Isolierung und Reinigung von Drosophila Peripheren Neuronen durch Magnetic Bead Sorting

Drosophila-Larven, die ein neuronenspezifisches CD8-GFP-Fusionsreporter-Transgen tragen, werden zur Isolierung von DA-Neuronen verwendet. Die Larven werden durch Umstülpen des Cuticula nach außen disseziert, wodurch das periphere Nervensystem freigelegt wird. Die umgestülpten Larven werden einer enzymatischen Dissoziation unterzogen, gefolgt von einer mechanischen Dissoziation mittels Vortexen, Atonie und Downing.

Die Zellen werden anschließend filtriert, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten, die hauptsächlich epitheliale Zellen, Muskelzellen und Neuronen enthält. Antikörperbeschichtete magnetische Kügelchen werden der Zellsuspension zugegeben, wo sie an Neuronen binden, die das mit CD acht markierte GFP-Fusionsprotein exprimieren. Schließlich werden die mit magnetischen Kügelchen beschichteten Neuronen isoliert, indem die Lösung in ein starkes Magnetfeld gebracht wird, wodurch hochreine Populationen von Neuronen gewonnen werden.

Hallo, ich bin Dan Cox aus der Abteilung für Molekular- und Mikrobiologie am Krasno-Institut für fortgeschrittene Studien der George Mason University. Hallo, ich bin Ish AER aus dem Labor von Dr. Dan Cox. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von DLO-Periphereneuronen mittels magnetischer Bead-Sortierung.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die klassenspezifische und rechte Morphogenese regulieren. Beginnen wir also. Um dieses Verfahren zu starten, wählen Sie 30 bis 50 altersgerechte Larven im dritten Larvenstadium aus und geben Sie sie in ein 1,6-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das 1 bis 1,2 Milliliter 1×PBS enthält.

Schließen Sie das Röhrchen und wirbeln Sie es dreimal für jeweils eine Sekunde auf der maximalen Stufe. Verwerfen Sie mit einer flammenglasierten Pasteurpipette das Überstand vollständig. Geben Sie ein Milliliter PBS hinzu und wiederholen Sie die Wasch- und Wirbelvorgänge dreimal, bis der Überstand sichtbar frei von Nahrungsbestandteilen und Rückständen ist.

Wiederholen Sie den Waschschritt kurz mit einem Milliliter 70 %igem Ethanol. Anschließend waschen Sie die Larven zweimal mit je einem Milliliter zweifach destilliertem Wasser. Zum Schluss wiederholen Sie den Waschschritt nochmals mit einem Milliliter R nase away und dreimal mit je einem Milliliter zweifach destilliertem Wasser, um das RNA away vollständig zu entfernen. Die Larven sind nun bereit für die Präparation.

Platzieren Sie 10 bis 12 Larven in die Mitte einer mit einer Sill-Schutzbeschichtung versehenen 35-Millimeter-Petri-Schale. Positionieren Sie sie leicht voneinander entfernt und entsorgen Sie Larven, die nicht dem geeigneten Entwicklungsstadium anzugehören scheinen. Verwenden Sie anschließend ein Paar feiner Dissektions-Scheren, um die vordere Spitze der Larven mit einem stumpfen Dumont-Paar zu öffnen.

Nummer fünf, Pinzette. Stülpen Sie die Larven nach außen. Beginnen Sie damit, eine Pinzette vollständig bis zum hinteren Ende in die Larvenhaut einzuführen.

Die Spitzen der Pinzette zusammendrücken, um das hintere Ende der Cuticula zu erfassen. Es ist einfacher, wenn man die Cuticula auf der Oberfläche der Syl-Abdeckung nach unten drückt. Mit dem zweiten Paar Pinzetten schiebt man die larvale Cuticula nach innen.

Stellen Sie sicher, dass die Larven vollständig umgestülpt sind, sodass alle Weichgewebe der Lösung zur einfachen Dissoziation ausgesetzt sind. Üben Sie dies einige Male, bevor Sie versuchen, die Zellen zu dissoziieren. Nach der Dissektion von drei bis vier Larven überführen Sie diese umgehend in frisches, eiskaltes PBS in einem Mikrozentrifugenröhrchen.

Wiederholen Sie den Vorgang, bis die erforderlichen 30 bis 40 Larven gesammelt sind, bevor Sie mit der Entfernung unspezifischer Zellen fortfahren. Berücksichtigen Sie, dass jetzt, da alle Larven disseziert sind, ein Verlust von 10 bis 20 % während der Dissektion und Assoziation zu erwarten ist. Entfernen Sie locker anhaftende unspezifische Gewebe wie Fettkörper und Zellen des zentralen Nervensystems.

Indem man die snat der Röhre, die die invertierten Larvenhäute enthält, mit 700 bis 800 Mikrolitern frischer, eiskalter PBS ersetzt. Zuletzt kurz anwirbeln. Vortexen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen fünfmal je drei Sekunden bei voller Geschwindigkeit.

