Vorbereitung der Embryonen für Elektronenmikroskopie der Drosophila Embryonale Herz Rohr

In diesem Video wird erklärt, wie die Transmissionselektronenmikroskopie, auch bekannt als TEM, auf dem Drosophila-Embryonalwagen durchgeführt wird. Das Herz hat sich zu einem wertvollen Modellsystem für die Untersuchung der Zellmigration, der Zelladhäsion und der Zellformveränderungen entwickelt. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung der Form des Herzlumens sowie von ultrastrukturellen Komponenten wie Zellmembranen, Zellverbindungen und Basalmembran.

Um dieses Verfahren zu beginnen, wird eine Fixierlösung hergestellt, die für die Transmissionselektronenmikroskopie von Drosophila-Embryonen geeignet ist. Als nächstes wird eine Entnahme von null bis 20 Stunden der beschichteten Embryonen in die Fixierlösung gegeben. Wenn sie fertig sind, werden die Embryonen aus der Fixierlösung entnommen und griffbereit gemacht, während sie an doppelseitigem Klebeband befestigt sind.

In einer Petrischale, die einen Puffer enthält, schwimmen deionisierte Embryonen im Puffer und werden mit einer Pipette entnommen. Dann werden die Embryonen postfixiert und durchlaufen einen Dehydratationsgradienten. Sobald sie mit Harz infiltriert sind, werden sie in eine Einbettungsform überführt, wo sie ausgerichtet werden.

Der resultierende Block wird mit einem Diamantmesser geschnitten. Abschnitte werden auf Kupfergittern aufgenommen, gebeizt und untersucht. Hallo, ich bin Nadine Lop aus dem Labor von Sunita Kramer in der Abteilung für Pathologie und Labormedizin an der University of Medicine and Dentistry of New Jersey an der Robert Wood Johnson Medical School.

Ich bin Raj Patel. Ich bin der Elektronenmikroskopiker, auch aus der PON-Pathologie. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Aufbereitung und Bildgebung von oph-Embryonen für die Transmissionselektronenmikroskopie.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Morphogenese des Drosophila-Herzens zu untersuchen. Also lasst uns loslegen. Loslegen.

Vor dem Umgang mit den Drosophila-Embryonen die Fixierlösung für die Heptanpermeationsmethode der Embryofixation frisch vorbereiten. In einer Abzugspipette zwei Milliliter einer frisch hergestellten Lösung mit 12,5 % Glutaraldehyd in Cate-Puffer in ein Szintillationsfläschchen aus Glas geben. Fügen Sie acht Milliliter ADA-Heptan hinzu und schütteln Sie es kräftig.

Warten Sie dann eine Minute. Wenn sich die beiden Phasen trennen können, enthält die obere Phase das ADA-Heptan, das mit Glutaraldehyd gesättigt ist, das die Fixierlösung ist. Pipettieren Sie die obere Phase in ein sauberes Fläschchen und stellen Sie es beiseite. Um Embryonen mit null bis 20 Stunden zu entnehmen, verwenden Sie eine Embryo-Entnahmekammer, bei der es sich um einen kleinen Korb mit einem herausnehmbaren Netzeinsatz handelt.

Beginnen Sie damit, die Traubensaftplatte mit den Embryonen zu entfernen und alle toten Fliegen zu entfernen. Dann mit Wasser und einem Pinsel. Lösen Sie die Embryonen von der Traubensaftplatte und übertragen Sie die Embryonen mit einer quadratischen Flasche mit Wasser in die Embryoentnahmekammer.

Spülen Sie die Embryonen von überschüssiger Hefe von der Traubensaftplatte ab. Entfernen Sie die äußere Corion-Membran, indem Sie die Embryonen zwei bis drei Minuten lang in einer 50%igen Bleichlösung einweichen oder bis die Embryonen an die Oberfläche schwimmen. Spülen Sie die Embryonen gründlich mit destilliertem Wasser ab und legen Sie sie auf ein Papiertuch.

Nehmen Sie mit einer Pinzette die Netzeinlage auf, die nun mit beschichteten Embryonen bedeckt sein sollte. Legen Sie den Einsatz in das Fixiermittel, so dass die Embryonen aus dem Netz fallen können. Lassen Sie die Embryonen eineinhalb Stunden lang bei vier Grad Celsius fixieren, während Sie auf einer Orbitalwippe mischen.

Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, legen Sie die Embryonen in eine Petrischale, die mit doppelseitigem Klebeband ausgekleidet ist, und nehmen Sie so wenig Fixiermittel wie möglich auf. Schütteln Sie die Schale, um die Embryonen in einer einzigen Schicht zu verteilen, und legen Sie sie dann in die chemische Haube, damit das Heptan verdampfen kann. Sobald die Embryonen getrocknet sind, bedecken Sie die Embryonen mit einem Puffer mit 0,1 % zwischen den Händen.

