Eine Technik, um gleichzeitig zu visualisieren Virus-spezifische CD8 + T-Zellen und Virus-infizierten Zellen In situ

Durch die Kombination von in situ Hybridisierung und Tetra-Färbung in einer Technik, die als ISTH bekannt ist, können die relativen Zahlen und räumlichen Beziehungen zwischen viralen antigenspezifischen Immuneffektorzellen und viral infizierten Zellen und Geweben bestimmt werden. Das ISTH beginnt mit der Einbettung von frischem SIV-infiziertem Gewebe in Agros. Das Gewebe wird mit einem Vibrato in 200 Mikrometer dicke Abschnitte geschnitten und mit viralem Antigen gefärbt.

Spezifische CD acht positive Zellen unter Verwendung von fit C markierten MHC-Tetrameren. Nach dem Einfrieren werden diese Färbeabschnitte mit einem Kryostaten weiter in acht Mikrometer dicke Abschnitte geschnitten und in situ Hybridisierung durchgeführt, um viral infizierte Zellen zu lokalisieren. Die konfokale Mikroskopie wird verwendet, um die Doppelfärbeschnitte abzubilden und schließlich die ursprünglichen dicken Schnitte zu rekonstruieren, um die Beziehung zwischen Immuneffektor und Zielzellen aufzudecken.

Die Verwendung dieses Verfahrens zur Untersuchung einer frühen SIV-Infektion hat sich als guter Prädiktor für die Schwere der nachfolgenden Erkrankung erwiesen. Hallo, ich bin Chinen Lee aus dem Laborbaum von Ashley HA in der Abteilung für Mikrobiologie an der University of Minnesota. Ich bin Pam Skinner, Assistenzprofessorin am Department of Veterinarian Biomedical Sciences an der University of Minnesota.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für das Innere im Institut Hybridisierung, kurz ISTH. Neben der Verwendung der Inci teer-Färbung in Kombination mit der Inci-Hybridisierung, wie wir heute demonstrieren, verwenden wir auch routinemäßig die Inci teer-Färbung in Kombination mit Immunhistochemie, um die Lokalisation, die Häufigkeit und das Proteinexpressionsprofil von antigenspezifischen CD-Acht-T-Zellen in situ zu bestimmen. Dr. Heon Kim und Terry Matala werden uns heute bei der In-situ-Färbung mit den dicken Abschnitten unterstützen und uns bei der Vorbereitung eines Dünnschnitts und der In-situ-Hybridisierung unterstützen

Um diesen Vorgang zu starten, kühlen Sie das Vibram-Bad mit sterilem PBSH auf zwei Grad Celsius ab. Stellen Sie den Winkel der Vibratorklinge auf 27 Grad ein. Bewahren Sie frisches Gewebe nach Möglichkeit gekühlt auf Eis auf und beginnen Sie innerhalb von 24 Stunden nach der Entnahme des Gewebes mit dem Eingriff.

Um die Abbaukälte zu minimieren, erleichtert das Vibram auch das Schneiden eines frischen Gewebes, das Abschneiden von Bindegewebe und das Schneiden der Probe mit dem Skalpell in kleine Stücke und legen Sie die Stücke in ein Molkeschiffchen und bedecken Sie sie mit 4% niedriger Schmelze. Agros in PBS schmolz bei rund 40 Grad Celsius. Stellen Sie sicher, dass das Taschentuch mit dem Boden der Schale in Kontakt kommt, und drücken Sie die Taschentuchstücke nach unten, wenn sie schwimmen, und verfestigen Sie sich drei bis fünf Minuten lang auf Eis.

Hier wird Milzgewebe verwendet, aber auch Lymphknoten, Vagina, Gebärmutterhals, Gebärmutter oder anderes frisches Gewebe können mit einem Skalpell verwendet werden. Schneiden Sie den Agros um das Gewebe herum und übertragen Sie das in Agros eingebettete Gewebe vorsichtig mit einer Pinzette in den Gewebeblock. Fahren Sie fort, indem Sie einen Vibram-Gewebeblock mit Loctite-Kleber beschichten.

