Name: Isolierung und Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 38 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung und Transplantation hämatopoetischer Stammzellen in Mäusen. Diese Methode demonstriert erfolgreiche Aufreinigung und Injektionstechniken für die Stammzellforschung.

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<p class="jove_title"> Insgesamt Knochenmark Vorbereitung </p><ol><li> Vier B6-Mäuse werden getötet und seziert, um tibias, Oberschenkel, Hüfte und Wirbelsäule zu erhalten. </li><li> Während der Dissektion, sind die Gliedmaßen und die Knochen in PBS 2% FCS hitzeinaktiviertem gehalten (optional 2mM EDA - Dissektion medium). </li><li> Die saubere Knochen sind mit Mörser und Stößel in Dissektion Medium zerkleinert. Ein effizienter Weg, es zu tun ist, um tibias, Oberschenkel und Hüften jeder Maus, dann 2 Stacheln zu einem Zeitpunkt, zu vernichten. </li><li> Die Zelle Mischung aus jeder Maus gewonnen werden getrennt und durch einen 40 um Filter in einen 50 ml Falcon-Röhrchen. Auf diese Weise enthält jedes Rohr die Zelle Mischung aus all den Beinknochen einer Maus, und die Hälfte der Mischung von 2 Stacheln gewonnen wird. In diesem Stadium wird der Filter verwendet werden, um Knochendebris trennen. </li><li> Es ist normalerweise ratsam, die Beinknochen crush zweimal auf weiß zu erhalten (ohne Knochenmark) Knochenfragmente und der Wirbelsäule Fragmente 2 oder 3 mal. </li><li> Füllen Sie die Rohre haben sie ausgewogen und Spin 5 min 1200rpm. </li><li> Den Überstand aspirieren und lösen Sie das Pellet durch Ziehen der Rohre auf der Tube-Rack (dieser Schritt wird nach jeder Zentrifugation zur Klumpenbildung und Zellverlust zu minimieren wichtig). Resuspendieren jedes Röhrchen in 1 ml PBS 2% FCS (NO EDTA von nun an), wenn Sie tun Linie Erschöpfung sind, oder in was auch immer Band ist nichts anderes bequemer für Sie. </li></ol><p class="jove_title"> Lineage Depletion </p><ol><li> Dieses Verfahren ermöglicht es Ihnen, hoch differenzierte Zellen zu eliminieren und erhalten eine sehr heterogene Population von Zellen, angereichert für Stamm-und Vorläuferzellen. Wenn Sie Sortierung HSC sind, diesen Schritt reduziert drastisch die Zahl der Zellen, die durch die Zellsortierung gehen, daher reduziert Sortierung Zeit und ermöglicht Ihnen, HSC Art aus einer höheren Anzahl von Mäusen, so dass Sie eine höhere Anzahl von zu erhalten HSC in einer einzigen Sortierung. </li><li> Wenn Sie vorhaben, später zu sortieren sind, nehmen Sie 50 ul Zell-Mischung (die ich gewöhnlich nehme ein bisschen von jedem Röhrchen) für die Sortierung von Kontrollen (ungefärbt und SCA1, c-Kit, CD48, Flk2 einfarbig Kontrollen). </li><li> Add Lin Cocktail 30ml/tube. Lineage-Cocktail enthält eine Vielzahl von Antikörpern, die leider ein wenig Veränderungen von Labor zu Labor. In der Scadden Labor verwenden wir biotinylierten Antikörper gegen Gr1, TER119, CD4, CD8, CD3, B220. Ihre Endverdünnung in der Färbung ist 1:700. </li><li> Vortex schnell zu mischen, und Inkubation für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Während der Inkubation, bereiten Sie die Spalten auf der Magneten und 15ml Elutionsgefässe in den Spalten. Degas einige PBS mit einem Steriflip Filter (Sie sollten wenig Luftblasen dem Weg zur Oberfläche des PBS durch Vakuumaspiration zu sehen), und Äquilibrierung der Säulen durch die Anwendung 3ml entgast PBS zu jeder Spalte. </li><li> Die Säule fließen etwa 1ml/5min, so dauert es ca. 15 min, um die Spalten einsatzbereit zu haben. </li><li> Am Ende der Inkubationszeit, fügen PBS 2% FCS zu den Rohren zu füllen und Spin-Down für 5 min bei 1200rpm. </li><li> Den Überstand aspirieren, lösen Sie die Pellets und resuspendieren in 1 ml / Rohr entgast PBS. </li><li> Wenn Sie später sortieren sind, nehmen Sie insgesamt