Fisch über Nacht erholen. Am nächsten Morgen kehren die Fische, die Aufzucht-System. Barbel Regeneration nach 2 Wochen maximal. </li></ol> Agar Einbettung von Matched Pairs Barbel <ol><li> Sammeln Sie Fische durch geeignete Euthanasie Technik und fix in einem 50 ml-Röhrchen mit 4% Paraformaldehyd-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) unter Rühren bei 4 ° C über Nacht. Die Fixierlösung sollte mindestens das Zehnfache des Volumens des Gewebes werden. Nach der Fixierung von Paraformaldehyd Abfälle in einer zugelassenen Behälter und spülen Sie das Gewebe gründlich in mehrere Änderungen der PBS. </li><li> Bereiten Sie sich in einem 250 ml-Glasflasche 150 ml 2% Agarose (T m ~ 37 ° C) in destilliertem Wasser. Hitze mit einer Mikrowelle oder Heizplatte, Rühren in regelmäßigen Abständen, bis sie vollständig aufgelöst. Äquilibrieren das geschmolzene Lösung in einem 50-60 ° C Wasserbad. </li><li> Bauen Sie ein Standard-Gel-Elektrophorese rig, indem Sie einen kleinen gedichtete Gelform (10 x 10 cm; ~ 100 mL Gelvolumen) fest gegen die Seiten der Pufferkammer. Fügen Sie 2-4 kleinen Zähnen Probe Kämme (4 x 1,5 mm). </li><li> Auf einer ebenen Fläche, gießen Sie die geschmolzene Agarose in die Form gerade bedeckt die Basis der Waben bilden sehr seichten Brunnen. Sofort setzen die übrig gebliebenen Agarose zurück in den warmen Wasserbad, das wird später verwendet werden, um das Gewebe (Schritte 9-12) einbinden. Legen Sie ein langes Glas Pasteur Pipette in den Kolben der Pipette auf die gleiche Temperatur wie die Agarose zu halten. </li><li> Lassen Sie das Gel zu härten für 20-30 Minuten. Entfernen Sie die Kämme, entfernen Sie dann das Gel enthaltende Form der gehärteten Gel aus der Pufferkammer. Fest Band die offenen Seiten des Gels Form mit Labor-Band so das Gel nicht rutscht aus. Diese Band sollte einige Millimeter über der Oberfläche der Agarose zu verlängern, so dass zusätzliche Agarose später hinzugefügt werden können (Schritt 13). </li><li> Positionieren Sie die Gelform auf der Bühne ein Stereomikroskop. Magnify einen leeren Brunnen und bringen die Kanten in den Fokus. </li><li> Auf die Oberfläche der Agarose neben dem gut, einen Tropfen von Wasser oder Puffer, der den festen Barben Proben (zB, regenerieren und Kontrolle). Using gebogen Insektennadeln, ziehen Sie den feuchten Proben in den Brunnen und schieben Sie sie nach unten. Orient die Barbe Wellen parallel zueinander ausgerichtet und an gegenüberliegenden langen Kanten des Brunnens. Die Oberflächenspannung wird dazu beitragen, halten das Gewebe in Position. </li><li> Wenn Sie bereit sind zu verankern, mit einem feinen Pipettenspitze oder die Ecke eines Labors Gewebe, um überschüssige Flüssigkeit aus dem Brunnen zu entfernen. Arbeiten Sie schnell, um nicht zu lassen, das Gewebe austrocknen. </li><li> Mit der erwärmten Glas Pasteur Pipette vorsichtig Pipette frisch geschmolzene Agarose in und um die Proben zu den Barben Gewebe an Stelle abzudichten. Nicht überfüllen. Bevor die Agarose erhärtet, machen Last-Minute-Korrekturen mit dem Insekt Pins. </li><li> Legen Sie eine nummerierte Papier Probe Etikett neben dem Brunnen und sichern Sie sie mit einem kleinen Tropfen Agarose. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 6 bis 10 für jede Vertiefung der Proben. </li><li> Wenn für die Bild-Kalibrierung gewünscht, legen Sie ein Blatt Papier mit einem gedruckten Mikrometerbereich (zB <a href="http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/">http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/</a> ) in den Boden eines leeren Brunnen. Streichen Sie das Papier auf den Boden des Brunnens und decken Sie es mit warmen Agarose. </li><li> Nachdem alle Proben eingebettet sind, wird die Oberfläche des Gels werden unregelmäßig, mit gehärteter Tropfen Agarose. Legen Sie das Gel auf eine ebene Fläche und sanft in zusätzliche geschmolzener Agarose pour bis die Oberfläche gleichmäßig ist. Verwenden Sie die kleinste Menge an Agarose notwendig, um eine glatte Oberfläche zu erhalten, zu viel Agarose wird Durchlicht-Fotografie im Dunkeln. Lassen Sie diese oberste Schicht zu härten. </li><li> Das Gel kann nun auf der Bühne ein Stereomikroskop auf grobe Morphologie für jede Barbe Paar Rekord fotografiert werden. Bild Kalibrierung durch Fotografieren der embedded Mikrometerbereich erreicht. </li><li> Das ganze Gel gespeichert eingewickelt in feuchte Papiertücher und versiegelt in einem Plastikbeutel bei 4 ° C für mehrere Wochen. </li><li> Zur weiteren Analyse können Agar Blöcke mit zwei gepaarten Barben aus dem Gel geschnitten werden mit einem Skalpell oder einer Rasierklinge und verarbeitet Paraffin Histologie oder Kryoschneiden nach Standardmethoden 3,4. Alternativ können einzelne Barben aus der Agarose seziert werden mit feinen Nadeln, in Wasser gespült, und verarbeitet für andere Downstream-Anwendungen (zB ganze-mount Immunhistochemie oder die konfokale Mikroskopie). </li></ol>

