Name: Isolierung und Reinigung von Drosophila Peripheren Neuronen durch Magnetic Bead Sorting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-01T14:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Lernen Sie die Isolierung peripherer Neuronen von Drosophila-Larven durch magnetische Bead-Sortierung. Diese Methode ermöglicht die Gewinnung hochreiner Neuronenpopulationen für RNA-Analysen und mikroarraybasierte Studien.

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Wir danken Drs. Yuh-Nung Jan und Wes Grueber für die Bereitstellung von fly Aktien in dieser Studie verwendet. Die Autoren danken Thomas F. und Kate Miller Jeffress Memorial Trust für die Unterstützung dieser Forschung (DNC) und der George Mason University Provost Büro (EPRI).

Allgemeine Kommentare zu Magnetic Bead Sortieren von Drosophila peripheren Neuronen (Total Timing für die Fertigstellung des Protokolls: 2.5-3 Stunden) Standard-Laborverfahren für die Beibehaltung einer sauberen, RNAse freien Umgebung muss jederzeit beobachtet werden, um RNA-Abbau zu verhindern. Wenn der Drosophila Larvencuticula seziert wird und in der Zelle Dissoziationspuffer, sind die peripheren Neuronen eines der letzten Zellen aus der Oberhaut zu lösen. Wir haben diese Eigenschaft genutzt und entwickelt dieses Protokoll, um die meisten der nicht-spezifischen Zellen aus der Oberhaut, wie Muskel-und Fett vor dem Isolieren der da Neuronen zu entfernen. Mit etwas Übung kann das gesamte Protokoll erfolgreich in ca. 2,5 Stunden abgeschlossen sein. Die Herstellung von Antikörper-beschichteten Kügelchen müssen abgeschlossen sein, bevor das Experiment beginnt. 1. Vorbereitung Magnetic Beads zur Bindung Cells: Dieser Schritt muss vor dem Start des Experiments abgeschlossen sein. Die vorbereiteten Kugeln können hergestellt und bei 4 ° C gelagert werden, bis sie benötigt. <ol><li> Wash 100 ul der Dynabeads M-280 Streptavidin beschichteten Beads dreimal in PBS durch Resuspendieren in 500 ml frisches PBS und Pelletierung es in einem starken Magnetfeld jeder Zeit. </li><li> Schließlich resuspendieren die Perlen direkt in 100 ul unverdünnter biotinylierten Ratte anti-Maus-CD8a Antikörper (Antikörper-Konzentration von 100 pg / ml). </li><li> Inkubieren Sie die Mischung für 1 Stunde auf Eis mit gelegentlichem leichten Verwirbelung zur Sedimentation zu verhindern. [1 ul Dynabeads M-280 binden können 0,05-0,10 pg biotinylierte Antikörper]. </li><li> Waschen Sie die Bead-Antikörper-Gemisch dreimal wie in Schritt 1.1 beschrieben, um die überschüssige Antikörper zu entfernen. Die magnetischen Beads werden jetzt mit Antikörper beschichtet und zur Verwendung bereit. Bewahren Sie die Bead-Antikörper-Gemisch in 100 ul 1X PBS bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 2. Auswählen und Washing Larven: (10-15 Minuten) <ol><li> Nehmen 30-50 Jahren abgestimmt dritten Larvenstadium und legen Sie sie in einem 1,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 1-1,2 ml 1X Phosphate Buffered Saline (PBS). (3-5 Minuten) </li><li> Schließen Sie den Schlauch und Wirbel es bei maximaler Einstellung dreimal für jeweils 1 Sekunde. </li><li> Mit einem feuerpolierte Pasteurpipette den Überstand verwerfen komplett. Wiederholen Sie die Wäsche (2,1) und Vortex (2,2) die Schritte 3-4 Mal, bis der Überstand wird sichtbar frei von jeglichen Speisen Partikel und Ablagerungen. </li><li> Kurz wiederholen Sie die Wäsche mit 1 ml 70% Ethanol und den Überstand verwerfen. </li><li> Waschen Sie die Larven zweimal mit 1 ml ddH2O und den Überstand verwerfen. </li><li> Kurz wiederholen Sie die Wäsche noch einmal mit 1 ml RNase-AWAY und den Überstand verwerfen. </li><li> Waschen Sie die Larven dreimal in 1 ml ddH2O um die vollständige Entfernung von RNase-AWAY zu gewährleisten. </li></ol> 3. Dissection: (10-12 Minuten) <ol><li> Legen 10-12 Larven auf die Mitte eines Sylgard beschichtet 35mm Petrischale. Positionieren Sie sie leicht von einander entfernt. [Critical Schritt: Entsorgen Sie alle Larven, die scheinbar nicht auf der entsprechenden Entwicklungsstufe werden] </li><li> Schneiden Sie die vordere Spitze der Larven mit einer feinen Sezierung Schere für alle die Larven. </li><li> Mit ein paar dumpfe Dumont Nr. 5 Pinzette invertieren die Larven von innen nach außen. Stecken Sie ein ForceP im Larvencuticula den ganzen Weg bis zum hinteren Ende. Pinch die Spitzen der Zange zusammen, um das hintere Ende der Kutikula (Abbildung 1a) (versuchen Sie die Nagelhaut auf den Sylgard Oberfläche zu erleichtern) zu greifen. Mit der zweiten Pinzette, drücken Sie die Larvencuticula innen nach außen. [Critical Schritt: Versuchen Sie praktizieren diese