Elektrospinnen Faserige Polymer Gerüste für Tissue Engineering und Cell Culture

Dieses Video zeigt das Elektrospinnen von Polymeren, eine verbreitete Technik in der Gewebeengineering- und Zellkulturforschung zur Herstellung faserförmiger Gerüste, die der Architektur und Größenskala der nativen extrazellulären Matrix nachempfunden sind. Hier elektrospinnen wir eine photoreaktive Hyaluronsäure, die durch Lichteinwirkung vernetzbar ist, und stellen weitere Verarbeitungsmöglichkeiten vor, wie beispielsweise die Fotomusterung – ein Verfahren, das Kanäle und Gerüste mit porösen Strukturen auf mehreren Skalen erzeugt, um die Zellinfiltration und Gewebeverteilung zu verbessern. Zusätzlich nutzen wir die Bildung von Mehrkomponenten-Polymergerüsten, die es ermöglichen, zwei verschiedene Polymere in einer einzigen Schicht zu elektrospinnen, wodurch die mechanischen Eigenschaften und der Abbau des Gerüsts angepasst sowie die Porosität für eine verbesserte Zellinfiltration gezielt gestaltet werden können.

Hallo, ich bin Jamie Kovi aus dem Labor von Jason Burdick am Department für Bioingenieurwesen der University of Pennsylvania. Hallo, ich bin Harini Swin, ebenfalls aus dem Burdick-Labor. Heute werden wir Ihnen ein Verfahren zur elektrostatischen Spinnung von Fasergeflechten für das Gewebeengineering zeigen.

Wir stellen außerdem die zusätzlichen Verarbeitungsmöglichkeiten der Fotomusterung und der Bildung von Mehrfachpolymergerüsten vor. In unserem Labor verwenden wir diese Verfahren, um HMSE-Zellinteraktionen und -infiltrationen in Hyaluronsäuregerüsten zu untersuchen. Wir nutzen diese Techniken ebenfalls mit verschiedenen anderen Polymeren, um faserverstärkte Gewebe wie den Meniskus und das Myokard zu erforschen.

Beginnen wir nun. Bereiten Sie eine 0,5-%-Gewichtslösung des Photoinitiators Irgacure 2959 oder I 2959 in entionisiertem Wasser vor, indem Sie ihn bei 37 Grad Celsius über mehrere Tage auflösen.

Ein I-Cure wird verwendet, wenn ein lichtreaktives Polymer für das Elektrospinnen benötigt wird. Um die Elektrospinn-Lösung herzustellen, 2 Gew.-% methylierte Hyaluronsäure oder MEHA, 3 Gew.-% Polyethylenglykol oder PEO und 0,05 Gew.-% I 2 9 5 9 in deionisiertem Wasser zu den Endkonzentrationen kombinieren, fünf Minuten lang verwirbeln und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Um die Lösung zu lösen, die Lösung in eine Spritze umfüllen und eine 18-Gauge-Nadel mit stumpfem Ende, sechs Zoll lang, am Ende anbringen.

Als Nächstes verwenden Sie eine Spritzenpumpe und stellen Sie diese auf eine Ausstoßgeschwindigkeit von 1,2 Milliliter pro Stunde ein. Führen Sie die Nadel der Spritzenpumpe in die Spritzenpumpe ein. Schließen Sie die geerdete Leitung einer Hochspannungsquelle an die Sammelvorrichtung an.

Bei diesem Verfahren verwenden wir einen Bolzen, der mit etwa 10 Metern pro Sekunde rotiert. Um ausgerichtete Fasern zu sammeln, verbinden Sie die positiv geladene Leitung mit der Nadel und justieren Sie die Nadel oder die Sammeleinrichtung so, dass ein Abstand von 15 Zentimetern zwischen beiden besteht. Starten Sie den Spritzenpumpenfluss, und sobald Flüssigkeit an der Nadelspitze sichtbar ist, schalten Sie die Stromquelle ein und stellen die Spannung auf 22 Kilovolt ein.