<ol><li>Westerfield, M. Chapter 1 General Methods for Zebrafish Care. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Howe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+length%3A+Not+quite+so+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Fisheries+Research+%28Amsterdam%29%22%5BJournal%5D)">Standard length: Not quite so standard.</a> Fisheries Research (Amsterdam). 56, 1-7 (2002).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+Embedding+Tissue+Samples+for+Sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 6, (2008).</li>
<li>Westerfield, M. Ch 8.3 Agar Embedding for Cryostat Sectioning of Embryos or Larvae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Hansen, A., Reutter, K., Zeiske, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+bud+development+in+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Taste bud development in the zebrafish, Danio rerio.</a> Dev Dyn. 223, 483-496 (2002).</li>
</ol>

Der Zebrafisch Oberkiefer Barbe ist eine nicht ausgelastete Gewebe für die Untersuchung des Wachstums, Wartung und Erneuerung von mehreren Zelltypen im Zebrafisch. Obwohl die Barbe Anhängsel hat kein Mensch analog, sind die Zelltypen enthält hoch konserviert, die es ermöglichen, Haut, Drüsen, Melanozyten, Kreislauf-Gefäße und Nerven in eine optisch klare und anatomisch einfachen zylindrischen Struktur zu studieren. Ähnlich wie bei den gut untersuchten Schwanzflosse kann Barben Gewebe induziert durch Amputation zu regenerieren. Mit der Grenze des Ober-als anatomische Landmarke, kann die Amputation Flugzeug genau platziert werden, die Messung der Barbe Nachwachsen. Für einen erfahrenen Operateur nimmt jeder Operation nur ein paar Sekunden. Recovery ist schnell, und wir haben bisher keine kurz-oder langfristige Auswirkungen auf Fische Verhalten erkannt. Zebrafisch mit einem Ober-Barben schwimmen, essen und Rasse so effektiv wie nicht-chirurgischen Kontrollen und haben vergleichbare Überlebensrate bis zum Zeitpunkt der Gewebe Sammlung, bis zu 6 Monate nach der Operation. Die physiologische Wirkung dieser Operation voraussichtlich minimal sein, weil 1) die extraorale Geschmacksknospen auf der Barbe durchgeführt auch auf vielen anderen Teilen der Fisch Epithel, einschließlich der Lippen, Wangen und Kopf 5 gefunden werden, und 2) unterscheiden Gaumen erscheinen auf die regenerierende Barben innerhalb von 72 Stunden (LeClair et al., unveröffentlichte Daten). Das macht die Ober-Barbe ein minimal-invasives System zur Untersuchung der Wundheilung, Revaskularisation und Reinnervation im Rahmen eines erwachsenen Wirbeltieren. Nach der chirurgischen Induktion von Regeneration, kann Barben in Abständen für morphometrische Messung und / oder mikroskopische Analyse von fixiertem Gewebe gesammelt werden. Praktischerweise ist der Oberkiefer Barben etwa die Länge (2-3 mm) und Durchmesser (100-200 mm) eines Zebrafisch-Embryos, die Erleichterung der Anwendung von vielen Standard-Protokollen, einschließlich Paraffin Histologie, Kryoschneiden, ganze-mount Immunhistochemie und in situ Hybridisierung. Zusammen genommen machen diese Features die oberen Barben ein sehr machbar in vivo Modell für die Untersuchung die Reparatur von Gewebe und Regeneration.