Methode ein paar Mal, bevor die Zelle isoliert Experiment. Versuchen Sie, die Larven vollständig invertiert zu bekommen, um sicherzustellen, dass alle Weichteile, die Lösung für eine einfache Dissoziation ausgesetzt.] </li><li> Nach Sezieren 3-4 Larven, übertragen Sie sie sofort an die frische, eiskalte PBS (statt der Röhre auf Eis) in ein 1,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,1 bis 3,4, bis alle benötigten Larven gesammelt werden (30-40 Larven in diesem Protokoll). [Critical Schritt:. Antizipieren 10-20% Verlust beim Präparieren und Dissoziation, und entsprechend zu planen] </li></ol> 4. Entfernung von lose anhaftenden unspezifische Zellen: (2-3 Minuten) [Dieser Schritt hilft bei der Räumung von lose anhaftenden unspezifische Gewebe wie Fett Organe und ZNS.] <ol><li> Nehmen Sie die 1,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit dem invertierten larvalen Kutikula und ersetzen Sie den Überstand mit etwa 700-800 ml frisches eiskaltes PBS. </li><li> Pulse-Wirbel der Mikrozentrifugenröhrchen 5 mal (3 Sekunden pro Puls) bei voller Geschwindigkeit. </li><li> Überstand verwerfen und ersetzen Sie es mit etwa 700-800 ul frischem, eiskaltem PBS. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.2 und 4.3 dreimal. </li><li> Resuspend der larvalen Kutikula in 400 ml frisches, eiskaltes PBS </li></ol> 5. Distanziert das Gewebe in einem einzigen Zellsuspension: (18-20 Minuten) [Critical Schritt: Over-Dissoziation kann der Verlust der Zell-Oberflächenmarker was zu einer schlechten Zelle Ausbeute und geringe Lebensfähigkeit der Zellen verursachen. Die Larven Gewebe kann entweder durch mechanische Dissoziation (Beschallung, douncing), enzymatische Dissoziation (Trypsin, Collagenase etc.) oder eine Kombination von beiden trennen. Da diese Larven Gewebe schwer zu distanzieren sind, fanden wir, dass eine Kombination von mechanischen und enzymatischen Dissoziation die besten Ergebnisse erzielt.] <ol><li> Add 1,5 ul 1X Liberase Blendzyme 3 (28 W nsch Einheiten / Durchstechflasche), die Larvencuticula in 400 ul PBS suspendiert. </li><li> Vortex die Lösung 2-3 mal für jeweils 1 Sekunde bei maximaler Einstellung (Dies sollte die lose anhaftenden Zellen aus der Oberhaut in die Lösung zu entfernen). </li><li> Inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur (22-25 ° C) für 5 Minuten. [Entscheidender Schritt: Die Inkubationszeit großen Einfluss auf die endgültige cell sorting Effizienz. Die empfohlene Inkubationszeit sollte ausreichen, zur Auflockerung des Gewebes. Nicht mehr als 15 Minuten.] </li><li> Pulse-Wirbel der Röhre 20-30 mal bei maximalen Einstellungen für 2 Sekunden pro Puls auf Hochtouren. Dies sollte löst die Muskulatur und andere Gewebe in die Lösung. Überprüfen Sie einen kleinen Auszug aus der Lösung unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop bei jedem Schritt. (Mit der Erfahrung sollte man in der Lage sein auf das Niveau der Dissoziation zu bestimmen durch die Beobachtung der Mikrozentrifugenröhrchen direkt unter einem Fluoreszenz-fähigen Stereo-Mikroskop) </li><li> Waschen Sie die Larven Nagelhaut 2-3 mal mit frischem, eiskaltem PBS resuspendieren und schließlich sie in 500 ml frisches, eiskaltes PBS mit 1% BSA. </li><li> Um zu vermeiden, die Larvencuticula Festhalten an der Glasoberfläche der 2 ml Kontes Gewebe Mühle und großer Freiraum Stößel, pre-coat das Gewebe Mühle und Mörser mit einem 1% BSA in PBS-Lösung und nach einem kurzen Spülen verwerfen BSA-Lösung. Anschließend mit einem feuerpolierte Pasteurpipette, übertragen Sie die Nagelhaut mit Schritt 5.5 die BSA-beschichtete Gewebe Mahlwerk. [Critical Schritt: Pre-cool das Gewebe Schleifer / Stößel, indem Sie sie auf Eis für ein paar Minuten zu Zellschädigungen / Lyse verhindern]. </li><li> Dounce das Gewebe mit langsamen und gleichmäßigen Strichen, die Vermeidung Aufschäumdüse (ca. 20-30 Schläge). [Critical Schritt:. Dounce langsam und stetig, sonst können die Zellen zu lysieren] </li><li> Zur Beurteilung der Zell-Dissoziation Ebenen, wischen Sie die Außenwand des Gewebes Mahlwerk mit einem sauberen Kimwipe Gewebe, und untersuchen Sie ihn unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Die Neuronen sollte die Nagelhaut abgelöst haben, und können in der Lösung gesehen werden. Wenn diese gefunden wird schwierig sein, alternativ Pipette eine kleine Probe der Lösung, und beobachten Sie es unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Ein guter Indikator für Zelle Dissoziation ist die Abwesenheit von Neuronen aus dem Larvencuticula. Allerdings, wenn man noch beachtet Neuronen an der Nagelhaut oder beobachtet unvollständig dissoziierten