Vorbereitung der Embryonen für Elektronenmikroskopie der Drosophila Embryonale Herz Rohr

Dieses Video erklärt, wie die Transmissionselektronenmikroskopie, auch bekannt als TEM, am embryonalen Knorpel von Drosophila durchgeführt wird. Das Herz hat sich als wertvolles Modellsystem zur Untersuchung von Zellmigration, Zell-Zell-Adhäsion und Zellformveränderungen etabliert. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung der Form des Herzlumens sowie ultrastruktureller Bestandteile wie Zellmembranen, Zell-Zell-Verbindungen und Basalmembran.

Zur Durchführung dieses Verfahrens wird zunächst eine Fixierungslösung hergestellt, die für die Transmissionselektronenmikroskopie von Drosophila-Embryonen geeignet ist. Anschließend werden Embryos mit einer Sammeldauer von null bis 20 Stunden in die Fixierungslösung gegeben. Nach Abschluss der Fixierung werden die Embryos aus der Lösung entnommen und während sie an doppelseitigem Klebeband befestigt sind, weiterverarbeitet.

In einer Petrischale mit Puffer schwimmen deionisierte Embryonen im Puffer und werden mit einer Pipette aufgenommen. Anschließend werden die Embryonen nachfixiert und einer Dehydrierungsreihe unterzogen. Nach der Infiltration mit Harz werden sie in eine Einbettform überführt, wo sie ausgerichtet werden.

Der resultierende Block wird mit einem Diamantmesser geschnitten. Die Schnitte werden auf Kupfergittern aufgefangen, gefärbt und untersucht. Hallo, ich bin Nadine Lop aus dem Labor von Sunita Kramer an der Abteilung für Pathologie und Labormedizin an der University of Medicine and Dentistry of New Jersey am Robert Wood Johnson Medical School.

Ich bin Raj Patel. Ich bin der Elektronenmikroskopierer und ebenfalls vom PON-Pathologie. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Vorbereitung und Abbildung von Oph-Embryonen für die Transmissionselektronenmikroskopie.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Herz-Morphogenese von Drosophila zu untersuchen. Beginnen wir also. Beginnen wir.

Bevor Sie die Drosophila-Embryonen bearbeiten, bereiten Sie frisch die Fixierlösung für die Heptan-Permeationsmethode zur Embryofixierung vor. Pipettieren Sie in einem Abzug zwei Milliliter einer frisch hergestellten Lösung, die 12,5 % Glutaraldehyd in Cate-Puffer enthält, in ein Glas-Zählgefäß. Geben Sie acht Milliliter ADA-Heptan hinzu und schütteln Sie kräftig.

Dann eine Minute warten. Die beiden Phasen trennen sich, wobei die obere Phase das ADA-Heptan enthält, das mit Glutaraldehyd gesättigt ist und als Fixierungslösung dient. Die obere Phase mit einer Pipette in ein sauberes Gefäß überführen und beiseite stellen. Um Embryonen von null bis 20 Stunden zu sammeln, verwenden Sie eine Embryosammelkammer, die aus einem kleinen Korb mit einem herausnehmbaren Mascheneinsatz besteht.

Entfernen Sie zunächst die Traubensaftplatte mit den Embryonen und beseitigen Sie alle toten Fliegen. Lösen Sie dann mithilfe von Wasser und einem Pinsel die Embryonen von der Traubensaftplatte und überführen Sie sie mit Hilfe einer quadratischen Flasche, die Wasser enthält, in die Embryosammelkammer.

Spülen Sie die Embryonen von überschüssiger Hefe aus der Traubensaftplatte ab. Entfernen Sie die äußere Chorionmembran, indem Sie die Embryonen zwei bis drei Minuten lang in einer 50 %igen Bleichlösung einweichen oder bis die Embryonen an die Oberfläche aufsteigen. Spülen Sie sie gründlich mit destilliertem Wasser ab und legen Sie die Embryonen auf ein Papiertuch.

Heben Sie mit einer Pinzette den Netz-Einsatz auf, der nun mit beschichteten Embryonen bedeckt sein sollte. Legen Sie den Einsatz in das Fixativ, sodass die Embryonen vom Netz abfallen. Lassen Sie die Embryonen anderthalb Stunden bei vier Grad Celsius unter Rühren auf einem orbitalen Schüttler fixieren.

Nach Beendigung der Inkubation die Embryonen in eine mit doppelseitigem Klebeband ausgelegte Petrischale überführen, wobei möglichst wenig Fixansatz mitgenommen werden sollte. Die Schale schütteln, um die Embryonen in einer einzigen Schicht zu verteilen, und anschließend in die Abzugshaube stellen, damit das Heptan verdunsten kann. Sobald die Embryonen getrocknet sind, diese mit Puffer, der 0,1 % Tween hand de vize enthält, bedecken.