Mikroskop Ausstattung Ein Stereo-Binokular mit Durchlicht und Vorfall Glasfaser-Beleuchtung ist für Barben Clipping und Agar Einbettung erforderlich. Barbel Clipping <ul><li> Fisch System Wasser </li><li> 2 Zebrafisch Kreuzung Tanks </li><li> MS-222 (Ethyl-3-Aminobenzoesäure Methansulfonat; Sigma Chemical # E10521-10G) </li><li> sterile 120-mm Petrischale </li><li> nasse Papiertücher </li><li> stumpfen Spatel </li><li> Dumont Nr. 55 Bio Inox Pinzette (Fine Science Tools # 11255-20) </li><li> Mini-Vannas Frühjahr Schere (Fine Science Tools # 15000-00) </li><li> Methylenblau Antimykotikum (Drs. Foster &amp; Smith # CD-905781) </li><li> kleines Aquarium fishnet </li></ul> Tissue-Sammlung und Agar Einbettung <ul><li> 4% Paraformaldehyd in 1x Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PF-PBS), aliquotiert in 50 ml konische Röhrchen und bei -20 ° C bis zur Verwendung </li><li> 1x Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,27 bis 6) </li><li> 250 ml Glasflasche </li><li> 2% Agarose in destilliertem Wasser </li><li> Standard klein Agarosegelelektrophorese rig (Gel size = ~ 10 cm im Quadrat) </li><li> kleinen Zähnen Elektrophorese-Kamm (Kamm Größe 4 x 1,5 mm) </li><li> warmen Wasserbad (50-60 ° C) </li><li> Labor-Band </li><li> schwarz emailliert Insektennadeln, Größe 000 (Fein Science Tools # 26000-25) </li><li> 1-2 Pin-Halter (Fine Science Tools # 26016-12) </li><li> 9-Zoll-Glas Pasteurpipette </li><li> Peleusball oder Pumpe </li><li> Laborwischtuch </li><li> kleine Papier-Etiketten </li><li> (Optional) gedruckt Kalibrierungsskala </li><li> nasse Papiertücher </li><li> zip-Schließung Plastiktüte </li><li> Skalpell / Rasierklinge (zum Ausschneiden Agar-Blöcke) </li></ul>