Zellen, weitere Dounce, bis die Zellen erreichen einen einzigen Zellsuspension. </li><li> Man reibt die Lösung 5 mal mit einer Schusskraft-polierten Pasteurpipette verringerte sich auf etwa 50% der Standard-Spitzendurchmesser, gefolgt von 10 mal mit einer Schusskraft-polierten Pasteurpipette verringerte sich auf rund 25% der Standard-Durchmesser. [Critical Schritt: Kraftvoller Verreibung können die Zellen schädigen. Überwachen Sie die Zellen zwischen den Schritten, und passen Sie das Verfahren entsprechend]. </li><li> Filter die Lösung durch ein 30 pm Zellfilter und sammeln Sie die Zelle Filtrat in einem 1,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Die resultierende Lösung sollte aus einem einzigen Zellsuspension bestehen und ist nun bereit für die magnetische Zellsortierung. </li></ol> 6. Magnetic Bead Cell Sorting: (45 bis 75 Minuten, abhängig von Antikörper-Inkubationszeit) <ol><li> Add 15 ul Antikörper-beschichteten magnetischen Kügelchen zu 500 ul Zellsuspension (Schritt 5,10). Die restlichen Antikörper, konjugiert magnetische Kügelchen können gespeichert werden, bis für die nachfolgende Zelle Isolierungen benötigt werden. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen mit Antikörper-beschichteten magnetischen Kügelchen für 30-60 Minuten auf Eis mit gelegentlichen Hand-Mischen. [Critical Schritt: Inkubation bei einer höheren Temperatur oder längere Zeit kann in nicht-spezifische Antikörper-Bindung führen.] </li><li> Legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen in einem starken Magnetfeld für 2 Minuten. Alle positiv selektierten Zellen zusammen mit ungebundenen Perlen werden auf die Seite des Rohres zu trennen. </li><li> Langsam Pipette der Überstand, was sicher nicht das Zellpellet zu stören. </li><li> Waschen Sie die Zellen 3-4 mal in frischem, eiskaltem PBS, um alle verbleibenden nicht-spezifische Zellen zu entfernen. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 30 ml frisches, eiskaltes PBS. </li><li> Zur Angleichung der Reinheit und Ausbeute der Zellen, Pipette 5 ul der Zelle suspension auf der polierten Oberfläche einer Zählkammer und zählen alle sichtbaren fluoreszierenden Zellen unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Überprüfen Sie auch die Menge an nicht-fluoreszierenden Zellen und keine Anzeichen von Verunreinigungen. Typischerweise wird die Probe in hohem Grade für fluoreszierende Zellen angereichert werden. </li></ol> 7. RNA Isolation aus Magnetic Bead sortierten Zellen: (60 bis 75 Minuten) <ol><li> Nach dem Zählen Pellet die Zellen in einem Magnetfeld, den Überstand verwerfen und mit 20 ul Extraktionspuffer aus dem PicoPure ™ RNA Isolation Kit (Molecular Devices). Je nach Zellzahl, den Sie benötigen, um ein höheres Volumen Extraktionspuffer hinzuzufügen. </li><li> Vortex das Rohr bei maximaler Geschwindigkeit, damit die Vermischung von Zellpellet mit Extraktionspuffer. </li><li> Inkubieren Sie die Röhrchen bei 42 ° C für 30 Minuten. </li><li> Um sicherzustellen, Entfernung der magnetischen Kügelchen vor der Spalte Reinigung der RNA (siehe Schritt 7.5) wird das Rohr kurz auf 2.000 (x) g für 2 Minuten auf Pellet die magnetischen Kügelchen zentrifugiert. Das Rohr wird dann in einem starken Magnetfeld, das Pellet bewahren gelegt, und der Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. </li><li> Extrahieren und Spalte reinigen die RNA nach dem PicoPure RNA-Extraktion-Kit des Herstellers. DNAse Behandlung ist optional und kann auf der Säule während der RNA-Reinigung werden nach der Analyse Anforderung durchgeführt. Schließlich eluieren die gebundenen Gesamt-RNA in einem kleinen Volumen (11-30 ul) Elutionspuffer und bei -80 ° C bis zur Verwendung. Auf Wunsch eine 1 ul-Aliquot verwendet werden, um Gesamt-RNA Qualität auf einem Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.) zu beurteilen. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Magnetic Bead-Sortierung verwendet wurde, um Drosophila da Neuronen (Abbildung 1) zu isolieren. Die RNA aus diesen isoliert da Neuronen (Abbildung 2a) gereinigt wurde festgestellt, dass von ausgezeichneter Qualität sein, wie durch das Vorhandensein von scharfen 5.8S, 18S und 28S ribosomalen RNA Spitzen angezeigt, wenn auf einem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) analysiert ( Abbildung 2b). Beginnend mit 30-40 dritten Larvenstadium waren wir in der Lage zu isolieren durchschnittlich 300-500 Klasse-IV da Neuronen mit der PPK-GAL4 Treiber und 1500-2000 da Neuronen (Class I, II, III &amp; IV) mit dem pan- da Neuronen-spezifische GAL4 21-7 Fahrer. Zur Beurteilung der neuronal-spezifische Anreicherung unserer isolierten