Späte Embryonen des Stadiums 16 unter einem Stereomikroskop mit einer stumpfen Wolframesspitze. Embryonen, die fixiert wurden, schwimmen und können mit einer Pasteurpipette aufgesammelt werden; überführen Sie die Embryonen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Spülen Sie die Embryonen in 0,1-molarer Cacodylatpufferlösung und postfixieren Sie anschließend eine Stunde bei Raumtemperatur in 1 % Osmiumtetroxid.

Nach der Inkubation spülen Sie die Embryonen mit Cate-Puffer. Dehydrieren Sie die Embryonen erneut in einer abgestuften Serie aus Ethanol und Aceton. Beginnen Sie mit 50 % Ethanol für 10 Minuten, gefolgt von 70 % Ethanol für 10 Minuten, dann dehydrieren Sie in 90 % Aceton für 10 Minuten und schließlich in 100 % Aceton in Schritten zu je 10 Minuten.

Entfernen Sie das Aceton. Beginnen Sie den Infiltrationsprozess, indem Sie eine 1:1-Mischung aus Ein-Spray-Harz und Aceton hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass die Probe unter Vakuumdruck steht, und behandeln Sie sie drei Minuten lang in der Mikrowelle.

Halten Sie den Vakuumdruck weitere fünf Minuten aufrecht. Ersetzen Sie die Harz-Aceton-Mischung durch 100 % Harz und bestrahlen Sie erneut unter Vakuumdruck in der Mikrowelle. Wechseln Sie das Harz und bestrahlen Sie in der Mikrowelle unter Druck.

Ein letztes Mal, insgesamt drei Infiltrationsschritte. Überführen Sie die Embryonen aus dem Mikrozentrifugenröhrchen in eine Silikon-Einbettform. Richten Sie die Embryonen in einer Reihe so aus, dass das hintere Ende des Embryos mit der abgeschrägten Kante der Form abschließt.

Legen Sie den Speck über Nacht in einen 70 Grad Celsius warmen Ofen. Entfernen Sie dann den entstandenen Block zur Schnittführung. Schneiden Sie mit einem Mikrotom Eins-Mikrometer-Schnitte in die Embryonen.

Nachdem der Block vollständig eingebettet und das Embryo erreicht wurde, verwenden Sie eine Schleife, um einen einzelnen Schnitt auf einen Objektträger zu übertragen, um festzustellen, ob die geeignete Tiefe zur Visualisierung des Herzens vor der eigentlichen Beobachtung erreicht wurde. Erhitzen Sie den Schnitt kurz auf einer Heizplatte und färben Sie ihn mit Methylenblau, indem Sie zunächst einen Tropfen auf den Objektträger geben und dann kurz erhitzen.

Spülen Sie erneut mit entionisiertem Wasser und untersuchen Sie den Schnitt unter dem Mikroskop in der gewünschten Schnitttiefe. Das Herzlumen sollte mit dem Lichtmikroskop erkennbar sein, um die Platzbeschränkungen zu erfüllen. Schneiden Sie den Block erneut zu, sodass maximal fünf Embryonen im Querschnitt enthalten sind, die das embryonale Herz zeigen.

Schneiden Sie 90 Nanometer dicke Schnitte mit dem Mikrotom. Nehmen Sie mehrere Schnitte auf einem Kupfergitter auf. Färben Sie das Gitter 10 Minuten lang mit 3 %iger Essigsäure, dann spülen Sie es dreimal mit destilliertem Wasser ab.

Färben Sie das Objektträgergitter nun zweieinhalb Minuten lang mit Bleicitrat in einer Kammer mit Natriumhydroxid-Perlen, um eine kohlendioxidfreie Umgebung zu schaffen. Nach der Inkubation dreimal mit destilliertem Wasser spülen. Die Schnitte mit einem Elektronenmikroskop bei 80 Kilovolt untersuchen und mit einer CCD-Kamera fotografieren.

Um zu bestimmen, ob die Schnitttiefe und die Stufung korrekt durchgeführt wurden, sollte ersichtlich sein, dass ein ausgereiftes Herzlumen zwischen den beiden Kardioblasten der dorsalen Mittellinie gebildet wurde. Um zu überprüfen, ob die Zellmembranen intakt sind, untersuchen Sie das Herzlumen auf das Vorhandensein einer extrazellulären Matrix und achten Sie auf die Anwesenheit von Kristallstrukturen und Mitochondrien. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man die Ultrastruktur des embryonalen Drosophila-Herzens bestimmt. Gehen Sie bei Durchführung dieses Verfahrens wie folgt vor.

Es ist wichtig, daran zu denken, die Drosophila-Embryonen korrekt zu stagieren und die Bestandteile des Harzes genau abzumessen und gründlich zu mischen. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.