Vorbereitung der Embryonen für Elektronenmikroskopie der Drosophila Embryonale Herz Rohr

Dieses Video erklärt, wie die Transmissions-Elektronenmikroskopie, auch bekannt als TEM, am embryonalen Knorpel von Drosophila durchgeführt wird. Das Herz hat sich als wertvolles Modellsystem zur Untersuchung von Zellmigration, Zell-Zell-Adhäsion und Zellformveränderungen etabliert. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung der Form des Herzlumens sowie ultrastruktureller Bestandteile wie Zellmembranen, Zell-Zell-Verbindungen und Basalmembran.

Zur Durchführung dieses Verfahrens wird zunächst eine Fixierungslösung hergestellt, die für die Transmissionselektronenmikroskopie von Drosophila-Embryonen geeignet ist. Anschließend werden Embryonen aus einer Sammlung von 0 bis 20 Stunden auf eine doppelseitige Klebefolie gegeben und in die Fixierungslösung überführt. Nach Abschluss der Fixierung werden die Embryonen aus der Lösung entnommen und weiterverarbeitet, während sie weiterhin an dem doppelseitigen Klebeband befestigt sind.

In einer Petrischale mit Puffer schwimmen deionisierte Embryonen im Puffer und werden mit einer Pipette aufgenommen. Anschließend werden die Embryonen nachfixiert und einer Dehydrierungsreihe unterzogen. Nach der Infiltration mit Harz werden sie in eine Einbettform überführt, wo sie ausgerichtet werden.

Der resultierende Block wird mit einem Diamantmesser geschnitten. Die Schnitte werden auf Kupfergittern aufgefangen, gefärbt und untersucht. Hallo, ich bin Nadine Lop aus dem Labor von Sunita Kramer an der Abteilung für Pathologie und Labormedizin an der University of Medicine and Dentistry of New Jersey am Robert Wood Johnson Medical School.

Ich bin Raj Patel. Ich bin der Elektronenmikroskopierer aus der PON-Pathologie. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Vorbereitung und Abbildung von Oph-Embryonen für die Transmissionselektronenmikroskopie.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Herz-Morphogenese von Drosophila zu untersuchen. Beginnen wir also. Beginnen wir.

Bevor Sie die Drosophila-Embryonen bearbeiten, bereiten Sie frisch die Fixierlösung für die Heptan-Permeationsmethode zur Embryofixierung vor. Pipettieren Sie in einem Abzug zwei Milliliter einer frisch hergestellten Lösung, die 12,5 % Glutaraldehyd in Cate-Puffer enthält, in ein Glas-Zählgefäß. Geben Sie acht Milliliter ADA-Heptan hinzu und schütteln Sie kräftig.

Dann eine Minute warten. Die beiden Phasen trennen sich, wobei die obere Phase das ADA-Heptan enthält, das mit Glutaraldehyd gesättigt ist und als Fixierungslösung dient. Die obere Phase mit einer Pipette in ein sauberes Gefäß überführen und beiseite stellen. Um Embryonen von null bis 20 Stunden zu sammeln, verwenden Sie eine Embryosammelkammer, die aus einem kleinen Korb mit einem herausnehmbaren Mascheneinsatz besteht.

Entfernen Sie zunächst die Traubensaftplatte mit den Embryonen und beseitigen Sie alle toten Fliegen. Lockern Sie dann mithilfe von Wasser und einem Pinsel die Embryonen von der Traubensaftplatte und überführen Sie sie mit Hilfe einer quadratischen Flasche, die Wasser enthält, in die Embryosammelkammer.

Spülen Sie die Embryonen von überschüssiger Hefe aus der Traubensaftplatte ab. Entfernen Sie die äußere Chorionmembran, indem Sie die Embryonen zwei bis drei Minuten lang oder bis sie an die Oberfläche schwimmen in eine 50 %ige Bleichlösung geben. Spülen Sie sie gründlich mit destilliertem Wasser ab und legen Sie die Embryonen auf ein Papiertuch.

Heben Sie mit einer Pinzette den Netz-Einsatz auf, der nun mit beschichteten Embryonen bedeckt sein sollte. Legen Sie den Einsatz in das Fixativ, sodass die Embryonen vom Netz abfallen. Lassen Sie die Embryonen anderthalb Stunden bei vier Grad Celsius unter Rühren auf einem orbitalen Schüttler fixieren.

Nach Beendigung der Inkubation die Embryonen in eine mit doppelseitigem Klebeband ausgelegte Petrischale überführen, wobei möglichst wenig Fixansatz mitgenommen werden sollte. Die Schale schütteln, um die Embryonen in einer einzigen Schicht zu verteilen, und anschließend in die Abzugshaube stellen, damit das Heptan verdunsten kann. Sobald die Embryonen getrocknet sind, diese mit Puffer, der 0,1 % Tween hand de vize enthält, bedecken.