Zellen führten wir quantitative reverse Transkription PCR (qRT-PCR) mit zwei neuronalen Gen-spezifische Marker (Elav und futsch). Diese Analysen zeigten signifikante fache Anreicherung der beiden Markergene was auf eine sehr spezifische Bereicherung für da Neuronen fließen durch den Einsatz unseres Protokolls (Abbildung 3) verglichen. Schließlich wurde die isolierte RNA aus beiden pan-da Neuronen und Klasse-IV da Neuronen zur transkriptionellen Expression Profiling auf Agilent Drosophila melanogaster gesamten Genoms Oligo-Microarrays (4 x 44K) (Abbildung 4) durchzuführen. Diese Analysen wurden zahlreiche zuvor verwickelt Regulatoren da Neuron Dendriten Morphogenese neben einem breiten Spektrum von bisher nicht charakterisierter Moleküle und vermeintlichen Signaltransduktionswege, die möglicherweise spielen eine wichtige funktionelle Rolle in da Neuron Entwicklung. Studien entwickelt, um die potenzielle Rolle (n) dieser bisher nicht charakterisierter Moleküle bei der Vermittlung da Neuron Entwicklung, insbesondere Dendriten Morphogenese zu beurteilen, sind derzeit im Gange. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure1tmb.jpg" border="0" /> Abbildung 1:. Schematische Darstellung des Magnetic-Bead-Sortierung von Drosophila da Neuronen (a) Alter abgestimmt dritten Larvenstadium mit dem da Neuronen-spezifische GAL4, UAS-mCD8-GFP-Reporter-Transgen sind durch Umkehrung der Larvencuticula inside-out, um das Expose seziert PNS zur Dissoziation Puffer und in eiskaltem PBS gespeichert. (b) Enzymatische Dissoziation erfolgt durch Zugabe von Liberase Blendzyme 3, um die Lösung mit Larvencuticula durchgeführt. (c) Die Larven Gewebe sind weitere dissoziiert durch eine Kombination aus Verwirbelung, Zerreiben und douncing Nicht-spezifisch markierten Gewebe wie Fett-Organe, Darm und ZNS. (d, e) Die Zellen werden dann gefiltert mit einem 30 pm Zelle Filter zu entfernen. Die Lösung enthält eine einzige Zellsuspension von verschiedenen Zelltypen, einschließlich Epithelien, Muskel-und Nervenzellen. (F) Anti-Maus-Antikörper beschichtet CD8a Dynabeads M-280 sind zur Zellsuspension hinzugefügt und auf Eis inkubiert für 30-60 Minuten. ( g) Das magnetische Kügelchen bindet an die da Neuronen, die Ausdruck einer Maus CD8 getaggt GFP Fusionsprotein. (h, i) Die Magnetic-Bead-beschichteten Zellen, indem die Lösung in einem starken Magnetfeld getrennt sind. Der Überstand wird verworfen und die Zellen dreimal gewaschen, um alle verbleibenden nicht-spezifischen Zellen zu entfernen, was in (j) highly gereinigt Populationen von Neuronen da. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure1.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure2tmb.jpg" border="0" /> Abbildung 2: (a) Repräsentative Bild von positiv selektierten, GFP Fluoreszenz-Klasse-IV da Neuronen durch Zell-Dissoziation und Magnetic-Bead-Sortierung isoliert. Die daraus resultierende Population von Neuronen war fest entschlossen, in hohem Grade für Klasse-IV da Neuronen werden mit wenig oder keiner Kontamination Zelle Verunreinigungen angereichert. (B) Ein Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) Elektropherogramm Gesamt-RNA aus magnetischen Beads sortiert da Neuronen isoliert und zeigt eine ausgezeichnete Gesamt-RNA Qualität als durch die Anwesenheit von 5.8S, 18S und 28S rRNA angegeben. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure2.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure3.jpg" border="0" /> Abbildung 3: qRT-PCR-Analyse von neuronalen Marker Genexpression in isolierten da Neuronen (GAL421-7, UAS-mCD8-GFP) und der Durchfluss durch-Fraktion wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt. Die Expression der beiden neuronal-spezifischen Markergene (Elav und futsch) wurden durch qRT-PCR untersucht. Die Werte aus diesen Analysen gewonnen wurden, um die endogene Kontrolle (rp49) normalisiert, und das Niveau im Vergleich zu denen in Durchströmung Bruchteil beobachtet wurden unter Zugrundelegung der ΔΔCτ Methode 6. Beide Elav und futsch waren deutlich in der isolierten da Neuronenpopulation angereichert, um den Fluss durch Bruchteil verglichen. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure4tmb.jpg" border="0" /> Abbildung 4: Repräsentative Klasse-IV da Neuronen-spezifische Cy3 markiert Microarray-Image-Datei. Abgebildet ist ein Agilent Drosophila melanogaster gesamten Genoms Oligo-Microarray (4 x 44K) mit Cy3-labeld Gesamt-RNA aus Klasse-IV da Neuronen durch Magnetic-Bead-Sortierung gereinigt isoliert hybridisiert. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure4.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 4 zu sehen.