Bewegen Sie das Gewebestück nicht, sobald es auf den Gewebeblock gelegt wurde. Etwa 10 Minuten auf Eis trocknen lassen. Montieren Sie dann den Gewebeblock in den Vibrator und schneiden Sie das Gewebe mit einer todlangsamen Vorwärtsgeschwindigkeit und einer relativ hohen Amplitude in 200 Mikrometer dicke Abschnitte.

Übertragen Sie die geschnittenen Abschnitte mit einem Pinsel in eine spezielle Gewebekammer, die in die Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte eingelassen ist, die mit einem Milliliter gekühltem PBSH vorgefüllt ist. Legen Sie bis zu vier Gewebeschnitte in jede Gewebekammer. Beschriften Sie die Proben und befestigen Sie den Deckel mit einem Gummiband an der Platte, um die Gewebeschnitte auf virusspezifische T-Zellen zu färben.

ZI-konjugierte Tetramere werden zunächst in Blockierungspuffer auf nwt 0,5 Mikrogramm pro Milliliter verdünnt. Die Lösung wird in eine 24-Well-Platte mit einem Milliliter pro Well pipettiert. Das frisch geschnittene Gewebe wird auf die Platte in den Gewebekammern übertragen und darf über Nacht bei vier Grad Celsius schaukeln.

Halten Sie eine leere Vertiefung zwischen den Gewebekammern mit verschiedenen Proben, um eine Kreuzkontamination der Lösungen in den nachfolgenden Schritten zu vermeiden. In diesem Schritt kann man Antikörper hinzufügen, die gegen extrazelluläre Proteine oder Zelloberflächenproteine gerichtet sind. Bereiten Sie zum Waschen nach der Primärinkubation eine 24-Well-Gewebekulturplatte mit gekühltem PBSH vor.

Waschen Sie die Gewebekammern zweimal, indem Sie sie jeweils 20 Minuten lang auf eine vorgefüllte Platte geben, und achten Sie darauf, dass der größte Teil der Flüssigkeit aus den Gewebekammern abgelassen wird, bevor Sie sie umfüllen. Tropfen Sie auch nicht den Inhalt einer Probe in eine andere, wenn Sie die Gewebekammern bewegen, und überwachen Sie die Schnitte in den Gewebekammern, um sicherzustellen, dass sie nicht an den Seiten kleben. Fixieren Sie die Abschnitte nach der Fixierung zwei Stunden lang mit frischem 4%-Paraldehyd in PBS bei Raumtemperatur.

Zweimal jeweils fünf Minuten lang mit kaltem PBSH gewaschen, um das Signal der Tetramere zu verstärken. Inkubieren Sie die Schnitte mit Kaninchen-Anti-Fitzy-Antikörpern im Verhältnis von eins zu 10.000 in Blockpuffer für ein bis drei Tage. In diesem Stadium kann man Antikörper gegen intrazelluläre Epitope hinzufügen.

Es wird sichergestellt, dass die Zellen permementalisiert und unspezifische Stellen blockiert werden, bevor der Antikörper hinzugefügt wird. Eine Antigen-Retrievation kann auch nach der zweiten langen Inkubation erforderlich sein, um das Signal zu verstärken. Waschen Sie die Abschnitte dreimal für mindestens 20 Minuten und jeweils bis zu mehreren Stunden in PBSH.

Führen Sie eine abschließende Inkubation mit geeigneten fluoreszenzmarkierten Antikörpern durch. Zum Beispiel kann man Ziegen-Anti-Kaninchen-SI drei verwenden, um die Kaninchen-Anti-Fitzy-Antikörper zu binden, um die Tetramer-Färbezellen rot fluoreszieren zu lassen. Wenn Maus-Antikörper verwendet wurden, um Proteine von Interesse zu gegenfärben, wie z. B. CD 8, um Killer-T-Zellen sichtbar zu machen, kann man das Ziegen-Anti-US-Antikörper Alexa 488 verwenden, um an die Maus-Antikörper zu binden und die Antikörper-Färbezellen fluoreszieren zu lassen; die grünen Verdünnungen jedes Antikörpers müssen empirisch bestimmt werden.