methoden zur untersuchung des zebrafisch maxillary barbel

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barben sind hautsensorischen Anhängsel bei Fischen, Reptilien und Amphibien gefunden. Der Zebrafisch, Danio rerio, entwickelt zwei Paar Barteln-eine kurze Nase Paar und einen längeren Oberkiefer Paar. Barbel Gewebe enthält Zellen ektodermalen, mesodermalen und Neuralleiste Ursprungs, einschließlich Hautzellen, Drüsen, Gaumen, Melanozyten, Kreislauf-Gefäße und sensorischen Nerven. Anders als die meisten adulten Gewebe ist die Ober-Barbe optisch klar, so dass wir die Entwicklung und Wartung dieser Gewebearten während des gesamten Lebenszyklus zu visualisieren. Dieses Video zeigt frühe Entwicklung des Oberkiefers Barbe (Beginn etwa einen Monat nach der Befruchtung) und zeigt eine chirurgische Protokoll, um die Regeneration im adulten Anhängsel (&gt; 3 Monate nach der Befruchtung) zu induzieren. Kurz gesagt, ist die linke Oberkiefer Barben eines betäubten Fische mit einer sterilen Pinzette gerade distal bis zum kaudalen Rand des Oberkiefers erhöht. Eine feine, sterile Schere Frühjahr gegen die Zange positioniert, um die Barbe Welle auf dieser Ebene geschnitten, Gründung einer anatomischen Landmarke für die Amputation Ebene. Regenerative Wachstum kann in Bezug auf diese Ebene gemessen werden, und im Vergleich zu der kontralateralen Barben. Barbel Gewebe regeneriert sich schnell und erreichte maximal Nachwachsen innerhalb von 2 Wochen nach der Verletzung. Techniken für die Analyse der regeneriert Barben gehören sezieren und Einbettung paarweise Barben (regenerieren und Kontrolle) in die Vertiefungen einer Standard-DNA-Elektrophorese-Gel. Embedded Proben sind bequem unter einem Stereomikroskop für grobe Morphologie und Morphometrie fotografiert, und kann für mehrere Wochen aufbewahrt vor Downstream-Anwendungen wie Paraffin Histologie werden, Kryoschneiden und / oder ganze Berg Immunhistochemie. Diese Methoden zu etablieren Oberkiefer Barbe als neuartige In-vivo-Gewebe-System für die Erforschung der Regenerationsfähigkeit der verschiedenen Zelltypen innerhalb des genetischen Zusammenhang mit der Zebrafisch.

Der Zebrafisch Oberkiefer Barbe ist ein integumentary Sinnesorgan mit ektodermalen, mesodermalen und Neuralleiste Derivate. Wichtig ist, dass die erwachsenen Barben nach proximal Amputation zu regenerieren. Dieses Video stellt Oberkiefer Barben Entwicklung und zeigt eine chirurgische Protokoll, um die Regeneration zu induzieren, durch Sammlung, Einbett-und nachgelagerten Bildgebung von Barben Exemplare folgten.

Methoden zur Untersuchung des Zebrafisch Maxillary Barbel

Barteln sind hautige Sinnesorgane, die bei Fischen, Reptilien und Amphibien vorkommen. Der Zebrabärbling, Danio rerio, entwickelt zwei Paare Barteln – eine kurze nasale...