<ol><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li>
<li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+that+regulate+establishment%2C+maintenance%2C+and+remodeling+of+dendritic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
</ol>

Das Protokoll hier vorgestellten ist für die Isolierung und Aufreinigung von peripheren Neuronen, die eng an die innere Oberfläche der Drosophila dritten Larvenstadium Larvencuticula mit einer Magnetic-Bead-cell sorting Strategie festhalten optimiert. Während wir dieses Protokoll verwendet haben, um gezielt zu isolieren Drosophila da Neuronen, Anwendungen dieses Protokoll, um die Isolation von anderen Zelltypen, die die Kutikula in Larven-oder Puppenstadium Entwicklungsstadien haften (zB Epithelien, Muskeln, andere peri...

Ausstattung <ul><li> (10) Neodym-Magneten Block (K &amp; J Magnetics, Inc., Cat. # B444B), alternativ Dynamag ™ -2 (Invitrogen, Cat. Nr. 123-21D) verwendet werden. </li><li> Kontes Glass Tissue Grinder, 2 ml Arbeitsfähigkeit, mit großem Abstand Stößel (Kat. Nr. 885300-0002) </li><li> Zell-Filter, z. B. MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, Cat. # 130-041-407) </li><li> 35 mm Petrischalen mit Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. # 3097358 bis 1004) beschichtet </li><li> Dissecting Werkzeuge: zwei Paare von Dumont Nr. 5 Pinzetten (Fine Science Tools, Kat. Nr. 11251-20.) </li><li> Vannas Frühjahr Mikrodissektion Schere (Fine Science Tools, Cat. # 15000-08) </li><li> Pipetten (P-1000, P-100, P-10) mit Einwegspitzen </li><li> Standard-Zählkammer die Zellen und schätzen Reinheit zählen </li><li> Pasteurpipetten mit Feuer polierte Spitzen von Standard-Durchmesser verengt, um ~ 50% der Standard-Durchmesser und verengt auf ~ 25% der Standard-Durchmesser für Verreibung </li><li> Tischplatte Mikro-Zentrifuge (1-16,000 (x) g) </li><li> Wirbel </li><li> Fluorescent Stereo-Mikroskop (Leica MZ16FA wurde in diesem Protokoll) </li></ul>

isolierung und reinigung von drosophila peripheren neuronen durch magnetic bead sorting

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Die<em&gt; Drosophila</em&gt; Peripheren Nervensystem (PNS) ist ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung der komplexen Prozesse der neuronalen Entwicklung und Dendriten Morphogenese bei der funktionalen und molekularer Ebene. Zur Unterstützung bei diesen Analysen haben wir eine Strategie für die Isolierung von einer Unterklasse von PNS Neuronen so genannten dendritischen Verzweigung (da) Neuronen, die in großem Umfang für das Studium Dendriten Morphogenese verwendet entwickelt<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Diese Neuronen sind sehr schwierig, da eine reine Population isoliert, zum Teil aufgrund ihrer extrem geringen Vorkommens und ihrer schwer zu erreichen Lage direkt unterhalb der harten Chitinpanzer Larvencuticula. Unsere neu entwickelte Verfahren überwindet diese Herausforderungen, und ist auf eine schnelle und spezifische Anreicherung von Zellen mit Antikörper-beschichteten magnetischen Kügelchen auf. Für unsere Magnetic-Bead-Sortier-Studien haben wir altersmäßig angepassten dritten Larvenstadium eingesetzt Ausdruck einer Maus CD8 getaggt GFP-Fusionsprotein (<em&gt; FH-mCD8-GFP</em&gt;)<sup&gt; 3</sup&gt; Unter der Kontrolle von entweder der Klasse IV dendritische Verzweigung (da) Neuronen-spezifische<em&gt; Taschendieb (PPK)-GAL4</em&gt; Fahrer<sup&gt; 4</sup&gt; Oder die Steuerung der pan-da Neuronen-spezifische GAL4<sup&gt; 21-7</sup&gt; Fahrer<sup&gt; 5</sup&gt;. Obwohl dieses Protokoll für die Isolierung von PNS-Zellen, die an der Innenwand des Larvencuticula befestigt sind, durch die Variation einiger Parameter optimiert wurden, konnte das gleiche Protokoll verwendet, um viele verschiedene Zelltypen an der Nagelhaut an Larven oder Puppen Phasen zu isolieren Entwicklung (z. B. Epithelien, Muskel-, oenocytes etc.) oder andere Zelltypen aus Larvenorgane abhängig von der GAL4-spezifischen Treiber Expressionsmuster. Die RNA durch diese Methode isoliert ist von hoher Qualität und kann ohne weiteres für nachgeschaltete genomische Analysen wie Microarray Gene Expression Profiling Studien verwendet werden. Dieser Ansatz bietet ein leistungsstarkes neues Werkzeug, um Untersuchungen an isolierten durchführen<em&gt; Drosophila</em&gt; Dendritische Verzweigung (da) Neuronen wodurch neue Einblicke in die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen Dendriten Morphogenese.