Knochenmark Lineage einfarbigen Färbung ctrl (15ml, ein bisschen von jedem Röhrchen). </li><li> Add Streptavidinbeads 30ml/tube, Wirbel schnell zu mischen, und Inkubation für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Am Ende der Inkubation mit 2 ml / Tube entgastem PBS. Setzen Sie neue Kollektion Röhren unter den Säulen, und gelten für jede Hinausstellung auf eine Spalte, Filtrieren durch ein 40 um-Filter. </li><li> Fügen Sie weitere 3 ml entgastem PBS in jedes Röhrchen, um es zu waschen. Nachdem die Spalten leer sind, gelten wieder mit den gleichen 40 um Filter. </li><li> Das Eluat enthält die Linie erschöpft Zellgemisch, eine heterogene Bevölkerung für Stamm-und Vorläuferzellen angereichert. Pool den Inhalt der 4 Röhren in 2 Röhren. Spin für 5 min bei 1500rpm. </li><li> Saugen Sie den Überstand. Das Pellet sollte weiß oder vorwiegend weiß. Lösen Sie die Pellets und resuspendieren sie zusammen in 1 ml PBS insgesamt 2% FCS, wenn Sie später sortieren, sonst in welcher Lautstärke ist für Sie bequem zu resuspendieren. </li></ol><p class="jove_title"> LKS-oder langfristig HSC Sortierung </p><ol><li> Nehmen Sie Linie erschöpft einfarbigen Färbung ctrl (15ml). Dies ermöglicht es Ihnen, die Effizienz Ihrer Linie Erschöpfung zu beurteilen. </li><li> Die Zelle Mischung zu sortieren ist in der 15ml Tube gefärbt. </li></ol><p class="jove_content"> Add-Antikörper: </p><p class="jove_content"><table border="0"><tbody><tr><td> Sca PE-Cy5.5 </td><td> 1: 100 </td><td> 10ml </td></tr><tr><td> Kit APC </td><td> 1:100 </td><td> 10ml </td></tr><tr><td> SA PE-Cy7 </td><td> 1:500 </td><td> 2ml </td></tr></tbody></table></p><p class="jove_content"> So sortieren Sie langfristig HSC, auch hinzufügen: </p><p class="jove_content"><table border="0"><tbody><tr><td class="jove_content"> CD48 FITC </td><td class="jove_content"> 1:1000 </td><td class="jove_content"> 1ml </td></tr><tr><td class="jove_content"> Flk2 PE </td><td class="jove_content"> 1:200 </td><td class="jove_content"> 5ml </td></tr&gt; </tbody></table></p><p class="jove_content"> Auch bereiten einzelne Färbung Steuerelemente mithilfe des gesamten Knochenmarks beiseite nach der Präparation und die gesamte Knochenmark Linie gefärbt gehalten. Diese Färbungen lassen sich direkt in FACS-Röhrchen durchgeführt werden. </p><p> <em class="jove_content">Achten Sie darauf, in der Dunkelheit!</em> </p><ol><li> Vortex schnell zu mischen und bei 4 ° C für 20 bis 30 Minuten, re-Mischen auf halbem Weg durch inkubieren. </li><li> Abzuwaschen der Überschuss an Antikörpern, füllen Sie das Röhrchen mit PBS 2% FCS und Spin für 5 min bei 1500 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Überstand entfernen, resuspendieren alle Pellets und verschieben Sie sie auf neue FACS-Röhrchen mit Filter Caps. Es kann eine Weile dauern, um die Zellen zu bekommen, um durch diese Filter zu gehen, und es ist wichtig, um etwas mehr PBS danach gelten, um den Filter zu waschen und zu minimieren Zellverlust. Dieser Schritt ist notwendig, um zu vermeiden das Verstopfen der Sortierer, was der schlimmste Alptraum eines jeden Zellsortierer Benutzer. </li><li> Bei der Übergabe aus den Zellen in die Zelle Sortieranlage, stellen Sie sicher, bereiten auch ein Rohr mit PBS 10% FCS HALLO, wo die Zellen gesammelt werden. </li><li> Wenn Sie Sortierung LKS-Zellen sind, erhalten Sie eine heterogene Population, die langfristig und kurzfristig repopulating HSC und multipotente Vorläuferzellen. Eine durchschnittliche Ertrag liegt bei 300.000 LKS von 4 Mäusen. </li><li> Wenn Sie auch CD48 und Flk2 Antikörper verwendet haben, können Sie separate jeder Population von Langzeit-HSC, kurzfristig HSC und MPP. LT-HSC sind die seltenen Bevölkerung. Eine durchschnittliche Ausbeute beträgt ca. 50.000 bis 60.000 Zellen aus 4 Mäusen. </li></ol>

