Extraktion von High Molecular Weight genomischer DNA aus Böden und Sedimenten

Hallo, ich bin San Lee aus dem Labor von Stephen Harlem in der Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie an der University of British Columbia. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur hochmolekularen genomischen, DNA-Extraktion aus dem Wald in den Boden, das auch auf die unterschiedlichsten Boden- und Sedimenttypen anwendbar ist. Wir verwenden genomische DNA mit hohem Molekulargewicht, um die Waldmeterbibliothek der mikrobiellen Bodengemeinschaften zu erstellen.

Mit diesen Bibliotheken in der Hand können wir die Diversität und das metabolische Potenzial von mikrobiellen Gemeinschaften untersuchen, die sich auf verschiedene Bodenhorizonte verteilen. Also lasst uns loslegen. Dieses Protokoll beginnt mit der Zelllyse.

Der erste Schritt besteht darin, den Denaturierungspuffer durch Zugabe von betta mer capto Ethanol in einer Konzentration von 0,5 % zu vervollständigen, um die besten Ergebnisse zu erzielen, die Denaturierungslösung jedes Mal frisch zu machen. Alternativ können Sie auch Puffer verwenden, der weniger als eine Woche alt ist und bei vier Grad Celsius aufbewahrt wurde. Für den nächsten Schritt benötigen Sie einen Doer mit flüssigem Stickstoff und einen Autoklaven sowie einen vorgekühlten Mörserstößel und Spatel.

Geben Sie eine zwei Gramm schwere gefrorene Bodenprobe in den vorgekühlten Mörser. Fügen Sie einen Milliliter der Denaturierungslösung hinzu. Fügen Sie dann flüssigen Stickstoff hinzu, um den Boden vollständig zu bedecken.

Verwenden Sie einen vorgekühlten Stößel, um die Probe zu mahlen, bis die Bodenpartikel pulverförmig und homogen aussehen und die Probe zu schmelzen beginnt. Fügen Sie dann mehr flüssigen Stickstoff hinzu und wiederholen Sie den Mahlschritt. Damit ist der Schritt der Zelllyse mit einem vorgekühlten Spatel abgeschlossen.

Übertragen Sie die gemahlene Probe in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Bewahren Sie die Probe auf Eis auf, um sofort mit der DNA-Extraktion fortzufahren, oder lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Für die Verwendung in Litern vervollständigen Sie den Extraktionspuffer kurz vor Beginn der DNA-Extraktion durch Zugabe von Hexa-Deco-Trimethylammoniumbromid oder CTAB und SDS. Erste.

Überprüfen Sie, ob das CTAB kristallisiert ist, und wenn ja, lösen Sie es bei 60 Grad Celsius auf, bevor Sie fortfahren. Fügen Sie es dann der Lösung für eine Gesamtkonzentration von 1% hinzuAls nächstes fügen Sie 20%SDS-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 2% hinzuDie milchige Suspension. Dass sich Formen bilden, ist normal.

Halten Sie den fertigen Extraktionspuffer nach Zugabe des SDS homogen, indem Sie ihn nach 10 bis 15 Minuten bei 60 Grad Celsius lagern. Sobald der Extraktionspuffer gut aufgelöst und homogen ist, geben Sie neun Milliliter Extraktionspuffer in die Bodenprobe und wirbeln Sie ihn kurz bei niedriger Geschwindigkeit zum Mischen ein. Inkubieren Sie die Probe mit Extraktionspuffer in einem 65 Grad Celsius heißen Hybridisierungsofen für 40 Minuten.

Drehen Sie die Röhrchen während der Inkubation alle 10 Minuten vorsichtig um oder drehen Sie die Röhrchen kontinuierlich mit der niedrigsten Drehzahl des Rotors. Während der Inkubation kann die Lösung nach der Inkubation leicht viskos erscheinen. Der nächste Schritt besteht darin, die DNA mit Chloroform-Isoamylalkohol vom organischen Material im Lysegemisch zu reinigen.