In diesem Video-Artikel präsentieren wir ein Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Peripheren Neuronen mit einem schnellen Magnetic Bead Zellsorting Strategie. RNA aus den isolierten Zellen erhalten kann ohne weiteres für nachgelagerte Anwendungen einschließlich Microarray-Analysen verwendet werden.

Isolierung und Reinigung von Drosophila Peripheren Neuronen durch Magnetic Bead Sorting

Das periphere Nervensystem (PNS) von Drosophila ist ein leistungsfähiges Modell zur Untersuchung der komplexen Prozesse der neuronalen Entwicklung und der Dendriten...

Drosophila-Larven, die ein neuronenspezifisches CD8-GFP-Fusionsreporter-Transgen tragen, werden zur Isolierung von DA-Neuronen verwendet. Die Larven werden durch Umstülpen des Cuticula nach außen disseziert, wodurch das periphere Nervensystem freigelegt wird. Die umgestülpten Larven werden einer enzymatischen Dissoziation unterzogen, gefolgt von einer mechanischen Dissoziation mittels Vortexen, Atonie und Downing.Die Zellen werden anschließend filtriert, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten, die hauptsächlich epitheliale Zellen, Muskelzellen und Neuronen enthält. Antikörperbeschichtete magnetische Kügelchen werden der Zellsuspension zugegeben, wo sie an Neuronen binden, die das mit CD acht markierte GFP-Fusionsprotein exprimieren. Schließlich werden die mit magnetischen Kügelchen beschichteten Neuronen isoliert, indem die Lösung in ein starkes Magnetfeld gebracht wird, wodurch hochreine Populationen von Neuronen gewonnen werden.Hallo, ich bin Dan Cox aus der Abteilung für Molekular- und Mikrobiologie am Krasno-Institut für fortgeschrittene Studien der George Mason University. Hallo, ich bin Ish AER aus dem Labor von Dr. Dan Cox. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von DLO-Periphereneuronen mittels magnetischer Bead-Sortierung.Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die klassenspezifische und rechte Morphogenese regulieren. Beginnen wir also. Um dieses Verfahren zu starten, wählen Sie 30 bis 50 altersgerechte Larven im dritten Larvenstadium aus und geben Sie sie in ein 1,6-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das 1 bis 1,2 Milliliter 1×PBS enthält.Schließen Sie das Röhrchen und wirbeln Sie es dreimal für jeweils eine Sekunde auf der maximalen Stufe. Verwerfen Sie mit einer flammenglasierten Pasteurpipette das Überstand vollständig. Geben Sie ein Milliliter PBS hinzu und wiederholen Sie die Wasch- und Wirbelvorgänge dreimal, bis der Überstand sichtbar frei von Nahrungsbestandteilen und Rückständen ist.Wiederholen Sie den Waschschritt kurz mit einem Milliliter 70 %igem Ethanol. Anschließend waschen Sie die Larven zweimal mit je einem Milliliter zweifach destilliertem Wasser. Zum Schluss wiederholen Sie den Waschschritt nochmals mit einem Milliliter R nase away und dreimal mit je einem Milliliter zweifach destilliertem Wasser, um das RNA away vollständig zu entfernen. Die Larven sind nun bereit für die Präparation.Platzieren Sie 10 bis 12 Larven in die Mitte einer mit einer Sill-Schutzbeschichtung versehenen 35-Millimeter-Petri-Schale. Positionieren Sie sie leicht voneinander entfernt und entsorgen Sie Larven, die nicht dem geeigneten Entwicklungsstadium anzugehören scheinen. Verwenden Sie anschließend ein Paar feiner Dissektions-Scheren, um die vordere Spitze der Larven mit einem stumpfen Dumont-Paar zu öffnen.Nummer fünf, Pinzette. Stülpen Sie die Larven nach außen. Beginnen Sie damit, eine Pinzette vollständig bis zum hinteren Ende in die Larvenhaut einzuführen.Die Spitzen der Pinzette zusammendrücken, um das hintere Ende der Cuticula zu erfassen. Es ist einfacher, wenn man die Cuticula auf der Oberfläche der Syl-Abdeckung nach unten drückt. Mit dem zweiten Paar Pinzetten schiebt man die larvale Cuticula nach innen. Stellen Sie sicher, dass die Larven vollständig umgestülpt sind, sodass alle Weichgewebe der Lösung zur einfachen Dissoziation ausgesetzt sind. Üben Sie dies einige Male, bevor Sie versuchen, die Zellen zu dissoziieren. Nach der Dissektion von drei bis vier Larven überführen Sie diese umgehend in frisches, eiskaltes PBS in einem Mikrozentrifugenröhrchen.Wiederholen Sie den Vorgang, bis die erforderlichen 30 bis 40 Larven gesammelt sind, bevor Sie mit der Entfernung unspezifischer Zellen fortfahren. Berücksichtigen Sie, dass jetzt, da alle Larven