Danach die Überstände verwerfen und durch etwa 700 bis 800 Mikroliter frisches, eiskaltes PBS ersetzen. Diesen Schritt dreimal wiederholen und die Larvenhüllen schließlich in 400 Mikroliter frischem, eiskaltem PBS resuspendieren.

Kaltes PBS, bevor Sie mit der Dissoziation der Zellen fortfahren, um die dendritischen Verzweigungs- oder da-Larvenneuronen zu isolieren. Verwenden Sie eine Kombination aus enzymatischer und mechanischer Dissoziation. Achten Sie darauf, eine Überdissoziation zu vermeiden, da diese den Verlust des Zelloberflächenmarkers verursachen kann, was zu einer geringen Zellausbeute und niedrigen Zellviabilität führt.

Beginnen Sie die Dissoziation, indem Sie 1,5 µL einer Liase-Zyme-Drei-Lösung mit einer Aktivität von 28 Einheiten pro Fläschchen zu den in 400 µL PBS suspendierten Larvenhüllen hinzufügen. Vortexen Sie die Lösung zwei- bis dreimal für jeweils eine Sekunde auf höchster Stufe, um die locker haftenden Zellen von den Hüllen in die Lösung zu überführen.

Anschließend die Lösung fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Da die Inkubationszeit die endgültige Zellsortiereffizienz stark beeinflusst, sollte die Inkubationsphase am Ende nicht länger als 15 Minuten dauern.

Vortexen Sie das Röhrchen 20 bis 30 Mal mit voller Geschwindigkeit, jeweils zwei Sekunden pro Impuls. Dadurch sollten sich das Muskelgewebe und anderes unspezifisches Gewebe in Lösung lösen. Überprüfen Sie die Probe in regelmäßigen Abständen unter einem fluoreszenzfähigen Stereomikroskop, um festzustellen, ob die peripheren Neuronen noch am Cuticula angeheftet sind.

Überprüfen Sie eine kleine Probe der Lösung, indem Sie das Mikrozentrifugenröhrchen direkt unter einem fluoreszenzfähigen Stereomikroskop beobachten, um den Grad der Dissoziation zu bestimmen. Wiederholen Sie dies in jedem Schritt der Dissoziation und stoppen Sie das Vortexen, sobald die peripheren Neuronen sichtbar von der Larvenhaut in die Lösung übergehen. Waschen Sie die Larvenhüllen kurz mit zwei bis drei Wechseln je eines Milliliter frischer, eiskalter PBS.

Und abschließend die Resuspension: Suspendieren Sie sie in 500 Mikrolitern frischer, eiskalter PBS, die 1 % BSA enthält. Um mit der mechanischen Dissoziation der Zellen fortzufahren, verwenden Sie einen 2-Milliliter-Konti-Gewebehomogenisator mit einem Stößel mit großem Spalt und einer 1 %igen BSA-Lösung in PBS. Nach einer kurzen Spülung entsorgen Sie die BSA-Lösung.

Dadurch wird verhindert, dass die Larven-Cuticulae an den Glasoberflächen haften. Anschließend den Gewebemörser und den Stößel vorab für einige Minuten auf Eis abkühlen, um Zellschäden oder Zelllyse zu vermeiden. Danach die Cuticulae mit einer feuerpolierten Pasteurpipette in den Gewebemörser überführen.

Nun das Gewebe mit langsamen und gleichmäßigen Strichen nach unten bearbeiten, wobei Schaumbildung vermieden werden sollte, für etwa 20 bis 30 Striche. Achten Sie darauf, langsam und gleichmäßig nach unten zu führen. Andernfalls könnten die Zellen platzen.

Um die Zell-Dissociationsgrade zu beurteilen, wischen Sie die Wand des Gewehomogenisators mit einem sauberen Kim-Wipe-Tuch ab und untersuchen Sie unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop. Die Neuronen sollten sich von der Cuticula gelöst haben und in der Lösung sichtbar sein. Ein guter Hinweis auf eine erfolgreiche Zell-Dissociation ist das Fehlen von Neuronen an der larvalen Cuticula.

Wenn jedoch weiterhin Neuronen an der Cuticula haften oder in vollständig dissoziierten Zellen beobachtet werden, pipettieren Sie weiter, bis die Zellen eine Einzelzell-Suspension bilden. Setzen Sie die mechanische Dissoziation mit einer an der Flamme geglätteten Pipette fort. Verengen Sie die Spitze auf etwa 50 % des Standarddurchmessers und pipettieren Sie die Lösung fünfmal, gefolgt von zehnmal mit einer an der Flamme geglätteten Pipette.

Verengen Sie die Spitze auf etwa 25 % des Standarddurchmessers. Beachten Sie, dass eine heftige Rotation die Zellen beschädigen kann. Überwachen Sie die Zellen zwischen den Schritten und passen Sie das Verfahren entsprechend an.