Inkubieren Sie ein bis drei Tage lang, bewahren Sie die Abschnitte lichtgeschützt auf, indem Sie die Platten und die Alufolie während dieser Inkubation einwickeln und danach, wenn das Licht die Flora löscht. Zum Schluss fixieren Sie die Abschnitte wieder, um die Tetramere und die Antikörper an Ort und Stelle zu fixieren. Waschen und montieren Sie es auf einem Objektträger mit Glyceringelatine, die vier Milligramm pro Milliliter N-Profilgallat enthält, zur Lagerung bei minus 20 Grad Celsius, bis Dünnschliffe für die In-situ-Hybridisierung vorbereitet werden.

Die insitu Tetramer-Färbeschnitte können nun mit einem konfokalen Mikroskop analysiert werden, um die Lokalisationshäufigkeit und das Proteinexpressionsmuster von antigenspezifischen CD zu bestimmen: Acht positive T-Zellen im gezeigten Bild Milzgewebsschnitte aus einem SIV-infizierten Recess meac wurden mit Gag-Tetrameren gefärbt, um SIV-spezifische CD, acht positive T-Zellen, CD 20-Antikörper und CD drei Antikörper zu markieren. Denn Zähler, die mit Antikörpern gefärbt sind, gehen im nächsten Schritt verloren. Es ist wichtig, In-situ-Tetramere zu analysieren, bevor man fortfährt.

Beginnen Sie den Dünnschnitt, indem Sie die 200 Mikrometer dicken Schnitte fünf Minuten lang auf einem Heizblock bei 70 Grad Celsius erhitzen, um die dicken Schnitte vom Objektträger zu lösen. Sobald die Abschnitte gelöst sind, betten Sie sie in OCT auf Trockeneis ein, indem Sie zuerst den Boden der Kunststoffform mit OCT füllen. Legen Sie dann das Taschentuch auf das OCT und bedecken Sie es mit OCT.

Verwenden Sie einen Kryostaten, um acht Mikrometer dicke Abschnitte aus den eingebetteten OCT-Abschnitten zu schneiden und die acht Mikrometer-Abschnitte auf siloisierte Objektträger zu kleben. Die Objektträger können dann bei minus 80 Grad Celsius in einer verschlossenen Box gelagert werden, um anschließend in situ Hybridisierung durchgeführt zu werden. Die Standard-in-situ-Hybridisierung wird verwendet, um viral infizierte Zellen über S 35-markierte virusspezifische Rippensonden nachzuweisen.

Das Verfahren umfasst auch die Beschichtung von Abschnitten mit nuklearer Gleisemulsion und Montageschieber. In einem fluoreszenzkompatiblen Paramount-Medium werden konfokale Bilder mit einem BioRad MRC 1000 Konfokalmikroskop aufgenommen, das mit einem Epi-Tubus-Blaureflexionsgerät ausgestattet ist. Die insitu-Tetra-Färbung wird mit dem EPI one 605 für das rote Tetra-Fluorochrom und dem EPI 2 522 DF 32 für das grüne CD eight Fluorochrom für die insitu-Hybridisierung visualisiert.

Verwenden Sie die EPI-Zwei-Blau-Reflexion für die Silberkörner, die aus dem in-situ-Hybridisierungssignal in den entwickelten Radioautographen resultieren. Um mit der Bildaufnahme zu beginnen, erfassen Sie die Bilder aus jedem Abschnitt von links nach rechts und von oben nach unten und stellen Sie sicher, dass jedes Bild mit einer Überlappung von ca. 20 % mit den benachbarten Bildern aufgenommen wird. Um Lücken im rekonstruierten Montagebild zu vermeiden, benennen Sie jedes Bild nach seinem Bro und seiner Spalte in einer Excel-Datei.

Wenn die Datenerfassung von den Folien abgeschlossen ist, verwenden Sie die konfokale Assistentensoftware, um Z-Serienbilder für jeden Kanal in ein einzelnes Bild zu projizieren, indem Sie ein Photoshop-Verfahren mit sieben Aktionen verwenden, das von den Autoren erhältlich ist, und das projizierte Bild aus den drei Kanälen automatisch zu einem RGB-Bild zusammenführen. Fügen Sie dann die zusammengefügten Bilder in Schichten zusammen, um ein Montagebild des gesamten Abschnitts zu erstellen. Verknüpfen Sie einzelne Silberkörner und Tetramerflecken mit Zellen in der Montage mit Metamorph oder Photoshop.