Sammeln Sie die Fasern so lange auf dem Gerüst, bis die gewünschte Dicke erreicht ist. Die Sammeldauer hängt von der gewünschten Dicke und dem verwendeten Volumen an Elektrospinnlösung ab. Für die Fotomusterung verwenden wir elektrogesponnene Matten, die 16 Stunden lang gesponnen wurden.

Entfernen Sie das Gerüst nach Beendigung der Sammlung aus der Sammelvorrichtung und lagern Sie es über Nacht unter Vakuum, um das Lösungsmittel vollständig zu entfernen. Schneiden Sie mit einer Schere Proben von fünf Millimeter mal fünf Millimeter aus dem Gerüstmatte aus. Legen Sie jedes Gerüst auf eine mit Folie bedeckte Objektträgerplatte, um es für die Vernetzung vorzubereiten, und platzieren Sie die Fotomaske direkt auf dem Gerüst, bedecken Sie es mit einer sauberen Glasplatte und befestigen Sie beide Enden der Platte mit Büroklammern.

Spülen Sie das Gerüst mithilfe einer Stickstoffkammer, um die durch Sauerstoffexposition verursachte Reduktion der Vernetzung zu verhindern. Stellen Sie die Gerüstanordnung für fünf Minuten in die Stickstoffkammer unter etwa 10 Milliwatt pro Quadratzentimeter 365 Nanometer Licht mit einem kollimierenden Adapter. Entfernen Sie jedes Gerüst und geben Sie es in eine 12-Loch-Gewebekulturplatte.

Geben Sie zwei Milliliter deionisiertes Wasser in jedes Gefäß. Profilieren Sie die Platte sorgfältig, um eine EVA-Verzerrung des Wassers zu verhindern, und stellen Sie sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Wechseln Sie das Wasser alle acht Stunden, indem Sie mit einer Vakuumpipette das deionisierte Wasser aus dem Gefäß zwischen den Waschungen absaugen.

Stellen Sie eine 5 %ige (Gewichtslösung) von PEO in 90 % Ethanol auf einem Heizgerät her. Rühren Sie zwei Stunden lang bei 700 U/min und 50 Grad Celsius vor dem Verfahren. Geben Sie nach dem Rühren DPI hinzu, um eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen.

Überführen Sie die PEO- und DPI-Lösung in eine Dreimilliliter-Spritze und wickeln Sie diese in Aluminiumfolie ein, um sie vor Licht zu schützen. Bereiten Sie anschließend die im zweiten Abschnitt beschriebene Elektrospinn-Lösung vor und geben Sie Methoxyethyl-Biocarbon-Mole-Rod-Domine B für eine Endkonzentration von 25 Mikromolar mit einer Mikropipette in eine Dreimilliliter-Spritze. Wickeln Sie diese ebenfalls in Aluminiumfolie ein, um sie vor Licht zu schützen.

Verwenden Sie vorsichtig Klebeband, um die Ränder von 22 Millimeter mal 22 Millimeter großen, methylierten Glasdeckgläsern an der Oberfläche des Mandrels zu befestigen, sodass die Deckgläser um den Mandrel-Umfang passen. Verbinden Sie ein fünf Millimeter langes Stück Silikonschlauch an einem Ende mit einer der Spritzen mit Luer-Lock-Anschlüssen. Befestigen Sie das andere Ende an einer Nadel, setzen Sie die Spritze in die Spritzenpumpe ein und führen Sie die Nadel durch das Loch im Lüfter.

Die Fanner übertragen die Länge des Dorns und dienen dazu, eine gleichmäßige Verteilung beider Polymere im resultierenden Gerüst sicherzustellen. Stellen Sie sicher, dass die Nadelspitzen für die Spritze mit MEHA mittig auf dem Dorn ausgerichtet sind. Positionieren Sie die Nadelspitze in einem Abstand von 15 Zentimetern zum Dorn und stellen Sie den Fanner auf einen Abstand von sechs Zentimetern zur Nadelspitze ein.

