Extraktion von High Molecular Weight genomischer DNA aus Böden und Sedimenten

Hi, ich bin San Lee aus dem Labor von Stephen Harlem an der Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie der University of British Columbia. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Isolierung von hochmolekularem genomischen DNA aus Waldboden, das ebenfalls auf eine Vielzahl von Boden- und Sedimenttypen anwendbar ist. Wir verwenden hochmolekulares genomisches DNA zur Konstruktion der Forest-Meter-Bibliothek mikrobieller Bodengemeinschaften.

Mit diesen Bibliotheken können wir die Diversität und das metabolische Potenzial mikrobieller Gemeinschaften untersuchen, die auf verschiedene Bodenhorizonte verteilt sind. Beginnen wir also. Dieses Protokoll startet mit der Zelllyse.

Der erste Schritt besteht darin, den Denaturierungspuffer durch Zugabe von beta-Mercaptoethanol auf eine Konzentration von 0,5 % zu vervollständigen. Für optimale Ergebnisse sollte die Denaturierungslösung jedes Mal frisch hergestellt werden. Alternativ kann ein weniger als eine Woche alter Puffer verwendet werden, der bei vier Grad Celsius aufbewahrt wurde. Für den nächsten Schritt benötigen Sie einen Behälter mit flüssigem Stickstoff, einen Autoklaven sowie einen vorgekühlten Mörser mit Pistill und einen Spatel.

Ein zwei Gramm schweres gefrorenes Bodenprobe in die vorgekühlte Mörser schlagen. Ein Milliliter der Denaturierungslösung hinzufügen. Anschließend flüssigen Stickstoff hinzufügen, bis der Boden vollständig bedeckt ist.

Verwenden Sie einen vorab gekühlten Pistill, um die Probe zu pulverisieren, bis die Bodenpartikel pulverförmig und homogen erscheinen und die Probe zu schmelzen beginnt. Fügen Sie dann weiteren flüssigen Stickstoff hinzu und wiederholen Sie den Schritt des Zermahlens. Damit ist der Zelllyseschritt mit einem vorab gekühlten Spatel abgeschlossen.

Überführen Sie die pulverisierte Probe in ein 50-Milliliter-Konischgefäß. Halten Sie die Probe auf Eis, um unmittelbar mit dem DNA-Extraktionsschritt fortzufahren, oder lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Für die Verwendung fügen Sie kurz vor Beginn der DNA-Extraktion dem Extraktionspuffer Hexadecyltrimethylammoniumbromid oder CTAB sowie SDS hinzu.

Überprüfen Sie, ob das CTAB kristallisiert ist, und lösen Sie es gegebenenfalls vor der Weiterarbeit bei 60 Grad Celsius auf. Geben Sie es anschließend zur Lösung, um eine Endkonzentration von 1 % zu erreichen. Danach fügen Sie 20 %ige SDS-Lösung hinzu, um eine Endkonzentration von 2 % zu erhalten. Die dabei entstehende milchige Suspension ist normal.

Nachdem das SDS zugegeben wurde, das vollständig zubereitete Extraktionspuffer homogen halten, indem er nach 10 bis 15 Minuten bei 60 Grad Celsius aufbewahrt wird. Sobald der Extraktionspuffer gut gelöst und homogen ist, neun Milliliter Extraktionspuffer zur Bodenprobe geben und kurz bei niedriger Geschwindigkeit verwirbeln, um zu mischen. Die Probe mit Extraktionspuffer 40 Minuten lang in einem Hybridisierungsofen bei 65 Grad Celsius inkubieren.

Während der Inkubation die Röhrchen alle 10 Minuten vorsichtig umdrehen oder kontinuierlich mit der niedrigsten Rotorgeschwindigkeit rotieren lassen. Während der Inkubation kann die Lösung nach der Inkubation leicht viskos erscheinen. Im nächsten Schritt wird Chloroform-Isoamylalkohol verwendet, um die DNA von dem organischen Material in der Lysatlösung zu reinigen.

Zentrifugieren Sie die Probe zunächst 10 Minuten bei 1800 G und etwa 10 bis 14 Grad Celsius im Abzug. Sammeln Sie den DNA-haltigen Überstand, indem Sie die Pipettenspitze vorsichtig entlang der Röhrenwand gleiten lassen, wobei Sie die beige gefärbte Schicht oben und die organische Schicht unten vermeiden. Überführen Sie den Überstand in eine vorab gekühlte 50-Milliliter-Röhre, die 20 Milliliter Chloroform ISL-Alkohol oder i a a enthält. Wiederholen Sie den Extraktionsvorgang danach noch zweimal an derselben Probe. In der Zwischenzeit bewahren Sie den DNA-Extrakt und den Chloroform i a a im Abzug auf Eis auf.

Für die zweite DNA-Extraktion kehren Sie zu dem Röhrchen mit dem Bodenpellet und dem restlichen Extraktionspuffer zurück und geben fünf Milliliter Extraktionspuffer hinzu. Vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Spitze mischen und kurz verwirbeln, um das Pellet wie zuvor erneut aufzuschwemmen. Inkubieren Sie diesmal bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten.

Anschließend 10 Minuten bei 1800 Gs zentrifugieren. Im Abzug bei etwa 10 bis 14 Grad Celsius das Überstand auf das Röhrchen mit Chloroform, Isoamylalkohol oder Chloroform i a a und dem Überstand aus der vorherigen Extraktion überführen. Den gesamten Extraktionsprozess noch einmal wiederholen, um so viel DNA wie möglich aus der Bodenprobe zu gewinnen.