Späte Embryonen des Stadiums 16 unter einem Stereomikroskop mit einer stumpfen Wolframesspitze. Embryonen, die fixiert wurden, schwimmen oben und können mit einer Pasteurpipette aufgenommen werden; überführen Sie die Embryonen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Spülen Sie die Embryonen in 0,1-molarer Cacodylat-Pufferlösung und nachfixieren Sie sie anschließend eine Stunde lang bei Raumtemperatur in 1 % Osmiumtetroxid.

Nach der Inkubation spülen Sie die Embryonen mit Cate-Puffer. Dehydrieren Sie die Embryonen erneut in einer abgestuften Serie aus Ethanol und Aceton. Beginnen Sie mit 50 % Ethanol für 10 Minuten, gefolgt von 70 % Ethanol für 10 Minuten, dann dehydrieren Sie in 90 % Aceton für 10 Minuten und schließlich in 100 % Aceton in Schritten zu je 10 Minuten.

Entfernen Sie das Aceton. Beginnen Sie den Infiltrationsprozess, indem Sie eine 1:1-Mischung aus Ein-Spray-Harz und Aceton hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass die Probe unter Vakuumdruck steht, und behandeln Sie sie drei Minuten lang in der Mikrowelle.

Halten Sie den Vakuumdruck weitere fünf Minuten aufrecht. Ersetzen Sie die Harz-Aceton-Mischung durch 100 % Harz und bestrahlen Sie erneut unter Vakuumdruck in der Mikrowelle. Wechseln Sie das Harz und bestrahlen Sie in der Mikrowelle unter Druck.

Ein letztes Mal, insgesamt drei Infiltrationsschritte. Überführen Sie die Embryonen aus dem Mikrozentrifugenröhrchen in eine Silikon-Einbettform. Richten Sie die Embryonen in einer Reihe aus, sodass das hintere Ende des Embryos mit der abgeschrägten Kante der Form übereinstimmt.

Bacon bei 70 Grad Celsius im Ofen über Nacht. Anschließend den entstandenen Block zum Schneiden entnehmen. Mit einem Mikrotom ein Mikrometer dicke Schnitte der Embryonen anfertigen.

Nachdem der Block durchschnitten wurde und der Embryo erreicht ist, verwenden Sie eine Schleife, um einen einzelnen Schnitt auf einen Objektträger zu übertragen, um festzustellen, ob die geeignete Tiefe zur Visualisierung des Herzens vor der eigentlichen Beobachtung erreicht wurde. Erhitzen Sie den Schnitt kurz auf einer Heizplatte und färben Sie ihn mit Methylenblau, indem Sie zunächst einen Tropfen auf den Objektträger geben und dann kurz erhitzen.

Auch hier erneut mit entionisiertem Wasser spülen und den Schnitt unter dem Mikroskop in der gewünschten Schnitttiefe untersuchen. Der Herzschaft sollte mit dem Lichtmikroskop erkennbar sein, um die Platzbeschränkungen zu erfüllen. Den Block erneut so beschneiden, dass maximal fünf Embryonen im Querschnitt enthalten sind, die das embryonale Herz zeigen.

Schneiden Sie 90 Nanometer dicke Schnitte mit dem Mikrotom. Nehmen Sie mehrere Schnitte auf einem Kupfergitter auf. Färben Sie das Gitter 10 Minuten lang mit 3 %iger Essigsäure, anschließend dreimal mit destilliertem Wasser spülen.

Färben Sie das Objektträgergitter nun zweieinhalb Minuten lang mit Zitratblei in einer Kammer mit Natriumhydroxid-Perlen, um ein kohlendioxidfreies Milieu zu schaffen. Nach der Inkubation dreimal mit destilliertem Wasser waschen. Die Schnitte mit einem Elektronenmikroskop bei 80 Kilovolt untersuchen und mit einer CCD-Kamera fotografieren.

Um zu bestimmen, ob die Schnitttiefe und die Stufung korrekt durchgeführt wurden, sollte ersichtlich sein, dass ein ausgereifter Herzlumen zwischen den beiden Kardioblasten der dorsalen Mittellinie gebildet wurde. Um zu überprüfen, ob die Zellmembranen intakt sind, untersuchen Sie das Herzlumen auf das Vorhandensein einer extrazellulären Matrix und achten Sie auf die Anwesenheit von Christie und Mitochondrien. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man die Ultrastruktur des embryonalen Drosophila-Herzens bestimmt. Bei Durchführung dieses Verfahrens.

Es ist wichtig, daran zu denken, die Drosophila-Embryonen korrekt einzustufen und die Bestandteile des Harzes genau abzumessen und gründlich zu mischen. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.