Weisen Sie die XY-Koordinaten der Zentren oder OIDs der viralen RNA-positiven und Tetramer-positiven Zellen zu. Exportieren Sie die OID-Daten in Excel-Dateien als numerische Zahlen für jede Zelle und verwenden Sie die in den Excel-Dateien gesammelten Daten, um das Verhältnis von Immuneffektor- oder E-Zellen zu viralen Zielen oder T-Zellen aus der Gesamtzahl der tetramerpositiven und viralen RNA-positiven Zellen in einem Schnitt zu bestimmen, um die räumlichen Beziehungen zwischen tetramerpositiven und RNA-positiven Zellen zu erfassen. Kopieren Sie die entsprechenden Diagramme aus den Excel-Dateien und fügen Sie sie in ein Photoshop-Dokument in Photoshop ein.

Verringern Sie die Deckkraft einer Ebene, um die Raster so auszurichten und zu skalieren, dass sie in der Farbe übereinstimmen, wählen Sie sie aus und kopieren Sie sie dann und fügen Sie sie in eine neue Ebene ein. Die Positionen der blauen RNA-positiven Zellen verwerfen die Schicht, die zum Ausrichten der Gitter verwendet wurde, und die Positionen der tetramerpositiven und viralen RNA-positiven Zellen werden in dem abgeflachten Bild angezeigt. Mit der hier gezeigten ISTH-Methode sind wir in der Lage, die Immunantwort auf eine SIV-Infektion nach intravaginaler Inokulation an dieser Eintrittspforte und in den lymphatischen Geweben, auf die sich die Infektion ausbreitet, zu verfolgen.

10 Tage nach der Infektion gibt es eine große Anzahl infizierter Zellen an diesen Gewebestellen, aber erst drei Tage später gibt es grün gefärbte CD A-positive Zellen, aber noch nicht. Rot gefärbte SIV-spezifische tetrapositive Zellen. Die Immunantwort kommt also zu spät, um die Infektion zu beseitigen.

Drei Wochen nach der Infektion ist jedoch ein Rückgang der infizierten Zellen deutlich sichtbar, insbesondere an der Eintrittspforte. Wir haben ISTH verwendet, um zu zeigen, dass das Ausmaß der Reduktion mit der räumlichen Nähe und der relativen Anzahl von Tetramer-positiven Immuneffektorzellen korreliert. N-S-I-V-R-N-A-positive Zielzellen, wir nennen dies das in vivo E-zu-T-Verhältnis.

Die räumlichen Beziehungen lassen sich mit dieser Methode leicht sichtbar machen, wobei Effektorzellen in Rot und virale Ziele in Blau in diesem infizierten Lymphknoten zu sehen sind. Viele Effektor- und Zielzellen befinden sich in unmittelbarer Nähe, und es gibt Bereiche, in denen viele Effektorzellen eine einzelne S-I-V-R-N-A-positive Zelle umgeben, während in anderen Bereichen eine S-I-V-R-N-A-positive Zelle allein steht. Das Verhältnis der ETT wird einfach berechnet, da die Positionen der Zellen durch die Nummern der einzelnen Zellen in der Excel-Datei bestimmt und protokolliert werden.

Die beste Kontrolle der Virusinfektion korreliert mit einem großen Überschuss an roten Effektoren über grünen Zielen 43 zu eins. In diesem Fall waren die ETT-Verhältnisse im Gebärmutterhals und in der Vagina, wo die Infektion begann, in den Lymphknoten niedriger. Die positive Korrelation zwischen hohen ETT-Verhältnissen und der Verringerung der Viruslast ab dem Höhepunkt deutet darauf hin, dass eine robustere Immunantwort an der Eintrittspforte zu einer besseren Kontrolle der Infektion führt.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie gleichzeitig die sehr spezifischen CDAT-Zellen und die Virusinfektionszelle in situ nachweisen können. Diese Technik ermöglicht es uns, gleichzeitig antigenspezifische T-Zellen und virusinfizierte Zellen in Geweben sichtbar zu machen. Diese Technik kann angewendet werden, um den acht positiven T-Zell-basierten Impfstoff und die andere nicht-wertige Erreger-Wirt-Interaktion bei diesem Verfahren zu bewerten.

Es ist wichtig, alle Reagenzien-RNAs frei zu halten, bevor Sie die Erkenntnisse zur Hybridisierung gewinnen. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.