Filtern Sie die Lösung abschließend durch einen 30-Mikrometer-Zellfilter und sammeln Sie das Zellfiltrat in einem 1,6-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Die resultierende Lösung sollte eine Einzelzell-Suspension darstellen und ist nun bereit für die magnetische Zellsortierung. Magnetische Kügelchen, beschichtet mit einem Anti-CD8-Antikörper.

Wurden wie in dem begleitenden schriftlichen Protokoll beschrieben hergestellt, und die DA-Neurone exprimieren ein CD8-GFP-Fusionsprotein, das durch den Antikörper gezielt erkannt wird. Beginnen Sie die Zellsortierung, indem Sie 15 µL mit Antikörper beschichtete magnetische Kügelchen zu 500 µL Zellsuspension hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen mit den mit Antikörper beschichteten magnetischen Kügelchen 30 bis 60 Minuten auf Eis mit gelegentlichem manuellem Mischen; eine Inkubation bei höherer Temperatur oder über eine längere Dauer kann zu unspezifischer Antikörperbindung führen.

Als Nächstes setzen Sie das Mikro-Huge-Röhrchen zwei Minuten lang einem starken Magnetfeld aus. Alle positiv selektierten Zellen zusammen mit den nicht gebundenen Perlen lagern sich an der Röhrchenwand an. Aspirieren Sie langsam den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören, und waschen Sie die Zellen drei bis viermal mit frischem, eiskaltem PBS. Dieser Schritt entfernt alle verbleibenden unspezifisch gebundenen Zellen.

Schließlich die Zellen in 30 Mikrolitern frischem, eiskaltem PBS resuspendieren, um Reinheit und Ausbeute der Zellen zu bestimmen. Fünf Mikroliter der Zellsuspension auf die polierte Oberfläche eines Hämozytometers pipettieren und alle sichtbaren fluoreszierenden Zellen unter einem fluoreszenzmikroskopischen Stereomikroskop zählen. Außerdem die Menge an nicht fluoreszierenden Zellen und eventuelle Anzeichen von Verunreinigungen überprüfen.

In der Regel ist die Probe stark angereichert an fluoreszierenden Zellen. Verwenden Sie abschließend das pico pure RNA-Isolationskit, um RNA aus den an die Perlen gebundenen Zellen zu isolieren. Geben Sie den Extraktionspuffer zu den sortierten Zellen hinzu, entfernen Sie jedoch die Perlen mithilfe eines Magneten vor dem Säulenaufreinigungsschritt. Verwenden Sie ein Mikroliter der extrahierten RNA, um die Gesamt-RNA-Qualität auf einem Agilent Bioanalyzer 2100 zu bewerten.

Die aus den isolierten DA-Neuronen gewonnene RNA weist eine ausgezeichnete Qualität auf, wie durch die Anwesenheit scharfer 5,8S- und 28S-Ribosomen-RNA-Peaks bei der Analyse auf einem Agilent 2100 Bioanalyzer gezeigt wurde. Beginnend mit Larven des 30. bis 43. Sterntags konnten wir durchschnittlich 300 bis 500 DA-Neuronen der Klasse vier unter Verwendung des PPK-Gal4-Treibers sowie 1500 bis 2000 DA-Neuronen der Klassen 1, 2, 3 und 4 isolieren. Mithilfe eines PAN-Neuron-spezifischen Gal4-Treibers ermöglichte die quantitative RT-PCR mit L11-fch, das neuronenspezifische Marker darstellen, eine signifikante Anreicherung beider Gene, was auf eine hohe Spezifität der Anreicherung von DA-Neuronen mittels des hier demonstrierten Protokolls im Vergleich zum Durchfluss hinweist. Schließlich wurde die isolierte RNA sowohl aus PAN-Neuronen als auch aus DA-Neuronen der Klasse vier verwendet, um transkriptionelle Expressionsprofile mittels Agilent Drosophila melanogaster Oligo-Mikroarrays für das gesamte Genom zu erstellen, wodurch zahlreiche Faktoren identifiziert wurden, die an der Morphogenese der DA-Neuronen beteiligt sind.

Wir haben Ihnen gezeigt, wie man Drosophila-Peripheroneurone mittels magnetischer Zellseparation aus dem dritten Larvenentwicklungsstadium isoliert und reinigt. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die enzymatischen und mechanischen Dissoziationsschritte auszugleichen. Eine übermäßige enzymatische Dissoziation kann zum Abbau der CD8-Oberflächenmarker führen, was eine ineffiziente oder fehlgeschlagene Zellsortierung zur Folge haben kann.

Es ist außerdem wichtig, während des gesamten Verfahrens RNA-freie Bedingungen aufrechtzuerhalten, um die Integrität der gereinigten RNA aus den isolierten Neuronen zu bewahren. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.