isolierung und transplantation von hämatopoetischen stammzellen (hsz)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolierung und Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ)

<p>Ich bin Christina Ceso. Ich bin Postdoktorandin im Labor von David Den und arbeite an hämatopoetischen Stammzellen. Heute werden wir langzeitrekonstituierende hämatopoetische Stammzellen aufreinigen und sie in eine Maus transplantieren.</p><p>Wir beginnen damit, die Mäuse mit Alkohol zu besprühen, um einerseits die Stelle zunächst zu sterilisieren und andererseits zu verhindern, dass das Fell die Sektion stört. Für die Sektion verwenden wir PBS mit 2% Serum. Ich schneide die Haut am Rücken auf und ziehe sie auseinander, um das Gewebe freizulegen.</p><p>Um die Tibia zu isolieren, halte ich sie mit einer Pinzette fest. Ich durchtrenne die Sehne oberhalb des Knies und schneide die Muskulatur unterhalb des Knies ab; danach durchtrenne ich das Kniegelenk, sodass die Tibia nicht mehr mit dem Rest des Gliedmaßens verbunden ist, und ziehe sie zur Isolierung heraus. Anschließend halte ich die Tibia kopfüber und trenne mit der Schere den Fuß von der Tibia, um den Femur zu erhalten.</p><p>Ich durchtrenne die Muskulatur um den Femur und löse anschließend den Femur aus der Hüfte. Um die Hüfte zu isolieren, durchtrenne ich die Muskulatur um den Hüftknochen auf der Seite des Schwanzes der Maus und ziehe dann die Hüft</p>

isolation-and-transplantation-of-hematopoietic-stem-cells-hscs

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

Ziel dieses Protokolls ist es, nichtmenschlichen Primaten CD34 isolieren+ Zellen aus grundiert Knochenmark, um diese Zellen mit Lentivirale Vektoren gen zu modifizieren und ein Produkt zur Infusion in die autologe Host vorzubereiten. Die Gesamt-Protokoll-Länge ist ca. 48 h.

Vorbereitung und gentechnische Veränderung von Nichtmenschen Primas hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen

Hier stellen wir ein Protokoll zur präzisen Bildung hämogenen Endothelaus aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem feeder- und xenofreien Zustand vor. Diese Methode wird breite Anwendungen bei der Modellierung von Krankheiten und beim Screening auf therapeutische Verbindungen haben.

Hämogene Endotheldifferenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen in einem feeder- und xenofreien definierten Zustand

Dieses Protokoll demonstriert die Induktion eines hämogen Programms in humanen dermalen Fibroblasten durch erzwungene Expression der Transkriptionsfaktoren GATA2, GFI1B und FOS zur Erzeugung hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen.

Hämogene Reprogrammierung menschlicher Fibroblasten durch erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren

Dieses Protokoll ermöglicht die Aufrechterhaltung von ruhenden humanen hämatopoetischen Stammzellen in vitro, indem die Mikroumgebung des Knochenmarks mit reichlich Fettsäuren, Cholesterin, niedrigeren Konzentrationen von Zytokinen und Hypoxie imitiert wird.

Eine Kulturmethode zur Erhaltung von quiescent Human Hematopoietic Stammzellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein optimiertes hämatopoetisches Stamm- und Vorläuferzell-Kulturverfahren (HSPC) für die robuste Anpflanzung von geneditierten Zellen in vivo.

CRISPR/Cas9-Gen-Editing von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen für gentherapeutische Anwendungen

Wir stellen ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Isolierung von langfristigen hämatopoetischen Stammzellen (LT-HSCs) und Kurzzeit-HSCs (ST-HSCs) mit dem Hoxb5-Reportersystem vor.

Isolationsmethode für lang- und kurzfristige hämatopoetische Stammzellen

Hier wird ein Protokoll zur Initiierung, Aufrechterhaltung und Analyse hämatopoetischer Stammzellkulturen der Maus unter Verwendung von ex vivo Polyvinylalkohol-basierter Expansion sowie Methoden zur genetischen Manipulation dieser Zellen durch lentivirale Transduktion und Elektroporation vorgestellt.

<em>Ex vivo</em> Expansion und genetische Manipulation von hämatopoetischen Stammzellen der Maus in Kulturen auf Polyvinylalkoholbasis

In dieser Arbeit etablierten wir in vivo Osteo-Organoide, die durch knochenmorphogenetische Protein-2-beladene Gelatinegerüste ausgelöst wurden, um therapeutische hämatopoetische Stamm-/Vorläuferzellen für die Rekonstruktion eines geschädigten hämatopoetischen und Immunsystems zu gewinnen. Insgesamt kann dieser Ansatz eine vielversprechende Zellquelle für Zelltherapien darstellen.

In-vivo-Osteo-Organoid-Ansatz zur Gewinnung therapeutischer hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen

Hier stellen wir Protokolle vor, die die Isolierung von Stromazellen aus murinem Knochen, Knochenmark, Thymus und menschlichem Thymusgewebe ermöglichen, die mit Einzelzell-Multiomics kompatibel sind.

Isolierung von Stromazellen aus hämatopoetischen Organen

Intrafemorale Injektionen ermöglichen die Transplantation einer kleinen Anzahl von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs), indem die Zellen direkt in der Knochenmarkhöhle platziert werden. Hier beschreiben wir ein experimentelles Protokoll zur intrafemoralen Injektion von humanen HSPCs in immundefiziente Mäuse.

Intrafemorale Injektion von humanen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen in immungeschwächte Mäuse 

Erfahren Sie die Isolierung und Transplantation hämatopoetischer Stammzellen in Mäusen. Diese Methode demonstriert erfolgreiche Aufreinigung und Injektionstechniken für die Stammzellforschung.

Isolierung und Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ)

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