A Novel RFP Reporter in der Visualisierung des Eye Imaginalscheibe in Aid Drosophila

Die neuartige transgene IRFP-Reporter-Linie von Drosophila exprimiert rotes fluoreszierendes Protein (RFP) in spezifischen Zellen der I-Imaginalanlage. Diese transgene Linie kann bei der Identifizierung, Dissektion und Markierung spezifischer Zelltypen im sich entwickelnden Auge helfen. Um die Augen-Imaginalanlage zu dissezieren, werden wandernede Larven der dritten Instar mit einem Spatel von der Seite eines Gefäßes entnommen.

Die Larven werden anschließend in einen Tropfen PBS auf eine Sill-Schale gegeben. Mithilfe von Pinzette werden die Mundteile mit den daran befestigten Augenscheiben vom Rest der Larve entfernt; die Augenscheiben werden danach auf einen Objektträger überführt, wo sie von den Mundteilen und dem Gehirn abdisseziert werden. Hallo, ich bin Amna Cole aus dem Joseph-Bateman-Labor im Wolfson-Zentrum für altersbedingte Erkrankungen am King's College London.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Dissektion von imaginären Augenscheiben aus Drosophila. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Gene zu untersuchen, die an der Neurogenese beteiligt sind. Beginnen wir also.

Um mit der Dissektion von Augen-Imaginalanlagen zu beginnen, geben Sie einen Tropfen PBS auf eine mit Sylgard beschichtete Petrischale. Unter einem Stereomikroskop schützt die Sylgard-Beschichtung die Pinzetten vor Beschädigungen während der Dissektion. Nehmen Sie anschließend mit einem Spatel eine wandern­de Larve im dritten Larvenstadium und legen Sie sie in den Tropfen PBS. Halten Sie die Larve mit einer Pinzette in jeder Hand etwa zwei Drittel des Weges in Richtung Hinterende fest. Verwenden Sie nun die andere Pinzette, um die dunkelfarbigen Mundteile am Vorderende der Larve zu halten.

Ziehen Sie die Lava vorsichtig auseinander, indem Sie die Pinzette voneinander wegbewegen. Die Mundteile sollten zusammen mit dem Augen-Gehirn-Komplex vom restlichen Körper abgelöst werden. Geben Sie anschließend einen Tropfen PBS auf einen Objektträger und übertragen Sie die Discs, indem Sie die Mundteile halten, in den Tropfen PBS.

Wechseln Sie nun zum Fluoreszenzmodus am Stereomikroskop, da nur die Augen-Imaginalanlagen RFP exprimieren und daher leicht als rot fluoreszierendes Gewebe, das die sphärischen Opticuloben überlagert, identifiziert werden können, um den Kontrast der Anlagen zu erhöhen. Richten Sie die Kaltlichtquelle mit Lichtleiter in einem schrägen Winkel auf den Objektträger. Die Augen-Imaginalanlagen sind posterior über den Sehnervenstiel mit den Opticuloben und anterior über einen Stiel, der von einer Antennenanlage ausgeht, mit den Mundteilen verbunden.

Um die Augen-Imaginalanlagen zu dissezieren, halten Sie die Teile mit einem Paar Pinzetten fest und verwenden Sie das andere Paar, um die Augen-Imaginalanlagen vom larvalen Gehirn zu trennen. Als Nächstes trennen Sie die Augen-Imaginalanlagen von den Mundteilen. Sobald die Mundteile von den Augen-Imaginalanlagen getrennt wurden, entfernen Sie sie vom Objektträger.

Die Augen-Imaginalanlagen sollten nun flach auf dem Objektträger liegen und frei von jeglichem überflüssigen Gewebe, einschließlich Gehirngewebe, sein. Setzen Sie die Präparation der verbleibenden I-Imaginalanlagen fort. Sobald alle Augen-Imaginalanlagen präpariert wurden, kippen Sie den Objektträger vorsichtig und verwenden Sie ein kleines Stück Papiertuch, um überschüssiges PBS abzutupfen.

Geben Sie nun einen Tropfen Vector Shield-Mounting-Medium hinzu und legen Sie vorsichtig ein Deckglas darauf. Die Objektträger sind nun bereit, entweder mittels Epi-Fluoreszenz- oder konfokaler Mikroskopie abgebildet zu werden. Falls die Aufnahme zu einem späteren Zeitpunkt erfolgt, bewahren Sie den Objektträger bei vier Grad Celsius auf.

Das RFP bleibt mindestens ein Jahr lang sichtbar. Bei der Aufnahme von Z-Serien-Bildern sollten diese mit einem konfokalen Mikroskop oder einem Zeiss aome Mikroskop bei einem Abstand von einem Mikrometer unter Verwendung einer 20x- oder 40x-Linse aufgenommen werden; anschließend können Projektionsbilder mithilfe der Mikroskop-Software generiert werden. Imaginale Discs von Fliegen, die IRFP exprimieren, wurden präpariert und mit Phin gefärbt. Die Bildgebung wurde dann mit einem zes aome Mikroskop bei einem Abstand von einem Mikrometer unter Verwendung einer 20x-Linse durchgeführt. Die Zellen der Augendisc, die RFP exprimieren, sind rot dargestellt.

Die morphogenetische Furche wird durch Foid und Färbung sichtbar gemacht und grün dargestellt. Die dorsal-ventralen Pole der Augenscheibe sind gekrümmt und neigen dazu, sich zu falten. Diese Abschnitte können aus dem endgültigen Projektionsbild ausgeschlossen werden.

Obwohl die Scheibe ein einlagiges Epithel darstellt, erfordern die variablen Positionen der Kerne eine Z-Serien-Projektion, um ein Gesamtbild der Scheibe zu erhalten. Da der IRFP-Reporter kernlokalisiert ist, stellt das hier sichtbare Muster die nukleäre Expression von RFP dar. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man die Vaginalaugenscheiben von Drosophila disseziert.

Bei Verwendung dieses Verfahrens sollten Sie am besten ein feines Paar Pinzetten verwenden, und es ist wahrscheinlich ratsam, in diesem Bereich auf Kaffee zu verzichten. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei all Ihren Experimenten.