Marbles sind eine heterogene Ansammlung sensorischer Strukturen, die bei Amphibien, Reptilien und Fischen vorkommen. Der Zebrafisch entwickelt zwei Paare von Marbles, ein kleineres nasales Paar und ein größeres maxillares Paar. Diese transparenten Auswüchse können verwendet werden, um die Entwicklung, Erhaltung und Regeneration mehrerer Zebrafisch-Zelltypen zu untersuchen.Dieses Video stellt die Entwicklung des Oberkiefermarmors vor und demonstriert ein chirurgisches Protokoll zur Induktion der Regeneration. Die Barben werden einige Tage oder Wochen später entnommen, gefolgt von der Dissektion und Einbettung der regenerierten Gewebe und Kontrollproben. Hallo, ich bin Elizabeth LeClair vom LeClair-Labor an der DePaul University, und ich bin Ya Chesky von der medizinischen Fakultät der Northwestern University und dem Children's Memorial Research Center.Heute zeigen wir Ihnen einige Verfahren zur Untersuchung des Zebrafischemaxillarknollens. Wir verwenden diese Verfahren, um Wachstum und Entwicklung des Zebrafischemaxillarknollens zu untersuchen. Beginnen wir also.Etwa 30 bis 40 Tage nach der Befruchtung erscheint der maxilläre Bartfaden als transparenter epithelialer Keim in der hinteren ventralen Ecke des Oberkiefers. Während sich der Zebrafisch weiterentwickelt, verlängert sich der Bartfaden zu einem schmalen, mehrere Millimeter langen, fadenförmigen Fortsatz. Der reife Bartfaden enthält mehrere wichtige Zelltypen, darunter Pigmentzellen, Drüsenzellen, Geschmacksknospen, Blutgefäße und myelinisierte Nerven.Am besten ist, dass das Organ während aller Entwicklungsstadien durchsichtig bleibt. Wie andere Organe des Zebrabärblings kann der maxilläre Bartfaden nach einer proximalen Amputation regenerieren. In diesem Abschnitt demonstrieren wir ein Verfahren, um den Bartfaden an der Basis der Maxille abzuschneiden.Dies könnte auch als einseitige Ektomie bezeichnet werden. Am Tag der Operation bereiten Sie zwei kleine Behälter mit Fischwasser vor, einen für die Anästhesie und einen für die Erholung. Der Anästhesiebehälter enthält 0,015 % Trica, das auf pH 7,0 gepuffert ist.In Fischwasser enthält der Rekuperationstank Fische, Wasser und einen Tropfen Methylenblau zur Kontrolle von Pilzinfektionen. Betäuben Sie ein bis drei adulte Zebrafische durch Eintauchen in den Trica-Tank, bis die Schwimmbewegungen stoppen und die Kiemenatmung langsam und regelmäßig wird. Abhängig von der Fischgröße kann die vollständige Anästhesie zwei bis fünf Minuten dauern.Verwenden Sie ein Aquariumfisch-Netz, um die Fische auf ein Stück feuchtes Papierhandtuch in einer Petrischale zu übertragen. Richten Sie die Fische mit einem stumpfen Spatel so aus, dass sie parallel zueinander liegen. Falten Sie einen Teil des Papiertuchs über die Fische, während die linke Seitenfläche nach oben zeigt, um sie feucht zu halten.Danach die Petrischale unter dem Stereomikroskop mit schräg einfallendem Licht betrachten, um den Kopf zu beleuchten. Mit feiner Pinzette auf die Basis des linken maxillaren Marmors fokussieren. Den Marmorstiel knapp distal zur Grenze der Maxille fest ergreifen.Heben Sie den Marmor an und führen Sie eine feine Feder-Schere direkt proximal zur Pinzette ein, um Stabilität zu gewährleisten. Die Schere kann die Pinzette berühren oder alternativ den Boden der Petrischale. Bewegen Sie die Scherenbacken entlang des Schafts des Marmors, bis die Schneidkante an die Kante der Maxilla heranreicht.Schneiden Sie durch den Marbelschaft und entfernen Sie den amputierten Marmor. Dieses Gewebe kann separat fixiert und analysiert werden. Überführen Sie den Fisch nach der Operation in den Erholungsbehälter.Lassen Sie den Fisch mehrere Stunden bis über Nacht auskurieren und geben Sie ihn anschließend in das Aufzucht-System zurück. Warten Sie ein bis zwei Wochen, bis die Wiederherstellung der Barteln erfolgt ist. Im nächsten Abschnitt zeigen wir Ihnen, wie man fixiertes Marmorgewewe zur Analyse vorbereitet.Dieses Verfahren beginnt mit Glasmurmeln, die Tage, Wochen oder Monate nach der Operation gesammelt und fixiert wurden. Spülen Sie das fixierte Gewebe mit einer gepufferten Salzlösung ab und dissezieren Sie die regenerierte Murmel von der linken Kopfseite. Vergessen Sie nicht die rechte Barbe, die als Kontrolle für die vorübergehende Lagerung dient.Pipettieren Sie jedes zusammenpassende Paar von Kugeln in einen Tropfen Salzlösung auf eine Petrischale. Decken Sie die Schale mit einem Deckel ab und lassen Sie sie auf dem Pult stehen, während Sie fortfahren. Erwärmen Sie Ihr Gel, indem Sie 150 Milliliter 2 % Agarose erhitzen, bis diese vollständig gelöst ist.