disseziert sind, ein Verlust von 10 bis 20 % während der Dissektion und Assoziation zu erwarten ist. Entfernen Sie locker anhaftende unspezifische Gewebe wie Fettkörper und Zellen des zentralen Nervensystems.Indem man die snat der Röhre, die die invertierten Larvenhäute enthält, mit 700 bis 800 Mikrolitern frischer, eiskalter PBS ersetzt. Zuletzt kurz anwirbeln. Vortexen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen fünfmal je drei Sekunden bei voller Geschwindigkeit.Danach die Überstände verwerfen und durch etwa 700 bis 800 Mikroliter frisches, eiskaltes PBS ersetzen. Diesen Schritt dreimal wiederholen und die Larvenhüllen schließlich in 400 Mikroliter frischem, eiskaltem PBS resuspendieren.Kaltes PBS, bevor Sie mit der Dissoziation der Zellen fortfahren, um die dendritischen Verzweigungs- oder da-Larvenneuronen zu isolieren. Verwenden Sie eine Kombination aus enzymatischer und mechanischer Dissoziation. Achten Sie darauf, eine Überdissoziation zu vermeiden, da diese den Verlust des Zelloberflächenmarkers verursachen kann, was zu einer geringen Zellausbeute und niedrigen Zellviabilität führt.Beginnen Sie die Dissoziation, indem Sie 1,5 µL einer Liase-Zyme-Drei-Lösung mit einer Aktivität von 28 Einheiten pro Fläschchen zu den in 400 µL PBS suspendierten Larvenhüllen hinzufügen. Vortexen Sie die Lösung zwei- bis dreimal für jeweils eine Sekunde auf höchster Stufe, um die locker haftenden Zellen von den Hüllen in die Lösung zu überführen. Anschließend die Lösung fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Da die Inkubationszeit die endgültige Zellsortiereffizienz stark beeinflusst, sollte die Inkubationsphase am Ende nicht länger als 15 Minuten dauern.Vortexen Sie das Röhrchen 20 bis 30 Mal mit voller Geschwindigkeit, jeweils zwei Sekunden pro Impuls. Dadurch sollten sich das Muskelgewebe und anderes unspezifisches Gewebe in Lösung lösen. Überprüfen Sie die Probe in regelmäßigen Abständen unter einem fluoreszenzfähigen Stereomikroskop, um festzustellen, ob die peripheren Neuronen noch am Cuticula angeheftet sind.Überprüfen Sie eine kleine Probe der Lösung, indem Sie das Mikrozentrifugenröhrchen direkt unter einem fluoreszenzfähigen Stereomikroskop beobachten, um den Grad der Dissoziation zu bestimmen. Wiederholen Sie dies in jedem Schritt der Dissoziation und stoppen Sie das Vortexen, sobald die peripheren Neuronen sichtbar von der Larvenhaut in die Lösung übergehen. Waschen Sie die Larvenhüllen kurz mit zwei bis drei Wechseln je eines Milliliter frischer, eiskalter PBS.Und abschließend die Resuspension: Suspendieren Sie sie in 500 Mikrolitern frischer, eiskalter PBS, die 1 % BSA enthält. Um mit der mechanischen Dissoziation der Zellen fortzufahren, verwenden Sie einen 2-Milliliter-Konti-Gewebehomogenisator mit einem Stößel mit großem Spalt und einer 1 %igen BSA-Lösung in PBS. Nach einer kurzen Spülung entsorgen Sie die BSA-Lösung.Dadurch wird verhindert, dass die Larven-Cuticulae an den Glasoberflächen haften. Anschließend den Gewebemörser und den Stößel vorab für einige Minuten auf Eis abkühlen, um Zellschäden oder Zelllyse zu vermeiden. Danach die Cuticulae mit einer feuerpolierten Pasteurpipette in den Gewebemörser überführen.Nun das Gewebe mit langsamen und gleichmäßigen Strichen nach unten bearbeiten, wobei Schaumbildung vermieden werden sollte, für etwa 20 bis 30 Striche. Achten Sie darauf, langsam und gleichmäßig nach unten zu führen. Andernfalls könnten die Zellen platzen.Um die Zell-Dissociationsgrade zu beurteilen, wischen Sie die Wand des Gewehomogenisators mit einem sauberen Kim-Wipe-Tuch ab und untersuchen Sie unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop. Die Neuronen sollten sich von der Cuticula gelöst haben und in der Lösung sichtbar sein. Ein guter Hinweis auf eine erfolgreiche Zell-Dissociation ist das Fehlen von Neuronen an der larvalen Cuticula.Wenn jedoch weiterhin Neuronen an der Cuticula haften oder in vollständig dissoziierten Zellen beobachtet werden, pipettieren Sie weiter, bis die Zellen eine Einzelzell-Suspension bilden. Setzen Sie die mechanische Dissoziation mit einer an der Flamme geglätteten Pipette fort. Verengen Sie die Spitze auf etwa 50 % des Standarddurchmessers und pipettieren Sie die Lösung fünfmal, gefolgt von zehnmal mit einer an der Flamme geglätteten Pipette.Verengen Sie die Spitze auf etwa 25 % des