Embryonen im späten Stadium 16 unter einem Präpariermikroskop mit einer stumpfen Wolframnadel. Embryonen, die isiert wurden, schwimmen und mit einer Weidepipette entnommen werden können, übertragen die Embryonen in ein 1,5-Milliliter-Mikrofurchen. Spülen Sie die Embryonen in 0,1 molaren Puffer und fixieren Sie sie dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur in 1%Osmiumtetroxid.

Spülen Sie die Embryonen nach der Inkubation mit Cate-Puffer aus. Auch hier dehydrieren Sie die Embryonen in einer Reihe von Ethanol und Aceton. Beginnen Sie mit 50 % Ethanol für 10 Minuten, gefolgt von 70 % Ethanol für 10 Minuten, dann dehydrieren Sie 10 Minuten lang in 90 % Aceton und schließlich in 100 % Aceton-Schritten von jeweils 10 Minuten.

Entfernen Sie das Aceton. Beginnen Sie den Infiltrationsprozess, indem Sie eine Eins-zu-Eins-Mischung aus einem Sprühharz und Aceton hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass die Probe unter Vakuumdruck steht und drei Minuten lang in der Mikrowelle erhitzt wird.

Halten Sie den Vakuumdruck für weitere fünf Minuten aufrecht. Tauschen Sie das Harz-Aceton-Gemisch gegen 100%iges Harz aus und erhitzen Sie es erneut unter Vakuumdruck. Tauschen Sie das Harz aus und mikrowellen Sie es unter Druck.

Ein letztes Mal für insgesamt drei Versickerungsschritte. Übertragen Sie die Embryonen aus dem Mikrofuge-Röhrchen in eine Silikon-Einbettungsform. Richten Sie die Embryonen in einer Reihe so aus, dass das hintere Ende des Embryos mit dem sich verjüngenden Rand der Form ausgerichtet ist.

Speck wird über Nacht bei 70 Grad Celsius in den Ofen gebracht. Entfernen Sie dann den resultierenden Block zum Schneiden. Schneiden Sie mit einem Mikrotom einen Mikrometer große Schnitte in die Embryonen.

Sobald der Block durchtrennt und der Embryo erreicht wurde, verwenden Sie eine Schlaufe, um einen einzelnen Abschnitt auf einen Objektträger zu bewegen, um festzustellen, ob die richtige Tiefe für die Visualisierung des Herzens vor der Visualisierung erreicht wurde. Erhitzen Sie den Abschnitt kurz auf einer heißen Platte und färben Sie den Abschnitt mit Methylenblau, indem Sie zuerst einen Tropfen auf den Objektträger geben. Und dann kurz heizen.

Spülen Sie erneut mit entionisiertem Wasser ab und untersuchen Sie den Schnitt unter einem Mikroskop in der gewünschten Schnitttiefe. Das Herzlumen sollte mit einem Lichtmikroskop erkennbar sein, um den Platzverhältnissen gerecht zu werden. Schneiden Sie den Block so zu, dass maximal fünf Embryonen im Querschnitt zu sehen sind, die das embryonale Herz zeigen.

Schneiden Sie 90-Nanometer-Abschnitte mit dem Mikrotom. Nehmen Sie mehrere Abschnitte auf einem Kupfergitter auf. Färben Sie das Gitter 10 Minuten lang mit 3%igem Acetat und spülen Sie es dann dreimal mit destilliertem Wasser ab.

Färben Sie nun das Gitter zweieinhalb Minuten lang mit Bleicitrat in einer Kammer mit Natriumhydroxid-Pellets, um eine kohlendioxidfreie Umgebung zu schaffen. Nach der Inkubation dreimal mit destilliertem Wasser abspülen. Untersuchen Sie die Schnitte mit einem Elektronenmikroskop bei 80 Kilovolt und fotografieren Sie mit einer CCD-Kamera.

Um festzustellen, ob die Schnitttiefe und das Staging ordnungsgemäß durchgeführt wurden, sollte es offensichtlich sein, dass sich zwischen den beiden Kardioblasten der dorsalen Mittellinie ein reifes Herzlumen gebildet hat, um festzustellen, ob die Zellmembranen intakt sind, um das Herzlumen auf das Vorhandensein einer extrazellulären Matrix zu untersuchen und nach dem Vorhandensein von Christie und Mitochondrien zu suchen. Deshalb haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die Ultrastruktur des embryonalen Herzens der Drosophila bestimmen können. Wenn Sie dieses Verfahren ausführen.

Es ist wichtig, daran zu denken, die Drosophila-Embryonen richtig zu inszenieren und die Bestandteile des Harzes genau zu messen und gut zu mischen. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihrem Experiment.