Dissection von 6,5 dpc muriner Embryonen

Mein Name ist Kelly Shea und ich bin Laborleiterin und zugleich wissenschaftliche Mitarbeiterin im Nielsen-Labor. Das ist deshalb schwierig, weil viele Personen die verschiedenen Gewebeschichten nicht unterscheiden können. Man muss daher im Wesentlichen alle Gewebeschichten zurückklappen, um das darunterliegende Embryo freizulegen, das zu diesem Zeitpunkt noch kaum durchblutet ist. Es ist daher sehr transparent und schwer zu erkennen.

Verwenden Sie ziemlich stumpfe Pinzette und Schere. Zuerst müssen Sie das Tier entlang der Mittellinie packen und einen ersten Schnitt durchführen. Von diesem Punkt aus können Sie dann einfach die Haut auseinanderziehen, wodurch der Bauch des Tieres freigelegt wird.

Es gibt eine dünne Schicht des Peritoneums, die Sie mit der Pinzette anheben und dann mit der Schere öffnen und zur Seite klappen können. Sie sollten entlang der Mittellinie des Tieres schneiden und beide uterinen Hörner, die in der Mitte verbunden sind, auseinanderziehen. Sie können direkt an der Basis schneiden.

Sie werden vermutlich viel Fett zusammen mit dem Gewebe erhalten. Entnehmen Sie das gesamte Uterushorn des Tieres und geben Sie es direkt in das PBS.

Das hier befindet sich also im Horn. Dies sind die Implantationsstellen, 1, 2, 3, 4, 5. Sie sollten diese lediglich voneinander trennen.

Sie können im Grunde zwischen den Implantationsstellen hier schneiden. Sie können das Embryo an der Seite packen und es gewissermaßen auseinanderhebeln. An diesem Punkt legen Sie das Deum frei, das ein weicheres, schwammigeres Gewebe darunter ist.

Der Embryo sollte also genau in der Mitte liegen, genau hier. Dies ist die Spitze des Laubkeims. Sie sollten ihn mit der Spitze nach oben ausrichten.

Am Ende schneiden Sie etwa ein Fünftel der Strecke von der Spitze aus ab. Der Embryo sollte genau in der Mitte hier sitzen. Ich orientiere ihn seitlich, nehme eine Pinzette und greife ihn so an, halte ihn mit der anderen fest, schneide die Spitze ab und trenne ihn dann.

Sobald diese Kappe entfernt ist, stellen Sie das Embryo auf die Kante. Wie Sie sehen können, entsteht genau an der Stelle, an der Sie die Kappe entfernen, eine Öffnung. Führen Sie die Pinzette einfach vorsichtig in diese Öffnung ein. Ja.

An diesem Punkt sitzt das Embryo sehr locker in der Deum. Sobald man die Deum öffnet, kann man es praktisch mühelos herauslösen, solange man unterhalb der Basis ansetzt. Es ist also sehr klein.

Es sind außerdem noch einige Gewebe am Embryo angeheftet. Sie haben den ekto-plazentaren Zapfen, der sich hier an der Spitze des Embryos befindet. Außerdem sind noch andere Gewebe am Embryo befestigt.

Ich nehme also einfach die Pipette und sauge ihn auf. An diesem Punkt sollten Sie die Embryonen fixieren. Dazu habe ich eine Schale mit PFA bereitstehen.

Wir wollten uns kandidatengene ansehen. Im Wesentlichen verwenden wir Whole-Mount-RNA-in-situ-Techniken, um die Produktion von Nukleinsäuren in situ innerhalb eines Embryos sichtbar zu machen. Bei diesen spezifischen Genen handelt es sich um putative Marker für Keimbahnvorläuferzellen, von denen außerdem vorhergesagt wird, dass sie im Mausembryo zu einem bestimmten Zeitpunkt exprimiert werden, der für die Entwicklung und Reifung der Keimbahnzellen aus putativen Keimbahnvorläufern zu Keimbahnzellen entscheidend ist.

Ein solcher Faktor, der uns von Anfang an sehr interessiert hat und der erste Faktor, den wir tatsächlich im Whole-Mount-In-situ-Ansatz an diesen Embryonen vom Tag 6,5 untersucht haben, war das bone morphogenetic protein (BMP4). Es ist ein Mitglied der TGF-beta-Superfamilie. Es ist sehr wichtig und für die Reifung der Keimzellen unbedingt erforderlich.

Und es ist außerdem erforderlich, dass die Keimzellen sich entlang des Embryos bewegen und sich in der Nähe der Primitivfalte des Embryos ansiedeln. Dabei spielt BMP-4 eine entscheidende Rolle sowohl bei der Signalübertragung als auch bei der Reifung, die die Keimzellen durchlaufen müssen, um sich in der Primitivfalte anzusiedeln. Sie sollten daher zunächst genau wissen, wonach Sie suchen, wie klein es ist, in welchem Maßstab Sie arbeiten, und sich sorgfältig hinsetzen und genau planen.

Die Technik hängt insbesondere davon ab, mit welcher Art von Stereomikroskop Sie arbeiten werden. Eine der technischen Schwierigkeiten besteht darin, dass viele Handgriffe erforderlich sind und äußerst ruhige Handbewegungen notwendig sind, um das Embryo nicht zu beschädigen. Daher sollten Sie ein Stereomikroskop verwenden, bei dem ausreichend Platz zum Manipulieren vorhanden ist. Stellen Sie außerdem sicher, dass Sie alles für das Experiment benötigte Material bereits vorbereitet haben, sodass Sie während der Dissektion nicht mehr Handgriffe ausführen müssen, als unbedingt erforderlich sind.

Abgesehen davon sollten Sie sehr langsam vorgehen und die einzelnen Gewebeschichten behutsam ablösen, um genau zu wissen, mit was Sie arbeiten. Achten Sie darauf, wo sich der Embryo befindet.