Standarddurchmessers. Beachten Sie, dass eine heftige Rotation die Zellen beschädigen kann. Überwachen Sie die Zellen zwischen den Schritten und passen Sie das Verfahren entsprechend an.Filtern Sie die Lösung abschließend durch einen 30-Mikrometer-Zellfilter und sammeln Sie das Zellfiltrat in einem 1,6-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Die resultierende Lösung sollte eine Einzelzell-Suspension darstellen und ist nun bereit für die magnetische Zellsortierung. Magnetische Kügelchen, beschichtet mit einem Anti-CD8-Antikörper.Wurden wie in dem begleitenden schriftlichen Protokoll beschrieben hergestellt, und die DA-Neurone exprimieren ein CD8-GFP-Fusionsprotein, das durch den Antikörper gezielt erkannt wird. Beginnen Sie die Zellsortierung, indem Sie 15 µL mit Antikörper beschichtete magnetische Kügelchen zu 500 µL Zellsuspension hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen mit den mit Antikörper beschichteten magnetischen Kügelchen 30 bis 60 Minuten auf Eis mit gelegentlichem manuellem Mischen; eine Inkubation bei höherer Temperatur oder über eine längere Dauer kann zu unspezifischer Antikörperbindung führen.Als Nächstes setzen Sie das Mikro-Huge-Röhrchen zwei Minuten lang einem starken Magnetfeld aus. Alle positiv selektierten Zellen zusammen mit den nicht gebundenen Perlen lagern sich an der Röhrchenwand an. Aspirieren Sie langsam den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören, und waschen Sie die Zellen drei bis viermal mit frischem, eiskaltem PBS. Dieser Schritt entfernt alle verbleibenden unspezifisch gebundenen Zellen.Schließlich die Zellen in 30 Mikrolitern frischem, eiskaltem PBS resuspendieren, um Reinheit und Ausbeute der Zellen zu bestimmen. Fünf Mikroliter der Zellsuspension auf die polierte Oberfläche eines Hämozytometers pipettieren und alle sichtbaren fluoreszierenden Zellen unter einem fluoreszenzmikroskopischen Stereomikroskop zählen. Außerdem die Menge an nicht fluoreszierenden Zellen und eventuelle Anzeichen von Verunreinigungen überprüfen.In der Regel ist die Probe stark angereichert an fluoreszierenden Zellen. Verwenden Sie abschließend das pico pure RNA-Isolationskit, um RNA aus den an die Perlen gebundenen Zellen zu isolieren. Geben Sie den Extraktionspuffer zu den sortierten Zellen hinzu, entfernen Sie jedoch die Perlen mithilfe eines Magneten vor dem Säulenaufreinigungsschritt. Verwenden Sie ein Mikroliter der extrahierten RNA, um die Gesamt-RNA-Qualität auf einem Agilent Bioanalyzer 2100 zu bewerten.Die aus den isolierten DA-Neuronen gewonnene RNA weist eine ausgezeichnete Qualität auf, wie durch die Anwesenheit scharfer 5,8S- und 28S-Ribosomen-RNA-Peaks bei der Analyse auf einem Agilent 2100 Bioanalyzer gezeigt wurde. Beginnend mit Larven des 30. bis 43. Sterntags konnten wir durchschnittlich 300 bis 500 DA-Neuronen der Klasse vier unter Verwendung des PPK-Gal4-Treibers sowie 1500 bis 2000 DA-Neuronen der Klassen 1, 2, 3 und 4 isolieren. Mithilfe eines PAN-Neuron-spezifischen Gal4-Treibers ermöglichte die quantitative RT-PCR mit L11-fch, das neuronenspezifische Marker darstellen, eine signifikante Anreicherung beider Gene, was auf eine hohe Spezifität der Anreicherung von DA-Neuronen mittels des hier demonstrierten Protokolls im Vergleich zum Durchfluss hinweist. Schließlich wurde die isolierte RNA sowohl aus PAN-Neuronen als auch aus DA-Neuronen der Klasse vier verwendet, um transkriptionelle Expressionsprofile mittels Agilent Drosophila melanogaster Oligo-Mikroarrays für das gesamte Genom zu erstellen, wodurch zahlreiche Faktoren identifiziert wurden, die an der Morphogenese der DA-Neuronen beteiligt sind.Wir haben Ihnen gezeigt, wie man Drosophila-Peripheroneurone mittels magnetischer Zellseparation aus dem dritten Larvenentwicklungsstadium isoliert und reinigt. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die enzymatischen und mechanischen Dissoziationsschritte auszugleichen. Eine übermäßige enzymatische Dissoziation kann zum Abbau der CD8-Oberflächenmarker führen, was eine ineffiziente oder fehlgeschlagene Zellsortierung zur Folge haben kann.Es ist außerdem wichtig, während des gesamten Verfahrens RNA-freie Bedingungen aufrechtzuerhalten, um die Integrität der gereinigten RNA aus den isolierten Neuronen zu bewahren. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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