Beginnen Sie damit, die Probe 10 Minuten lang bei 1800 g bei etwa 10 bis 14 Grad Celsius in der Haube zu zentrifugieren, sammeln Sie die DNA, die den Überstand enthält, indem Sie Ihre Pipettenspitze vorsichtig an der Seite des Röhrchens entlangschieben, wobei Sie die beige Schicht oben und die organische Schicht unten vermeiden. Der Überstand wird in ein vorgekühltes 50-Milliliter-Röhrchen mit 20 Millilitern Chloroform-ISL-Alkohol überführt oder anschließend der Extraktionsvorgang an derselben Probe noch zwei Mal wiederholt. Bewahren Sie in der Zwischenzeit den DNA-Extrakt und das Chloroform i a a auf Eis in der Haube auf.

Für die zweite DNA-Extraktion gehen Sie zurück zu dem Röhrchen mit dem Bodenpellet mit dem restlichen Extraktionspuffer und fügen Sie fünf weitere Milliliter Extraktionspuffer hinzu. Rühren Sie vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Spitze um, um zu mischen, und wirbeln Sie es kurz auf, um das Pellet wie zuvor wieder zu suspendieren. Inkubieren Sie bei 65 Grad Celsius, diesmal für 10 Minuten.

Dann bei 1800 g 10 Minuten zentrifugieren. Bei etwa 10 bis 14 Grad Celsius in der Haube wird der Überstand in das Röhrchen mit Chloroform, Isoamylalkohol oder Chloroform i a a und dem Überstand aus der vorherigen Extraktion überführt. Wiederholen Sie den gesamten Extraktionsvorgang noch einmal, um so viel DNA wie möglich aus der Bodenprobe zu extrahieren.

Wenn Sie insgesamt drei Extraktionen an Ihrer Bodenprobe durchgeführt haben, schütteln Sie das Röhrchen mit dem gesammelten Supra natant und Chloroform i a a a auf einer rotierenden Platte bei 1,25 RRP m sehr vorsichtig für 10 Minuten für 10 Minuten. Nach diesem Mischschritt zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 1800 Gs für 20 Minuten bei etwa 10 bis 14 Grad Celsius. Nach der Zentrifugation wird die wässrige Phase vorsichtig in ein neues Ultrazentrifugenröhrchen überführt, wobei ein bis zwei Milliliter SNAT übrig bleiben, um eine Störung der Grenzfläche zwischen der wässrigen und der organischen Phase zu vermeiden. Um die DNA auszufällen, fügen Sie nun 0,6 Milliliter Isopropylalkohol hinzu.

Drehen Sie die Röhrchen für jeden Milliliter des gesammelten Überstands einige Male vorsichtig um, um sie zu mischen. An diesem Punkt kannst du vielleicht sehen, wie die DNA in lange Fäden ausfällt. Dann inkubieren Sie die DNA mit dem Isopropanol für 30 Minuten bei Raumtemperatur.

Nach der Inkubation ist es an der Zeit, die DNA durch Zentrifugation zu pelletieren: Markieren Sie eine Ecke des Röhrchens, wenn Sie es in die Zentrifuge legen, damit Sie wissen, wo Sie das DNA-Pellet erwarten können. Schleudern Sie nach der Zentrifugation 20 Minuten lang bei 20 bis 25 Grad Celsius bei 16.000 GS und entfernen Sie den Isopropylalkohol durch Dekantieren und/oder Vakuumsaugen. Achten Sie darauf, das DNA-Pellet nicht zu verlieren, das je nach Extraktionseffizienz und Biomasse in Bodenproben von kaum sichtbar bis neun Millimeter breit ist, trocknen Sie das DNA-Pellet fünf bis 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Achten Sie darauf, dass das Pellet nicht zu stark trocknet, wenn es trocken ist.