Wenn Sie insgesamt drei Extraktionen an Ihrer Bodenprobe durchgeführt haben, schütteln Sie das Gefäß mit dem gesammelten Überstand und Chloroform vorsichtig auf einer rotierenden Platte 10 Minuten lang bei 1,25 U/min. Nach diesem Mischschritt zentrifugieren Sie das Gefäß 20 Minuten lang bei 1800 ×g und einer Temperatur von etwa 10 bis 14 Grad Celsius. Nach der Zentrifugation überführen Sie vorsichtig die wässrige Phase in ein neues Ultrazentrifugenröhrchen, wobei Sie ein bis zwei Milliliter des Überstands zurücklassen, um die Grenzfläche zwischen der wässrigen und der organischen Phase nicht zu stören. Um nun die DNA auszufällen, geben Sie 0,6 Milliliter Isopropanol hinzu.

Zu jedem Milliliter des gesammelten Überstandes die Röhrchen vorsichtig einige Male umdrehen, um zu mischen. An diesem Punkt können Sie möglicherweise das DNA-Präzipitat als lange Fäden sichtbar werden sehen. Anschließend die DNA 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Isopropanol inkubieren.

Nach der Inkubation ist es an der Zeit, die DNA durch Zentrifugation zu pelletieren. Markieren Sie eine Ecke des Röhrchens, während Sie es in die Zentrifuge geben, damit Sie wissen, wo sich das DNA-Pellet befindet. Zentrifugieren Sie 20 Minuten bei 16.000 ×g und 20 bis 25 °C. Nach der Zentrifugation entfernen Sie das Isopropanol durch Abgießen oder Vakuumabsaugung. Achten Sie darauf, das DNA-Pellet nicht zu verlieren, das je nach Extraktionseffizienz und Biomasse in den Bodenproben von kaum sichtbar bis neun Millimeter breit sein kann. Trocknen Sie das DNA-Pellet bei Raumtemperatur fünf bis 20 Minuten lang. Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stark auszutrocknen, wenn es trocken ist.

Suspendieren Sie die DNA in 200 bis 400 Mikrolitern TE-Puffer. Mischen Sie sie durch vorsichtiges Antippen. Überführen Sie die DNA-Lösung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Die DNA über Nacht bei vier Grad Celsius lagern. Um die DNA vollständig aufzulösen, nachdem sie aus der Bodenprobe extrahiert wurde, sind die weiteren Schritte zur Überprüfung der Konzentration und Integrität der DNA Standardverfahren, die detailliert in einem anderen JoVE-Protokoll des Hallam-Labors beschrieben werden. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration mit der von Ihnen gewählten Methode.

Überprüfen Sie außerdem die Integrität der DNA mit hohem Molekulargewicht, indem Sie 10 bis 20 Mikroliter Ihrer DNA-Probe mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) laufen lassen. Die mittlere DNA-Größe sollte je nach nachgeschalteter Anwendung 36 Kilobasen oder größer sein. Fahren Sie mit dem folgenden Zentrifugationsschritt über eine Cäsiumchlorid-Gradienten-Dichte nutzen Sie alternativ die Möglichkeit, die DNA vor der Ultrazentrifugation bei minus 20 Grad Celsius oder minus 80 Grad Celsius zu lagern.

Der nächste Schritt besteht darin, die DNA durch eine Cäsiumchlorid-Gradientenzentrifugation weiter zu reinigen, um Verunreinigungen zu entfernen. Anschließend wird die DNA nach der Cäsiumchlorid-Gradientenzentrifugation konzentriert und mithilfe von AmCon- und MicroCon-Zentrifugalfiltergeräten weitergereinigt. Die Cäsiumchlorid-Gradientenzentrifugation ist entscheidend für die Gewinnung von hochwertiger DNA und wird ausführlich in einem weiteren JoVE-Protokoll aus dem Hallam-Labor beschrieben. Nach Durchführung der Cäsiumchlorid-Gradientenzentrifugation und der Konzentrierungsschritte überprüfen Sie die DNA-Konzentration mit der von Ihnen gewählten Methode.

Überprüfen Sie anschließend die Integrität der DNA mit hohem Molekulargewicht erneut, indem Sie eine kleine Probe der DNA mittels PFGE laufen lassen. Die Gesamtmenge an genomischer DNA, die aus zwei Gramm Zwangsgeformtem Boden isoliert wurde, liegt zwischen 10 und 180 Mikrogramm, wie auf dem Gel vor und nach der Zentrifugation in einer Cäsiumchlorid-Dichtegradientenlösung gezeigt. Der Größenbereich der isolierten DNA liegt üblicherweise zwischen 40 und 60 Kilobasen. Dargestellt ist hier ein Chromatogramm von Proben genomischer DNA vor und nach der Zentrifugation in einer Cäsiumchlorid-Dichtegradientenlösung.

Dieser Schritt verbessert die Reinheit der DNA, wobei das Verhältnis von 260 zu 280 von 1,3 bis 1,6 vorher auf 1,8 bis 1,9 danach ansteigt. Außerdem wurde die Peak-Absorption bei 230 Nanometern, die auf eine Huminsäurekontamination hindeutet, nach der Zentrifugation erfolgreich verringert. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man genomische DNA mit hohem Molekulargewicht aus mikrobiellen Gemeinschaften im Boden isoliert.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, den Extraktions- und Denaturierungspuffer genau gemäß der Anleitung herzustellen. Achten Sie darauf, Ihr DNA-Pellet nach der Fällung mit Isopropanol nicht zu beschädigen, wenn Sie die DNA-Bande nach der Chlorid-Gradientenzentrifugation gewinnen.

Vergessen Sie nicht, die Spritze mit TE zu spülen, um die DNA-Rückgewinnung zu maximieren. Und schließlich sollten Sie in allen empfohlenen Schritten die Menge und Qualität Ihrer isolierten DNA überprüfen. Das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.