Programmieren Sie die Spritzenpumpe auf eine Fördergeschwindigkeit von 1,2 Millilitern pro Stunde und stellen Sie die Spannungsquelle auf 22 Kilovolt ein. Richten Sie die Spritze mit PEO auf genau dieselbe Weise ein, platzieren Sie jedoch die Nadelspitze in einem Abstand von 10 Zentimetern zum Wälzwerk und stellen Sie die Spannungsquelle auf 15 Kilovolt ein. Danach schalten Sie das Licht aus und schalten das Wälzwerk sowie die Spritzenpumpen ein.

Entfernen Sie die Aluminiumfolie von den Spritzen, sobald Flüssigkeit an den Spitzen beider Nadeln sichtbar ist. Schalten Sie gleichzeitig die Netzgeräte ein und stecken Sie die Lüfter ein, sobald die Sammlung abgeschlossen ist. Schalten Sie die Netzgeräte und die Spannrolle aus und ziehen Sie vorsichtig die Stecker der Lüfter heraus.

Entfernen Sie die Deckgläser und das Klebeband mit einem Rasiermesser. Die Fasern können an einem Fluoreszenzmikroskop mit Filtern für rumine und dpi sichtbar gemacht werden. Legen Sie jedes Deckglas mit dem angebrachten Elektrospinn-Polymer in eine einzelne Vertiefung einer Sechs-Vertiefungsplatte.

Schalenplatte: Inkubieren Sie die Scaffolds über Nacht in zwei Millilitern PBS, um eine vollständige Entfernung von Lösungsmittel und Verunreinigungen sicherzustellen. Nach 24 Stunden saugen Sie das PBS mithilfe eines Vakuums ab und stellen die Scaffolds unter eine keimabtötende UV-Lampe in einer laminarer Luftströmungskabine für 30 Minuten. Führen Sie zur Sterilisation eine Standardzellkultur durch und bereiten Sie eine konzentrierte Zellsuspension mit der gewünschten Zelldichte vor.

Verwenden Sie beispielsweise 100 Milliliter Zellsuspension für einen 22 mal 22 Millimeter großen Deckgläser. Eine Stunde im Inkubator platzieren. Die geeignete Menge Zellkulturmedium zu jedem hinzufügen.

Stellen Sie die Scaffolds zurück in den Inkubator. Färben Sie die Zellen mit einem kommerziell erhältlichen Live-Dead-Kit von Invitrogen, um die Zellen und Fasern mittels eines Fluoreszenzmikroskops mit Filtern für Trissy und Fitzy zu visualisieren, wie erwartet Scaffolds, die auf einer geerdeten flachen Platte gesammelt wurden. Erzeugen Sie zufällig verteilte Fasern, während Scaffolds auf einem rotierenden Dorn gesammelt werden.

Es entstehen ausgerichtete Fasern, die mittels Rasterelektronenmikroskopie sichtbar werden. Während der photochemischen Vernetzung des Gerüsts platzieren wir nach dem Eintauchen des Gerüsts in deionisiertes Wasser eine Fotomaske zwischen das Gerüst und die Lichtquelle. Die Bereiche, die vom Licht abgeschirmt sind, sowie das PEO werden entfernt, und wir beobachten die Bildung von Makroporen, wie aus der Fluoreszenzfärbung hervorgeht. Das gleichzeitige Elektrospinnen der MEHA- und PEO-Strahlen führt zu einem Verbundgerüst, das unterschiedliche Faserpopulationen aus den einzelnen Polymeren enthält.

Die HMCs scheinen positiv mit den Fasern zu interagieren. Sie bleiben nicht nur lebensfähig, wie die grüne Färbung zeigt, sondern orientieren sich offensichtlich derart, dass sie entlang der roten Fasern ausgerichtet sind. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man elektrogesponnene Faserscaffolds für das Gewebeengineering herstellt.

Wir haben außerdem zusätzliche Funktionen wie die Fotomusterung und das Elektrospinnen mit mehreren Polymeren eingeführt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Elektrospinnparameter jedes einzelnen Polymers zu optimieren, um gleichmäßige Fasern zu bilden, bevor weitere Experimente durchgeführt werden. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.