Resuspendieren Sie die DNA in 200 bis 400 Mikrolitern te. Mischen Sie es durch sanftes Klopfen. Übertragen Sie die DNA-Lösung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Halten Sie die DNA über Nacht bei vier Grad Celsius. Um die DNA nach der Extraktion der DNA aus der Bodenprobe vollständig aufzulösen, sind die restlichen Schritte zur Überprüfung der Konzentration und DNA-Integrität der Probe Standardverfahren, die in einem anderen JoVE-Protokoll des Hallam-Labors ausführlich beschrieben sind. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration mit der Methode Ihrer Wahl.

Überprüfen Sie auch die Unversehrtheit von DNA mit hohem Molekulargewicht, indem Sie 10 bis 20 Mikroliter Ihrer DNA-Probe mit Hilfe der gepulsten Feld-Gelelektrophorese (PFGE) entnehmen. Die mittlere DNA-Größe sollte je nach Downstream-Anwendung 36 Kilobasen oder mehr betragen. Fahren Sie mit dem folgenden Schritt fort: Cäsiumchlorid-Gradientenzentrifuge: Alternativ kann die DNA vor der Ultrazentrifugation bei minus 20 Grad Celsius oder minus 80 Grad Celsius gelagert werden.

Der nächste Schritt besteht darin, die Cäsiumchlorid-Gradientenzentrifugation zu verwenden, um die DNA weiter zu reinigen, indem Verunreinigungen entfernt werden, ein Cäsiumchlorid-Gradientenzentrifugationskonzentrat verwendet und die DNA mit AmCon- und MicroCon-Zentrifugalfiltergeräten weiter gereinigt wird. Die Cäsiumchlorid-Gradientenzentrifugation ist der Schlüssel zur Erzielung einer qualitativ hochwertigen DNA und wird in einem anderen JoVE-Protokoll des Hallam-Labors ausführlich beschrieben. Überprüfen Sie nach Durchführung der Cäsiumchlorid-Gradientenzentrifugation und der Konzentrationsschritte die DNA-Konzentration mit der Methode Ihrer Wahl.

Überprüfen Sie als Nächstes die Integrität der DNA mit hohem Molekulargewicht erneut, indem Sie eine kleine Probe der DNA mit PFGE ausführen. Die Gesamtmenge an genomischer DNA, die aus zwei Gramm erzwungenem Boden isoliert wurde, liegt zwischen 10 und 180 Mikrogramm, wie auf dem Gellauf vor und nach der Cäsiumchlorid-Ultrazentrifugation gezeigt. Der Größenbereich der isolierten DNA liegt in der Regel zwischen 40 und 60 Kilobasen, hier ist ein Chromatogramm von genomischen DNA-Proben vor und nach der Cäsiumchlorid-Ultrazentrifugation.

Dieser Schritt verbessert die Reinheit der DNA, indem das Verhältnis von zwei 60 über zwei 80 von 1,3 zu 1,6 vorher auf 1,8 bis 1,9 danach erhöht wird. Darüber hinaus konnte die maximale Absorption bei 230 Nanometern, was auf eine Huminsäurekontamination hindeutet, nach der Zentrifugation erfolgreich reduziert werden. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie hochmolekulare genomische DNA aus mikrobiellen Gemeinschaften im Boden isolieren können.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, den Extraktions- und Denaturierungspuffer genau nach den Anweisungen herzustellen. Und achten Sie darauf, dass Sie nach der Ausfällung von Isopropylalkohol nicht in Ihren DNA-Gaumen gelangen. Wenn Sie die DNA-Bande nach der Chloridgradientenzentrierung zurückgewinnen.

Vergessen Sie nicht, die Spritze mit dem TE zu spülen, um die DNA-Rückgewinnung zu maximieren. Und schließlich, um die Menge und Qualität Ihrer isolierten DNA bei allen vorgeschlagenen Schritten zu überprüfen. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihrem Experiment.