Äquilibrieren Sie die Lösung in einem Wasserbad bei 50 bis 60 Grad Celsius. Bauen Sie als Nächstes eine Standard-Gelelektrophoreseapparatur auf und geben Sie ein bis vier kleine Zähne pro Probe hinzu. Gießen Sie das geschmolzene Agarosegel in die Gießform auf eine ebene Fläche, wobei gerade genug zugegeben wird, um sehr flache Vertiefungen zu bilden.Geben Sie die übrigen Aros unverzüglich in das warme Wasserbad zurück. Führen Sie eine lange Glas-Pasteur-Pipette ein, sodass die Pipette die gleiche Temperatur wie die Aros erreicht. Nachdem das Gel abgekühlt ist, entfernen Sie die Kämme und anschließend die Gelform.Um das Gel sicher zu befestigen, kleben Sie beide Seiten mit Ihrer Lieblingsfarbe Laborband ab. Das Band sollte mehrere Millimeter über die Oberfläche des Agarosegels hinausragen, damit später zusätzliches Agarosegellös eingegossen werden kann. Positionieren Sie die Gelform auf dem Objektträger eines Stereomikroskops. Vergrößern Sie eine leere Mulde und fokussieren Sie deren Ränder.Pipettieren Sie die Kugeln mit Hilfe von Griffen, die mit gebogenen Insektennadeln ausgestattet sind, aus der Petrischale auf die Oberfläche des Gels neben der Mulde. Ziehen Sie die Kugeln in die Mulde und drücken Sie sie nach unten. Richten Sie die Hanteln parallel zueinander und entlang der langen Kanten der Mulde aus. Entfernen Sie vor dem Einbetten überschüssige Flüssigkeit mit einer feinen Pipette oder Laborgewebe.Tragen Sie mit der vorgewärmten Glaspipette vorsichtig frisches, geschmolzenes Agar um das Gewebe herum auf. Nehmen Sie letzte Anpassungen vor, bevor das Agar erstarrt, und füllen Sie die Vertiefung nicht über. Notieren Sie die Probennummer, indem Sie einen kleinen Zettel mit der Nummer in die Nähe legen.Nachdem alle Proben eingebettet sind, glätten Sie die Oberfläche des Gels, indem Sie eine dünne Schicht Aros auf die Oberseite gießen. Verwenden Sie so wenig wie möglich, damit das Gel für die Fotografie transparent bleibt. Sobald das Gel erstarrt ist, kann es unter einem Stereomikroskop fotografiert werden, um Größe und Form jedes Murmel-Paares zu dokumentieren und morphometrische Messungen für weitere Analysen zu sammeln.Agarblöcke, die gepaarte Murmeln enthalten, können mit einem Skalpell oder einer Rasierklinge aus dem Gel herausgeschnitten werden. Diese können anschließend mit Standardmethoden für die Paraffin-Histologie oder Kryoschnitte verarbeitet werden. Alternativ können einzelne Murmeln mit feinen, in Wasser gespülten Nadeln aus dem Agar präpariert und dann für andere nachgeschaltete Anwendungen wie die Immunhistochemie am Gesamtpräparat oder die konfokale Mikroskopie verwendet werden.Schließlich kann das gesamte Gel in einer Tüte verschlossen und gekühlt aufbewahrt werden. Die Proben sind mehrere Wochen lang haltbar. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man den sich entwickelnden und regenerierenden Maxillarbart beobachtet und analysiert.Es handelt sich um ein neues System im Zebrafisch, sodass noch viel entdeckt werden muss. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Zeitraffer-konfokale Bildgebung ist eine leistungsstarke Technik zur Charakterisierung der embryonalen Entwicklung. Hier beschreiben wir die Methodik und zu charakterisieren kraniofazialen Morphogenese in Wildtyp-als auch PDGFRA, Smad5 und SMO mutierten Embryonen.

Analyse Craniofacial Morphogenese in Zebrafisch Mit 4D konfokale Mikroskopie

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Das hier beschriebene Protokoll stellt ein einfaches und leicht verständliches Verfahren zum Färben und Präparieren von kraniofazialen Knorpeln bei einer 5 Tage alten Zebrafischlarve dar. Es kann verwendet werden, um die Anatomie, Form und Größe dieser Strukturen unter verschiedenen Entwicklungsbedingungen zu untersuchen.

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Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Quantifizierung der Kraniofacialform von Knorpelform mithilfe freier Software (tpsDigs2, MorphoJ und PAST), um Veränderungen der Gesichtsstruktur bei Zebrafischlarven zu messen.

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Lernen Sie die chirurgische Amputation und Regeneration des maxillären Bartels bei Danio rerio. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Zelltypen und regenerativen Mechanismen in vivo.

Methoden zur Untersuchung des Zebrafisch Maxillary Barbel

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